文摘
背景。早期检测和完整切除是食道癌(EC)的重要预后因素。术中使用tumor-targeted示踪剂分子成像(IMI)是有效的在许多癌症类型。然而,没有EC-specific IMI示踪剂。我们试图测试组织蛋白酶活动示踪剂对EC切除(vgt - 309)。方法。小鼠(AKR HNM007)和人类(OE19) EC细胞系筛选组织蛋白酶表达蛋白免疫印迹。在体外绑定的亲和力vgt - 309是由荧光显微镜评估。侧面肿瘤模型是由注入EC细胞的侧翼BALB / c或无胸腺的裸体小鼠。老鼠用组织蛋白酶抑制剂预处理(JPM-OEt)被用来确认目标绑定。动物被注射2毫克/公斤vgt - 309,接受IMI,牺牲后24小时内注射。结果。组织蛋白酶B L S和X EC表达的细胞株,细胞系都是标记在体外与vgt - 309。荧光信号细胞使用JPM-OEt时就被淘汰了。biodistribution分析,vgt - 309积累在肝脏,肾脏,脾脏没有其他器官参与。vgt - 309选择性积累在侧面移植和异种移植,意味着signal-to-background比率为5.21(侧面移植差:4.18 - -6.73),4.34 (IQR: 3.75 - -5.02)旁边异种移植。荧光显微镜和组织病理学分析证实了示踪剂的选择性积累肿瘤与正常组织背景。结论。vgt - 309是一种有效的示踪IMI食道癌。有潜在的临床翻译作为兼职内窥镜检测和疾病完全删除在食管切除术。
1。介绍
食道癌是第八个全球最常见的癌症,大约450000的年度全球发病率(1]。疾病的流行病学是快速发展的;从历史上看,食管鳞状细胞癌(ESCC)是主要的组织学亚型,但出现了戏剧性的上升在食管腺癌患者的比例(EAC)。疾病负担的增长估计预测,到2030年,有100人可能患有食道癌在西方国家(2]。主导完成生存预后因子(R0)手术切除负利润。然而,大部分病人患有curative-intent切除术后复发,由于不完整的间隙疾病的索引操作(3]。
术中分子成像(IMI)开发了一个方法来提高肿瘤手术期间实现负利润的可能性。IMI涉及交付tumor-targeted光学造影剂癌细胞与wavelength-specific相机系统,检测他们在手术过程中(4]。这种方法已经应用于检测癌组织在活的有机体内以及回表评估标本指导识别tumor-positive利润率(引用)。IMI已被证明有效的许多实体肿瘤的切除包括卵巢(5)、肺(6- - - - - -8],间皮瘤[9,10),大脑11[],头部和颈部癌症12,13),但没有对食道癌(IMI示踪剂14]。因此,有一个紧迫的,未满足的需求发展的食管cancer-targeted示踪剂可以帮助外科医生切除期间检测神秘疾病。
一个有前途的酶目标家庭食道癌IMI示踪剂是半胱氨酸组织蛋白酶(15]。半胱氨酸组织蛋白酶是一类蛋白酶,建立了功能作为溶酶体降解的酶系统(16]。组织蛋白酶蛋白酶活动频繁的上下文中提供肿瘤变换,并增加组织蛋白酶表达已经证明在食管肿瘤(16]。异常活动和定位肿瘤微环境内的半胱氨酸组织蛋白酶发挥着强有力的作用在推动癌症进展,扩散,入侵和转移17]。组织蛋白酶,包括组织蛋白酶B和L,已被证明是高度在食管肿瘤中表达的18,19是有限的),但他们的表达在正常食管和胃黏膜,使他们理想的食道癌成像目标(20.]。
在这项研究中,我们评估vgt - 309, cathepsin-targeted IMI探针,术中发现食道癌。vgt - 309是一个共价灭的基于活动的调查(qABP),这意味着它成为共价结合后荧光半胱氨酸组织蛋白酶。探测器使用荧光团协调小组,可以检测到fda批准的外科成像设备在临床实践中广泛使用。在这里,我们进行了一次全面的临床前评价vgt - 309,包括EAC和ESCC的细胞和动物模型。我们发现vgt - 309选择性标记肿瘤细胞在宏观和微观两个层面以最小的背景荧光。据我们所知,这是第一个研究标签的共价qABP食道癌切除术。
2。方法
2.1。研究药物
vgt - 309 (C化学公式127年H142年ClF4N10Na3O23年代5;分子量2517.29 Da)是一个灭的基于活动的调查(qABP)由phenoxymethyl酮亲电试剂,共价和不可逆的结合活性半胱氨酸组织蛋白酶,耦合到一个协调小组荧光团(图1(一), 海里, nm)和IRDye qc 1冷却器(LI-COR生物科学、林肯、NE)。绑定后,冷却器是允许发布的近红外荧光探针(图的信号1 (b))。的半胱氨酸组织蛋白酶是vgt - 309的目标包括组织蛋白酶B, L,年代,X [21]。鉴于vgt - 309结合积极组织蛋白酶和组织蛋白酶功能细胞和细胞外地发现了肿瘤,人们认为vgt - 309细胞内外标签组织蛋白酶(22]。vgt - 309药物物质和药物产品生产符合良好生产规范LI-COR生物科学(林肯,NE)和UI制药(爱荷华州的城市,IA),分别。包含11毫克的冻干瓶vgt - 309药物产品重组与注射用水最后5毫克/毫升的浓度和稀释pH值7.4磷酸盐,巴克斯特文化媒体,或复方乳酸钠(哈特曼的)适当的应用程序。
(一)
(b)
2.2。细胞系
人类宫颈癌细胞株KB被选为一个积极的控制在我们的实验中,鉴于其先前的使用作为一个控制研究中组织蛋白酶的表达在人类肿瘤(23]。一系列人类和小鼠食管癌细胞系得到从写明ATCC或从合作者在宾夕法尼亚大学。其中包括OE19(人类食管腺癌),AKR(小鼠食管鳞状细胞癌)和HNM007(小鼠食管鳞状细胞癌)。细胞株是维护在体外使用含有RPMI的媒体,10%胎牛血清的边后卫,2更易/ L谷氨酰胺,5毫克/毫升青霉素和链霉素。细胞系是定期检验和维护为阴性支原体spp。
2.3。免疫印迹分析
准备完整的细胞蛋白质溶解产物和西方墨点法进行如前所述[24]。简单地说,全细胞蛋白质溶解产物(50μg)通过12%变性聚丙烯酰胺电泳板凝胶,和乐队的蛋白质转移到聚合物的偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国Bio-Rad大力神,CA) electroblotting。基本组织蛋白酶B抗体(圣克鲁斯生物技术产品目录号sc - 365558), L (sc - 32320), S (sc - 271619)和X (sc - 376976)被用于我们的研究。这些组织蛋白酶研究给之前的工作显示绑定这些半胱氨酸组织蛋白酶(vgt - 30921]。
2.4。利用sds - page分析Probe-Labeled的物种
评估vgt - 309个人的结合特异性半胱氨酸组织蛋白酶以及调查的活动依赖,我们进行了荧光的sds - page分析probe-labeled物种使用[描述协议之前25]。简单地说,我们与1 OE19细胞孵化μM vgt - 309细胞预处理后2小时30分钟,100年μM JPM-OEt (MedChemExpress蒙茅斯,新泽西州),pan-cathepsin抑制剂。我们细胞溶解细胞和溶菌产物加载和荧光分子量制造商在sds - page凝胶的凝胶,跑15分钟在130 V到80 V,随后染料前面跑了的凝胶。凝胶成像在《奥德赛》近红外光谱扫描仪(LI-COR生物科学、林肯、NE)和个人组织蛋白酶乐队是由分子量。控制加载平等的蛋白质,蛋白质凝胶乐队被转移到PVDF膜和探测GAPDH(圣克鲁斯生物技术)作为加载控制。
2.5。评价体外绑定和内化vgt - 309人食管癌细胞的荧光显微镜
细胞系培养在poly-L-lysine-coated玻璃盖玻片6-well板块与RPMI媒体补充10%的边后卫,谷酰胺,青霉素和链霉素为24小时。内化研究细胞治疗200海里LysoTracker(表达载体,沃尔瑟姆,MA) 2小时前孵化1μM vgt - 309。盖玻片在60分钟后从文化vgt - 309治疗。组织蛋白酶抑制实验,细胞与100年进行了30分钟的预处理μM JPM-OEt (MedChemExpress蒙茅斯,新泽西州),pan-cathepsin抑制剂。进行预处理和non-pretreated细胞培养了1μM vgt - 309 1小时。染料政府后,盖玻片是安装在玻片与DAPI延长黄金不变色试剂(费舍尔科学,沃尔瑟姆,MA)和成像在徕卡一张路易十六时期B荧光显微镜(徕卡微系统公司,位于德国)。
2.6。评价体内肿瘤标记在小动物模型
雌性BALB / c小鼠轴承侧面AKR和HNM007移植( 每个细胞株)和女性裸体轴承OE19旁边异种移植测量无胸腺的老鼠 是静脉注射剂量的vgt - 309 2毫克/公斤。消极的控制,轴承KB旁边异种移植小鼠接种50毫克/公斤JPM-OEt通过腹腔内注射每天前五天vgt - 309管理。作为一个积极的控制,管理轴承KB旁边异种移植小鼠JPM-OEt运载工具没有组织蛋白酶抑制剂通过腹腔内注射每天前五天vgt - 309管理。24小时vgt - 309注射后,小鼠安乐死与铱成像系统成像(视觉意义上说,纽约,纽约)。肿瘤被删除和奥德赛成像系统成像(LI-COR生物科学、林肯、NE)。组织部分进一步分析了苏木精和伊红染色,以及荧光显微镜(徕卡微系统公司,位于德国)。
2.7。组织病理和荧光显微镜检查的标本
标本被福尔马林固定,石蜡包埋。连续的5-μ米得到了部分,并进行了全面的病理和荧光分析在有执照的胸病理学家。部分都是使用标准的苏木精和伊红染色(圆))染色。了解vgt - 309积累模式在微观层面,另一个清白的5-μm部分评估使用近红外光谱显微扫描(LiCor奥德赛,林肯,NE)和近红外显微镜(徕卡微系统,布法罗格罗夫,IL)。荧光被相关领域)标本。
2.8。事后图像分析
事后进行了图像分析与ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij)。平均荧光强度(MFI)病变(MFI病变)获得了通过分析单色近红外光谱图像和测量感兴趣的区域相关的病变。背景荧光(保证金)0.5 - -1.0厘米也获得(MFI背景)。计算重复一式三份,signal-to-background荧光比率(SBR)使用以下方程计算( )。SBR评估平均,平均SBR > 2.0被认为是荧光。
2.9。统计数据
为在体外化验,在活的有机体内小鼠的研究中,每组至少3样本利用除非指出。事后图像分析进行量化的荧光在肿瘤的位置使用ROI软件在ImageJ (NIH;https://imagej.nih.gov/ij)。背景荧光水平同样获得,signal-to-background比率(SBR)计算。皮尔森系数colocalization荧光信号的评估使用Coloc2 ImageJ插件。结果表示为代表(SD)除非另有注明。所有的比较都是使用占据统计软件发布14 (StataCorp,大学城,TX)。一个值为0.05或更少的被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。食道癌细胞表达组织蛋白酶荧光标记的vgt - 309
研究vgt - 309的标签食道癌在细胞水平上,我们首先进行了免疫印迹分析证实组织蛋白酶表达小鼠和人食管癌细胞系在三个不同的组织病理学亚型(图2(一个))。其中包括OE19(人类食管腺癌),AKR(小鼠食管鳞状细胞癌)和HNM007(小鼠食管鳞状细胞癌)。人类宫颈癌细胞株KB被选为一个积极的控制在我们的实验中,鉴于其先前的使用作为一个控制研究中组织蛋白酶的表达在人类肿瘤(23]。评估vgt - 309个人的结合特异性半胱氨酸组织蛋白酶以及调查的活动依赖,我们用1 OE19细胞孵化μM vgt - 309细胞预处理后2小时30分钟,100年μM JPM-OEt, pan-cathepsin抑制剂。这抑制剂结合不可逆转地在半胱氨酸组织蛋白酶的活性位点,从而阻断vgt - 309的绑定。我们收集这些细胞和细胞溶解,跑的溶解产物进行sds - page凝胶检查个人组织蛋白酶的分子量。我们发现vgt - 309标记所有检查组织蛋白酶,而预处理JPM-OEt阻塞标签的组织蛋白酶、确认的高度选择性的探针(图2 (b))。
(一)
(b)
评估的本地化和国际化vgt - 309,我们拍摄生活OE19细胞染色后1小时1μvgt - 309和200 nM LysoTracker。我们发现vgt - 309自由进入细胞和反应活性半胱氨酸组织蛋白酶unquench调查。荧光信号主要是溶酶体的分布(图3(一个), )。评估组织蛋白酶活动依赖的细胞标记,我们都孵化与vgt - 309细胞系,用荧光显微镜成像在1小时。有几乎完全消除信号与JPM-OEt细胞进行预处理,表明荧光信号(图的组织蛋白酶活性依赖3 (b))。
(一)
(b)
3.2。vgt - 309在同源的荧光标签食道癌旁边的肿瘤和异种移植小鼠模型
评估的biodistribution vgt - 309,我们管理女性裸小鼠移植瘤模型无胸腺的侧面OE19异种移植测量 毫米3静脉vgt - 309剂量为2.0毫克/公斤( 老鼠)。尾静脉注射后,肿瘤和背景组织的荧光(侧侧面)记录使用视觉成像系统(图4(一))。我们进行体外器官biodistribution分析使用珍珠成像系统和24小时显示肿瘤显示强烈的荧光信号(意味着MFI: 172.4美)与荧光信号在肾脏、肝脏和脾脏符合已知的组织蛋白酶表达在这些组织和肾清除率自由探测器(数字4 (b)和4 (c))。值得注意的是,没有荧光信号在食道和胃,符合已知的有限的组织蛋白酶表达在这些组织基线(20.]。
(一)
(b)
(c)
以确定vgt - 309可以标签食道癌异种移植,雌性BALB / c小鼠轴承AKR鼠ESCC和HNM007(小鼠ESCC)侧面同种异体和女性裸小鼠移植瘤模型无胸腺的OE19人类(EAC)侧面异种移植( 每组)管理2毫克/公斤vgt - 309通过尾静脉注射。老鼠轴承KB(人类宫颈癌)异种移植作为积极的控制,这些轴承KB异种移植使用50毫克/公斤JPM-OEt通过腹腔内注射每天前五天vgt - 309作为消极的控制管理。24小时vgt - 309注射后,老鼠牺牲和铱近红外光谱成像系统的成像。输液和影像之间的24小时时间选择之前给小鼠研究评估vgt - 309成像在这个时间点(21]。
肿瘤来源于食管癌细胞系都显示强大的宏观荧光信号(图5(一个))。预处理的xenograft-bearing老鼠pan-cathepsin抑制剂几乎消除荧光信号从侧面肿瘤,表明组织蛋白酶活动依赖的荧光信号。事后分析的荧光图像,感兴趣的区域对应侧面MFI肿瘤明显高于对侧相应背景组织(图旁边的老鼠5 (b), 在所有情况下)。小额信贷机构之间没有明显差异的肿瘤和背景组织老鼠用pan-cathepsin抑制剂预处理。SBR是所有食道癌旁边肿瘤大于2.0,说明优秀的肿瘤特异性标记(图5 (c))。
(一)
(b)
(c)
分析肿瘤切除部分使用《奥德赛》近红外光谱成像系统显示vgt - 309信号是分布在整个肿瘤来源于三个食管癌细胞系(图6)。显微分析肿瘤的苏木精和伊红染色以及荧光显微镜证实vgt - 309信号在细胞水平。
4所示。讨论
在这项研究中,我们评估vgt - 309, cathepsin-targeted,淬火基于活动的近红外光谱探测,确定在切除食管癌。使用多个临床前模型,我们表明,vgt - 309可靠标签食管鳞状细胞癌和食管腺癌切除。重要的是,我们发现正常的食管和胃组织不是由vgt - 309标记,表明该示踪剂具有重要的潜在临床翻译区分癌症手术期间正常组织。据我们所知,这是第一个研究来测试一个共价基于活动的近红外光谱探针在食管癌切除术。
这项工作建立在临床前文学的一个健壮的身体评估cathepsin-targeted探测成像的实用癌症。这包括许多蜂窝系统和癌症动物模型的研究(21,26- - - - - -28]。组织蛋白酶底物探针已被证明标签食道癌在小鼠模型的两个临床前评价荧光内镜(20.,29日]。最近,包含一个红光对于组织蛋白酶底物探针荧光团,LUM015,用于图像人类乳房癌和肉瘤切除术标本(30.]。史密斯和他的同事们在体外评估相同的调查乳腺癌切除标本,也展示了其检测能力的残余癌切除蛀牙成像时(31日,32]。因为LUM015需要tracer-specific红光对于光谱成像设备来检测信号,肿瘤的渗透深度仅限于表面水平及其临床应用可能阻碍的成像设备的检测不是广泛使用。
提高肿瘤检测和深度允许兼容现有fda批准临床成像设备,最近的工作都集中在设计cathepsin-targeted探针的近红外光谱(26,33- - - - - -35]。vgt - 309是基于父探针BMV109,开发使用Cy5荧光团的细胞和动物模型27]。探测器包含相同的phenoxymethyl酮亲电试剂,共价和半胱氨酸组织蛋白酶不可逆地结合活跃,但在vgt - 309,红光对于Cy5与近红外荧光团代替协调小组(21]。使用近红外(NIR)荧光团所带来的两个主要优点:(1)大量的信号穿透深度来确定肿瘤器官表面,(2)以下的能力被fda批准,广泛使用外科成像设备。
在胸外科领域,肺癌的主要焦点的研究术中分子成像(IMI)。我们组和其他目标的能力和不属预定目标的追踪定位nonpalpable肿瘤,量化切除边缘的距离,确定同步转移,并评价前哨淋巴结等迹象(8- - - - - -10,36- - - - - -39]。已经大大减少关注的潜在应用IMI食道癌手术。术中成像使用协调小组主要被用来评估胃灌注导管和援助在前哨淋巴结识别(40]。因此,这项研究是一个重大进步fluorescence-guided手术领域的第一个演示成功使用的qABP实时指导食管癌切除术。
进行进一步的研究来验证这一技术的应用在其他临床前模型,和最终的测试将是一个人体试验充分描述的好处和局限性vgt - 309。尽管如此,有明确的临床的承诺vgt - 309期间本地化食道癌手术或内镜监测中高危患者。最终,这项技术可以提供有利于病人在减少re-resection的需要,降低局部复发的比率,和个性化辅助治疗食道癌。
数据可用性
所有数据支持这项研究的结果可以要求从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
肯尼迪博士支持的美国哲学协会和美国国立卫生研究院(批准F32 CA254210-01)。Azari博士是胸外科医师协会的支持。Singhal博士是由美国国立卫生研究院(格兰特P01CA254859)和宾夕法尼亚州卫生研究基金。