文摘

尿毒症毒素的积累可能导致危及生命的条件“尿毒症综合症”患者晚期慢性肾脏疾病(CKD)需要肾脏替代治疗。临床评估近端肾小管分泌的有机阳离子(OC),其中一些是尿毒症毒素,是理想的,但是困难。OC分泌和细胞生物医学知识传输部分依赖于使用荧光示踪4-dimethylaminostyryl)——的研究N-methylpyridinium (ASP +),它被用在许多研究肾排泄机制的有机离子和可能的候选人作为宠物的示踪剂。本研究旨在扩大ASP +的示踪特性的知识通过记录ASP +的分布和强度的信号在活的有机体内通过荧光和正电子发射断层扫描(PET)成像和荧光信号在调查如果ASP +由白蛋白的影响。双光子在活的有机体内显微镜的男性慕尼黑纯种Fromter老鼠显示丸注入的ASP +授予血浆的荧光信号持续大约30分钟。肾近端小管,丸导致复杂的荧光模式包括一个快速和强大的瞬态信号在刷状缘,在腔内流体信号很低,一个缓慢的瞬变胞内信号。PET成像使用¹¹C-labelled ASP +显示积累在肝脏,心脏和肾脏。荧光发射光谱记录在体外ASP +孤独和白蛋白的存在同时使用1光子激发和双光子激发强烈表明,白蛋白提高排放从ASP +和诱导转变最大的排放从600到570海里。结论。肾的荧光观察从ASP +模式在活的有机体内可能是受到当地的白蛋白浓度的影响,和量化的ASP +荧光信号在活的有机体内不能直接翻译ASP +浓度。

1。介绍

有机阳离子(OCs)仅略过滤通道中肾小球由于他们的交互与白蛋白或其他等离子大分子。肾排泄的口服避孕药在很大程度上依赖于近端小管分泌的。在近端小管细胞的基底膜,有机阳离子转运蛋白2 (OCT2)介导diffusion-based吸收广泛的口服避孕药电化学梯度,在顶端膜,口服避孕药是通过分泌H⁺/阳离子交换多种药物和毒素挤压蛋白1和2 (MATE1和MATE2-K) (1,2]。交通系统远未完全理解,但数十年来一直被认为是非常有效的从血液中清除这些分子(3]。

天然OCs,列出了一些尿毒症毒素(4,5),通过自己的积累可能导致危及生命的条件称为尿毒症综合征患者的先进的慢性肾脏疾病(CKD)需要肾脏替代治疗(RRT) (6]。尽管透析技术不断提高,这些物质的积累仍CKD患者心血管死亡率的主要因素(7]。因此是有益的发展意味着评估和可能刺激肾小管分泌能力CKD患者(3]。此外,OC的近端小管系统还负责许多药物的排泄分泌(2)和肾小管排泄的性能是很重要的知识来优化药物的剂量和配方(3]。因此一个未满足的需求调查和其他工具来评估肾功能的有机阳离子的运输能力在体外和在活的有机体内实验系统和理想在人类患者,例如,通过PET成像(8]。

有机阳离子4-dimethylaminostyryl)N-methylpyridinium (ASP +)第一次被定义为一个探针肾OC运输在实验中使用停流技术在完整的大鼠肾脏9]。从那时起,ASP +提出了用于药物运输分析(10),广泛应用于各种实验设置(9- - - - - -13]。使用前在肾的研究中,ASP +被形容为活细胞的荧光探针,发射光谱显示变量根据其与不同的细胞结构(14)包括线粒体(15]。

ASP +很感兴趣是由单一刺激的OC运输之前的研究完整的肾脏使用ASP +和双光子显微镜(下午2点)老鼠的生活16]。在之前的研究中,ASP +荧光出现在管周毛细血管ASP +注射后5到15秒。ASP +荧光当时观察到基底膜的近端和远端肾小管细胞胞内荧光有着悠久的峰值减少尾巴。ASP +荧光下降慢得多远端小管细胞比近端小管细胞。此外,近端小管细胞的胞内信号强烈影响OC西咪替丁的存在,表明ASP +信号反映了OC运输能力的细胞(17]。此外,蓝移在ASP +荧光观察基底外侧膜,和transientlyat刷状缘的早期段近端小管。

我们旨在连接实验协议基于ASP +荧光协议基于ASP +作为宠物的示踪方法,这将使测量肾小管分泌功能在高空间分辨率的实验动物使用下午2点和PET成像,这与下午2点举行人体转化潜力(8]。

首先,我们复制先前的发现使用ASP +和2点的动力学荧光信号与PET扫描的组织分布和排泄动力学¹¹C-labelled ASP +。

第二,促使的观察已下午2点的实验:(我)几乎没有ASP +信号在近端小管腔的流体16](2)高强度荧光信号迅速出现在近端小管的刷状缘(3)在ASP +荧光蓝移(16]

我们测试的假设ASP +绑定白蛋白增加和blue-shifts荧光信号。

2。方法

2.1。动物和手术

2.1.1。双光子显微镜

雄性老鼠的慕尼黑纯种Fromter (MWF)应变(年龄:16个月,体重(BW) 468 - 529克, )与hypnorm麻醉(芬太尼0.315 mg / mL, VetaPharma,英国)和dormicum(咪达唑仑5毫克/毫升,老翁,英国MIDAZ210)。解决方案是由1毫升hypnorm, 1毫升dormicum, 2毫升无菌水。皮下注射0.3 mL / 100克的BW是用作感应其次是0.1毫升/ 100克BW每30 - 40分钟。

导管(PE-50 Agntho,瑞典)放置在颈外静脉,和气管造口术是促进自主呼吸。左肾被外部化和放置在一个玻璃底菜,和描述的动物布满了加热毯(16]。

2.1.2。PET扫描

雄性老鼠MWF应变(年龄:14 - 16个月,BW: 478 - 507克, )被麻醉室和5%异氟烷氧(O₂)(0.4升/分钟)和空气(1.5升/分钟)。麻醉诱导后,动物的头定位在树脂玻璃头部固定器和麻醉与锥形头部面罩安装维护持有人交付异氟烷(1.8 -2.0%)O₂(0.4升/分钟)和空气(1.5升/分钟)。经皮的导管放置在尾静脉注射¹¹C-ASP +。在实验中,加热垫是用来维持体温和呼吸频率监控。

2.2。等离子体荧光染料/ ASP +

2.2.1。体内研究

下午2点,一个股票的解决方案trans-4 -[4 -(二甲胺基)苯乙烯基]1-methylpyridinium碘(ASP + (Sigma-Aldrich # 336408 - 1 - g)是由1.2μ摩尔的ASP +磷酸盐缓冲液pH值7.4和0.8毫升的浓度的1.5毫米在其他地方做的(16]。

2.2.2。体外研究

为在体外研究中,一个股票的解决方案的ASP +由0.036624 g的ASP +溶解在500毫升Krebs-Ringer缓冲区(KRB)导致200的浓度μ米,随后被稀释。20毫米的KRB由玫瑰,135毫米氯化钠,氯化钾5毫米,0.4毫米K₂HPO₄MgSO4 1毫米,5.5毫米葡萄糖,pH值7.4。的实验中,最后一个ASP + 10的浓度μ米,除非表示不同。

2.3。放射化学

Cyclotron-produced¹¹有限公司₂或¹¹CH₄被转换为¹¹CH₃我和定向到包含前体的反应瓶(1 - 1.5毫克的ASP +在DMSO)。的反应混合物加热5分钟后100度,原油产品稀释1毫升水和净化通过卢娜C18反相高效液相色谱法(2)(5μ米, )(Phenomenex)与25%乙腈75%水不列₂阿宝₄(70毫米)为流动相(流10毫升/分钟; )。相对应的色谱分离的一部分¹¹C-ASP +收集(保留时间8 - 9分钟)(20毫升)加水稀释,并困在C18 Sep-Pak。与10毫升水,清洗后的产品筛选了1毫升乙醇紧随其后9毫升瓶盐水到最终无菌产品。

合成的放射化学纯度¹¹C-ASP +是由高效液相色谱分析使用一个终极®3000系统(Dionex) ( )连接到一个加星无线探测器(核接口)。色谱柱是卢娜5μC18 (2) 100 ( )(Phenomenex)和30%的乙腈70%的水不₂阿宝₄(70毫米)作为流动相(权力平等主义的,2.5毫升/分钟)。色谱数据分析使用Chromeleon软件(Dionex)(版本6.80)。所有产品,放射化学纯度在95%以上。

2.4。双光子在活的有机体内显微镜

体内双光子显微镜进行一个正直的创世纪4双光子显微镜(美国女士力量),20 x客观(XLUMPlanFL20XW)钠1.0,(奥林巴斯、日本),PrairieView软件,和Ti:蓝宝石激光(美国相干变色龙超II)操作在800 nm辅以手臂转换器(美国LSM科技InverterScope)允许反向成像。570和620 nm之间发射光记录使用滨松模型7422 p 40 GaAsP探测器。将帧大小 0.8像素和居住时间公关像素μ年代。像素大小 和帧时间0.22秒。

肾皮质的概述了利用管式自没有荧光染料注射自体荧光。成像的ASP +动力学,3分钟的时间序列1帧/ 0.22秒被记录。在第一次约10帧的时间序列,丸0.2毫升的ASP +股票的解决方案是在颈静脉注射使用一个自动化的输液泵(美国Harwinton卢卡技术)。为进一步分析数据导出TIFF文件。

2.5。图像处理使用ImageJ

的 - - - - - -系列使用的MATLAB实现去噪V-BM4D [17与默认设置)(“np”形象,维纳滤波、锐化deflickering,和自动噪声估计)。提高算法的执行速度在MATLAB 2018 b (MathWorks Inc .,纳蒂克,马萨诸塞州,美国),单线程执行V-BM4D被打破了并行执行 - - - - - -系列块有两个重叠的帧结束时或者在每个块的开始。块的总数等于工人在MATLAB平行池中。重叠的帧被从去噪的片段和序列组装之前储蓄。

为了弥补样品漂移领域的观点, - - - - - -系列是在斐济(18)并使用descriptor-based登记注册(2 d / 3 d + t)插件(19]剩下参数默认值保存的亮度检测(媒介)、近似检测(10 px)的大小,类型的检测(最大值)和转换模型(翻译)。

在斐济通过创建广场荧光强度测量感兴趣的区域(roi)的大小 (见图1(一))。集成在每个ROI的荧光强度 - - - - - -系列测量并存储在。csv文件,然后在棱镜进口代次课程如图1 (b)- - - - - -1 (d)。

2.6。PET扫描和图像处理

动态宠物录音使用Mediso nanoScan PET /先生(Mediso医学成像系统,布达佩斯,匈牙利)开始在注射一剂¹¹C-ASP +。宠物会话后,动物被斩首。

60分钟动态PET扫描重建,增加持续时间从10秒到5分钟(37帧)。PMOD version 3.5 (PMOD技术有限公司、苏黎世、瑞士)是用于成像分析。多个区域的利益被放置在感兴趣的器官冠状切片创建一个感兴趣的体积(VOI);因此,从心脏壁时间曲线,肾皮质,肝脏产生的个人看到和数据被表示为标准摄入值(SUV)除以组织浓度¹¹C-ASP +注射剂量/重量的动物。

2.7。在体外研究ASP +和牛血清白蛋白的影响

的影响,牛血清白蛋白(BSA)的荧光性质研究了ASP +。96孔板与ASP +和BSA溶解在KRB (300μ信用证)进行调查与1光子激发(美国女士2300年PerkinElmer Enspire)和双光子激发(Ti:蓝宝石脉冲激光与一名调查员双光子显微镜(美国女士力量))。Ti:蓝宝石激光功率是100千瓦的退出所有波长的目的。所发出的光被记录在四个波长间隔(435 - 485,500 - 550,570 - 620,和640 - 680海里)使用显微镜探测器模块(帧大小: 像素,停留时间2μs /像素)。平均信号从四个帧使用。从包含milli-Q水井水减去背景信号。

3所示。结果

3.1。ASP +进入两小管近端小管腔的通路

喷丸后,ASP +信号首先出现在肾小球毛细血管然后鲍曼空间(图2,7.8秒)。ASP +以后出现在管周毛细血管,因此必须假定为可以吸收在近端小管细胞的基底膜,其中一个信号逐渐出现。此外,微弱信号检测到管腔以及一个更加强大的信号出现在近端小管细胞的刷状缘的检测后不久的小空间(图2,11.8秒)。检查帧时间序列和视频的时间进程表明,细胞内和细胞腔的ASP +信号不同,在刷状缘出现瞬变信号沿着支架表面(brushborder)的细胞(数字2,11.8 s-14年代)。此外,小管腔出现的信号特别弱brushborder相对于信号。信号在腔和brushborder相比出现短暂的胞内信号在近端小管(图2,18.5秒)。信号仍然可以检测到在组织一些分钟后一个ASP +喷丸(图2180年代)。看到single-bolus注入的影响,背景减法的荧光信号 进行的图像如图2。很明显, ,一丸ASP +留下小残余信号组织。几注射之后,ASP +信号积累和允许的形态识别管状结构(图1(一))。记录的集成信号( 减去看到单个丸)的影响随着时间的推移在亚细胞 像素roi(图1(一))显示一个明确的ASP +信号的峰值在鲍曼空间ASP +后立即出现在肾小球毛细血管,表明过滤的ASP +(图1 (b))。同样,外表的ASP +信号管周毛细血管恰逢一个细胞内的ASP +信号的出现在近端小管(图1 (c))。过滤后的丸的ASP +出现稍晚比相邻的管周毛细血管腔。腔的信号同时出现一个非常强大的peak-shaped brushborder信号,达到最大14秒注射后小管横截面(图所示1 (c))。胞内信号出现第一次作为一个窄线沿基底一侧的近端小管,但后来发展成一个更为分散的细胞内信号。因此,细胞内信号增加缓慢,35秒后达到顶峰,减少在接下来的150秒形成更广泛的峰值比brushborder信号(图1 (d))。

3.2。¹¹C-Labelled ASP +积累在肝脏、心脏和肾脏

喷丸的¹¹C-labelled ASP +导致一个强大的积累¹¹C放射性心墙和一个明确的信号在肾皮质和肝脏明显从总结宠物图像(图3(一个))。心墙的时间曲线,肾皮质,和肝脏显示ASP +出现不可逆的积累在60分钟的录音时间(图3 (b))。

3.3。白蛋白诱导荧光发射峰的蓝移的ASP +从605纳米到570年,增加了2 p荧光信号

的最大ASP + 1光子荧光发射在605海里,并使用450 nm达到最大信号光激发(图4(一))。除了ASP +解决方案增加了BSA的荧光信号浓度的方式和诱发的发射峰转向570纳米(图4 (b))。荧光发射脉冲激光激发的操作后,从ASP +长波长通常用于在活的有机体内成像相当温和,但最大激励被认为在920纳米(图4 (c))。添加少量的BSA导致多倍的增加2 p荧光激发波长信号,但最大激励仍在920纳米(图4 (c))。然而,BSA诱导一个清晰的发射光谱蓝移,因为除了在570 - 620海里间隔,现在,还一个强烈的信号是明显的在500 - 550海里间隔(图4 (c))。

4所示。讨论

调查机制有机离子的肾脏分泌肾上收集新知识的基础分泌一些分子作为尿毒症毒素和药物。这一目标,ASP +荧光分子之前一直使用(9- - - - - -13]。除了使用ASP +在肾脏的研究中,ASP +已广泛应用,例如,确定多巴胺transporter-positive神经元在体外(20.)和5 -羟色胺转运体(泽特-)表达细胞和评估活动和泽特的监管在体外(21]。在支气管肺泡,肠道上皮细胞,ASP +也被利用来检查有机阳离子转运蛋白(22]。

在这项研究中,我们下午2点成像应用于调查肾近端小管的处理ASP +旧MWF老鼠。此外,我们应用PET成像11 c-labelled ASP +,将实验结果,下午2点成像模式适用于人体。总的来说,我们发现这两种方法的结果之间的差异,由于PET成像没有透露任何程度的排泄的注入丸11 c-labelled ASP +,而下午2点数据显示一个明确的peak-shaped时间的ASP +荧光在近端小管。随着PET成像空间分辨率低得多,这种明显的差异可以通过假设来解决ASP +瞬变出现在近端小管,但至少积累或排泄缓慢在肾皮质的其他部分,例如,远端小管如前所报道(16]。

4.1。ASP +信号显示一个复杂的模式在近端小管

我们下午2点数据以前的观测证实,ASP +被从基底外侧的近端小管16]。然而,我们的数据质疑基底外侧的ASP +是唯一的路径生成一个信号在近端小管的内腔和brushborder。事实上,我们确认的外观在PT细胞刷状缘的一个强烈的信号,这似乎是一个丸沿轴的小管。因此我们想知道ASP +注入丸的一小部分是由肾小球过滤和暂时性的吸附腔的一侧的PT。使用ROI-based定量分析,我们能够发现一个ASP +端依赖信号管腔,尽管不容易识别帧的电影。然而,如果ASP +免费在等离子体,我们期望它会容易过滤由于小分子的大小。因此我们仍然困惑,ASP +信号难以检测在近端小管的管腔,尤其是刷状缘的信号是如此强烈,如此迅速。

aminostyryl-pyridinium染料的荧光ASP +绑定是敏感脂质影响(23),但ASP +没有显示的发射光谱蓝移相比纯缓冲调查在肝微粒体的存在或人工磷脂微粒体(14),因此脂质绑定不太可能发现的基础在活的有机体内下午2点使用ASP + (16]。因为我们找不到足够的解释文学的荧光信号的复杂的时间进程和模式在近端小管的内腔和brushborder ASP +喷丸,我们考虑其他可能的解释。

在前面的研究采用2点(16),我们使用雄性老鼠的慕尼黑纯种Fromter应变,但与250 - 300 g老鼠在先前的研究中,我们的老鼠是16个月大的时候,重> 450克。因为男性MWF应变发展与年龄(蛋白尿24- - - - - -27),我们推测,这在某种程度上可能会增加腔中的ASP +信号强度以便它能被检测出来。基于这一发现我们在活的有机体内实验探测信号的小管腔和一个强大的瞬态信号的刷状缘(过滤白蛋白在哪里重吸收)和排泄的明显缺乏ASP +被PET成像,我们假设ASP +可以绑定到大分子,特别是白蛋白,这个绑定增强荧光发射。这将反过来暗示可记录的荧光信号在活的有机体内下午2点反映结合ASP +浓度和白蛋白的结合程度,这可能也有助于解决我们的宠物和下午2点数据之间的差异。

4.2。ASP +显示1 p荧光强,增强和蓝移的白蛋白的存在

属性的分析ASP +通过记录1光子激发显示ASP +激发和发射光谱是一个强烈的荧光团,在根据我们的假设,白蛋白的加入提高了信号。此外,明显蓝移的发射峰与白蛋白明显的相互作用,类似于前面的在活的有机体内观察(16]的蓝移ASP +信号探测到增加排放低于550纳米的brushborder近端小管。

4.3。ASP + 2 p荧光显示疲弱,大大增强,蓝移的白蛋白绑定

与我们的预期的ASP +适合2 p激发,我们发现免费的ASP +是一个相当弱荧光团当兴奋2 p荧光。然而,随着被1 p-excitation,白蛋白显著增加了发射信号的交互ASP +。同时,蓝移引起白蛋白绑定后看到2 p励磁(图4 (c))。

4.4。ASP +和白蛋白之间的相互作用决定了模式和时间的荧光信号在活的有机体内

ASP +绑定到白蛋白的知识提供了更强的荧光信号比ASP +孤独,我们提出以下的解释模式和时间的荧光信号在肾皮质ASP +喷丸后:(1)在血浆中,一个强烈的信号是由于白蛋白的存在,结合ASP +(2)超滤液,ASP +信号察觉在年轻的老鼠16旧MWF),但可检测大鼠在目前的研究中,由于这些老鼠松散白蛋白超滤液(24- - - - - -27](3)白蛋白滤过分数的刷状缘开往再吸收,和ASP +白蛋白复合物有望出现在较高的浓度比大部分在brushborder管状液体,这解释了brushborder迅速出现强烈的顶端信号。brushborder信号的强度曾出现下降,肾小球的距离(16),这也是符合信号取决于白蛋白,白蛋白是优先了最初的近端小管的一部分,因此,减少白蛋白可进一步小管(4)目前还不清楚如果过滤ASP +一起吸收白蛋白或可能使分离再吸收前白蛋白。再吸收后,白蛋白被运送到溶酶体破裂,但没有看到ASP +溶酶体结构的信号提醒,说明ASP +不遵循白蛋白。另一方面,荧光信号从吸收白蛋白ASP +复合物蛋白被分解时将会明显减少(5)在近端小管的基底面,ASP +信号出现与丸邻管周毛细血管。随后,一个细胞内的ASP +信号出现在近端小管细胞。这是按照ASP +被分泌和其他有机阳离子(6)自自由ASP + 2 p荧光信号相对较弱和自白蛋白不采取管基底,更持久的细胞内ASP +端依赖信号可能反映了其他蛋白质或大分子可以结合ASP +,类似于白蛋白,诱导一个增强的ASP + 2 p荧光。胞内荧光信号减少在几分钟内,这可能反映出故障的2 p-fluorescent复合物,这可能允许自由ASP +正如前面提出的分泌和支持的竞争性抑制信号还原速度的西咪替丁(16]。残余信号,导致积累的背景信号,可能导致长期绑定的ASP +细胞内蛋白质或脂质膜的影响细胞的细胞器。然而,ASP +也被证明积聚在线粒体(15),这种机制可能构成以前见过更持久的荧光ASP + mitochondria-rich远端小管的信号

5。结论

由于其与白蛋白,ASP +不太可能是一个有用的调查在活的有机体内研究上皮运输和分泌过程的有机阳离子时,还应注意从albumin-free解释数据在体外系统,因为ASP +信号不能排除被绑定到其他蛋白质的影响。进一步描述ASP +和白蛋白之间的相互作用可能更精确地指定使用ASP +的局限性和可能允许ASP +作为一个高度可视化白蛋白荧光探针在体外并有可能在活的有机体内。

数据可用性

数据可从相应的作者在合理的请求。

伦理批准

根据丹麦两个光子体内实验进行动物实验检查员牌照号码2016 0201−−−01139。据丹麦的宠物实验动物实验检查员牌照号码2017-15-0201-01242。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

作者的贡献

概念和设计是由Engbjerg雅各布·谢德,Donato Sardella, Bordoni卢卡,Steen雅各布森Jørgen Frøkiær, Giovambattista卡帕索,和塞巴斯蒂安Frische。材料制备、数据收集和分析由Engbjerg,雅各布·谢德Vincenzo Costanzo的观点,Donato Sardella,卢西亚诺·D 'Apolito Bordoni卢卡,Steen Jakobsen,塞巴斯蒂安Frische。手稿的作者是雅各的初稿Schade Engbjerg,和所有作者评论以前版本的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

作者感谢丹麦独立研究理事会(dff - 400400149),“膜”奥尔胡斯大学和Oticon Fonden(16 - 0382和17 - 3208)。LD由Programma Operativo重回Ricerca e Innovazione 2014 - 2020 (2014 it16m2op005 CCI),和洋底Sociale Europeo, Azione I.1”Dottorati Innovativi con caratterizzazione年”。作者感谢Susanne施密特克里斯坦森的技术援助在动物实验和Mogens ko巧妙制造定制的实验设备。斯坦Ledet Methmann彼得•尼尔森Aakær前链奥尔森和米氏s Gandry感谢饲养和照顾动物。Natalya Fedosova感谢帮助俄罗斯的文章。