文摘
目的。(18F] F-AraG放射性标记的核苷类似物显示相对特异性激活T细胞。本研究的目的是调查的biodistribution18F] F-AraG健康志愿者和评估的初步安全与辐射剂量测定法。方法。六个健康受试者(三女三男)24岁和60岁之间的参与这项研究。每个主题收到丸静脉注射的18F] F-AraG(剂量范围:244.2 - -329.3兆贝可)之前连续四PET /先生全身扫描。定期收集血液样本和示踪剂前后生命体征监控管理。感兴趣的区域划定为多个器官,和时间曲线下的面积计算为每个器官和用于推导time-integrated活度系数(TIAC)。TIACs输入了吸收剂量和有效剂量计算使用城。结果。PET /检查先生是耐受性良好,没有不良影响的管理(18F] F-AraG指出了这项研究的参与者。表达式的biodistribution通常被反射和活动资料的酶参与(18F] F-AraG细胞聚集,线粒体激酶dGK, SAMHD1。最高的吸收观察肾脏和肝脏,而大脑、肺、骨髓、肌肉显示示踪剂摄取低。估计有效剂量(18F] F-AraG为0.0162毫西弗/兆贝可(0.0167毫西弗/兆贝可为雌性和雄性0.0157毫西弗/兆贝可)。结论。Biodistribution [18F] F-AraG在健康志愿者和其与线粒体代谢是一致的。PET /先生(18F] F-AraG成像是耐受性良好,类似于其他常用的辐射剂量学资料18F]标记示踪剂。(18F] F-AraG与线粒体生物起源和有利biodistribution特征使它一个有吸引力的示踪与各种潜在的应用。
1。介绍
细胞内核苷酸池是复杂控制,因为它们严重影响细胞的基因组稳定、增长、增殖和生存(1]。增加细胞的新陈代谢和高对核苷酸的需求转变,迅速增殖的癌细胞,是依据核苷类似物作为化疗药物的使用。使用核苷酸救助途径,核苷类似物,用于模拟天然同行,被核苷激酶磷酸化导致积累triphosphorylated核苷酸类似物。积累的核苷酸类似物影响癌细胞的生长,通过抑制核酸合成所必需的酶,导致链终止被纳入DNA (2]。一系列嘧啶和嘌呤类似物用于治疗血液恶性肿瘤和实体瘤(3]。脱氧鸟苷模拟,9 -β-D-arabinofuranosylguanine (AraG)是广泛调查对T细胞白血病细胞的选择性毒性,但可怜的溶解度阻止了其临床使用。AraG的前体药物改善溶解度,Nelarabine是fda批准的治疗患者的T细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)和T细胞淋巴细胞淋巴瘤(4]。AraG T细胞的选择性激发的发展(18F] F-AraG作为显像剂激活T细胞(5]。管理在微量,(18F] F-AraG,没有毒性,允许在活的有机体内探索的T细胞活动。激活T细胞中发挥关键作用的过程,包括host-beneficial抗肿瘤和抗病毒免疫host-damaging免疫反应和移植物抗宿主病(GvHD)和多发性硬化症。非侵入性跟踪激活T细胞可能允许评估适当的或异常的免疫功能,使及时治疗干预措施或修改。
镜像AraG的行为(6]、[18F] F-AraG,进入T细胞通过核苷转运蛋白和细胞吸收并通过主要由脱氧鸟苷磷酸化激酶(dGK) [7- - - - - -9]。dGK是病原线粒体在提供三磷酸核苷酸激酶关键线粒体DNA合成(mtDNA) [10]。遗传dGK不足导致mtDNA损耗和毁灭性的肝脑综合征(11]。的关键(18F] F-AraG可视化激活T细胞的能力在于其与线粒体生物起源介导通过线粒体dGK的作用。线粒体代谢和生物转化是紧耦合的T细胞功能(12,13]。迅速激活,T细胞进行代谢重编程和显著增加线粒体质量和mtDNA [14,15]。免疫抑制肿瘤微环境影响T细胞活化和效应功能导致肿瘤浸润T细胞线粒体功能降低和质量(16]。T细胞疲惫,有害的抗肿瘤免疫,诱导的mtDNA和与改变核苷酸生物合成相关的损失和线粒体功能障碍(17,18]。
除了dGK mtDNA维护强烈控制无菌α的活动主题和HD-domain含有蛋白1 (SAMHD1) [19]。SAMHD1,脱氧核苷三磷酸的关键调节器(核苷酸)池和著名的hiv - 1的限制能力,脱去磷酸核苷酸,限制构件用于DNA复制的数量(20.,21]。细胞对DNA合成增加需要,如增生的成纤维细胞,改变,或激活T细胞,表达下调SAMHD1,允许积累所需的核苷酸核和mtDNA合成。低表达SAMHD1 T细胞白血病细胞被发现的关键决定因素AraG三磷酸的细胞积累和顺向敏感性nelarabine治疗(22]。SAMHD1 mRNA的表达明显降低t细胞比任何其他肿瘤细胞系在癌症细胞系百科全书数据库提供了一个线索(18F] F-AraG T细胞的选择性。总的来说,精细的线粒体生物起源通过SAMHD1之间的相互作用和dGK提供了依据18F] F-AraG特异性的T细胞(8,9),这是一种罕见的代谢示踪剂的特点。
(18F] F-AraG评估在临床前模型的类风湿性关节炎,移植物抗宿主病,多发性硬化和癌症8,9,23- - - - - -25]。其效用评估反应免疫疗法是目前在多个临床试验研究。在这里,我们报告辐射剂量学数据和讨论在健康受试者biodistribution与吸收的信号特征和机制。
2。材料和方法
2.1。(18F] F-AraG合成
(18F] F-AraG是由加州大学旧金山分校放射化学设施根据经批准的印第安纳州化学制造和控制(CMC)程序。出版过程中被修改为使用Neptis宠物合成器(5]。简单地说,(18F]氟(n.c.a。) [18O)水通过QMA-carbonate墨盒,筛选了与0.55μ解决方案包含Kryptofix L的相转移催化剂222年(6毫克)和K2有限公司3(1.25毫克)1:1乙腈/水。K222年/ K (18)F复杂的被加热和干燥氮气在95°C下3分钟,紧随其后 增加乙腈和共沸流和真空蒸发下氮。后冷却至60°C,包含(1.2毫升的解决方案18F] F-AraG前体(7 - 10毫克)乙腈/ 2-methyl-2-butanol(1: 5)添加到反应堆,和解决方案是为30分钟加热到115°C。后冷却至60°C, 1.2毫升的0.5 M甲醇钠添加到反应混合物和溶液加热10分钟的100°C。反应混合物冷却到60°C, 1.7毫升1 N HCl补充说,解决方案是在100°C加热10分钟。反应混合物冷却到50°C和稀释的溶液1毫升1 N NaHCO3和2.5毫升注射用水。的解决方案是注射和纯化高效液相色谱Luna C18(2)半制备的反相柱(5μ米, 毫米)。收集所需的峰值在14至16分钟,过滤通过0.22在线μm Millex问无菌过滤器。放射化学的收益率约为4%(衰变修正合成)的合成时间90分钟。大约0.6毫升的最终产品被无菌质量控制测试。
2.2。细胞的研究
人类PBMCs从全血分离使用lymphoprep密度梯度溶液(干细胞技术)。CD8+使用CD8 T细胞纯化从PBMCs微(Miltenyi研究)。抗原递呈细胞(apc)被耗尽CD4 PBMCs隔绝+和CD8+细胞。装甲运兵车和流感脉冲肽(CEF1流感基质蛋白M1 (58 - 66) (RP19978 GenScript))在15 nM 8小时。孤立的CD8 T(负隔离)细胞cocultured(5: 1比例)与负载抗原的装甲运兵车72 h。CD8+细胞受到示踪剂摄取和流式细胞术9]。以下的抗体被用于flowcytometry: CD3单克隆抗体(UCHT1) APC-eFluor 780年eBioscience (47-0038-420), V500鼠标反CD8, BD生物科学(560774)SAMHD1兔单克隆抗体(JU56-04),重组表达载体(ma5 - 32810), Alexa萤石®647驴anti-rabbit我(406414),FITC反CD69分子抗体(310904),PE反CD279 (PD-1)抗体(367404)。
2.3。研究参与者
人类所有的主题进行了研究在加州大学旧金山分校IRB和辐射安全委员会批准的协议。知情同意是获得所有个体参与者包括在这项研究中。此外,临床安全、药物动力学和剂量学研究在食品和药物管理局(FDA)进行了探索性试验性新药123591号(临床试验登记号NCT02323893)。三男三女24岁和60岁之间的健康志愿者登记。孕妇和哺乳妇女被排除在招生。
2.4。图像采集和处理
自愿的知情同意后,每个参加主题是准备(18F] F-AraG图像采集和安全监控。每个话题收到了一丸静脉注射的18F] F-AraG(剂量范围:244.2 - -329.3兆贝可),其次是连续四个全身扫描,覆盖了顶点的midthigh正电子发射断层扫描/磁共振成像(标记PET /先生,通用电气医疗集团)。扫描的时间在每个床位置至少180秒。Dixon MRI对收购MR-based衰减校正实现宠物重建。PET成像会议期间收集血液样本1,3,5,10分钟后(18F] F-AraG注射然后在每30分钟间隔3小时后(18F] F-AraG注射血液次活动分析。
由一位经验丰富的图像进行了综述和分析核医学医师(HD)使用MIM软件版本7.1.0 (MIM软件,克利夫兰,哦,美国)。在可行的情况下,整个器官轮廓画;否则,一个感兴趣的区域(ROI) 1厘米3是在结构。血池,同样大小的ROI被集中在主动脉弓腔。意思是标准摄入值(SUV)收集所有结构四个时间点。
2.5。Biodistribution和辐射剂量测定法
重建和衰减修正全身18F] F-AraG图像连续4次获得点开始在注射的18F] F-AraG被用来量化18F辐射存在于各种器官的健康话题。活动是计算在心脏、肝脏、肠、肾脏、肺、膀胱、脑、脾的每个主题在所有四个时间点,和身体的其余部分被减去测量计算从全身器官活动活动。时间曲线下的面积计算为每个器官和用于推导time-integrated活度系数(TIAC,也称为停留时间)。TIACs然后输入吸收剂量和有效剂量计算使用城。
3所示。结果
3.1。高积累的18F] F-AraG抗原刺激T细胞与低水平的SAMHD1相关联
我们已经表明,免疫细胞表达不同程度的核苷转运蛋白和dGK影响(18F] F-AraG的吸收和保留9]。调查SAMHD1水平之间的关系,18F] F-AraG细胞积累,我们决定SAMHD1水平,激活标记PD-1 CD8和CD69,示踪剂吸收+细胞cocultured流感肽脉冲树突细胞。幼稚细胞相比,抗原刺激CD8+细胞表达SAMHD1较低,较高的PD-1和CD69的表达,增加吸收的18F] F-AraG(图1)。
(一)
(b)
(c)
3.2。人口数据和成像协议
六个科目,三女三男,都参加了这项研究。平均年龄为44.7岁(范围:24-60年),平均体重63.3公斤(范围:46.4 - -92.1公斤),和平均服用剂量307.1兆贝可(范围;(表244.2 - -329.3兆贝可)1)。参与者的心电图、血压、血细胞计数和脉搏血氧测量都是被监控的。后没有发现任何参与者临床显著变化(18F] F-AraG管理与随访24小时和1星期接受。
全身扫描获得四次点示踪剂注入后,每个扫描持续30分钟。扫描的开始时间2到4参与者之间略有不同,如表所示2。
3.3。Biodistribution
最大强度投影(MIP)和全身分布的18F] F-AraG示踪管理后不同时间点代表男性和女性参与者在图所示2(一个)。最高的吸收观察肾脏和肝脏,与著名的信号在膀胱,脉络丛,垂体,颌下、腮腺、甲状腺、心脏、胰腺(图2 (b))。大脑中观察示踪剂摄取低,肺癌、骨髓、肌肉。
(一)
(b)
(c)
放射性物质正在迅速从血液中清除(图3)。信号在心脏,唾液腺,脾脏和骨髓没有明显变化后2nd扫描posttracer注入(约45分钟),信号在肝脏继续增加。
3.4。辐射剂量学
吸收剂量估算表中列出的六个参与者3。最高的吸收剂量,0.3063和0.2370 mGy /兆贝可女性和男性受试者,分别估计的肾脏和肝脏的第二高0.0721和0.0570 mGy /兆贝可女性和男性受试者,分别。男性的睾丸和甲状腺得到最低的吸收剂量。
平均有效剂量(ED)是0.0167毫西弗/兆贝可女性和0.0157毫西弗/兆贝可为男性(范围:0.0114 - -0.0207毫西弗/兆贝可)。
4所示。讨论
(18F] F-AraG,放射性标记的AraG模拟,开发作为成像剂激活T细胞,目前正在接受调查的生物标志物对免疫疗法。在这里,我们报告一个试点研究的结果,评估biodistribution,剂量测定法,和安全18F] F-AraG六个健康的参与者。管理(18F] F-AraG被发现良好的耐受性和安全。没有副作用的研究参与者。
在一般情况下,观察到biodistribution [18F] F-AraG表达式的反射(图3(c))26),更重要的是,活动资料的酶参与细胞内积累,dGK, SAMHD1。脱氧鸟苷激酶表达起来从而显示低组织特异性(27]。dGK酶的活性,在很大程度上决定的18F] F-AraG细胞捕获,在牛的评估组织和肝脏中显示最高的和最低的大脑,心脏和胸腺的中级水平(28]。而肝脏和心脏显示显著(18F] F-AraG吸收、低信号检测胸腺和大脑。胸腺吸收低,最有可能造成纷乱的胸腺在成年人,也观察放射性标记的核苷类似物针对脱氧胞苷激酶的激酶dGK密切相关,增加表达的淋巴组织(29日]。
虽然低信号在大脑中可能暗示F-AraG无法穿过完整的血脑屏障(BBB),最近的临床研究[25)以及核苷利用率在大脑和其他研究结果并不支持这一观点。核苷转运蛋白,发现大脑血管和BBB [30.),允许进入核苷的合成新创在肝脏31日)进入脑实质,而复杂的酶机械救助途径回馈都核苷的体内平衡池所需的适当的大脑功能。功能之间的交互dGK和SAMHD1救助途径似乎特别高的意义dGTP监管水平。大脑和肝脏,由mtDNA损耗影响最大的器官造成dGK不足(11]。SAMHD1活动加剧mtDNA损耗和与之相关的病理19]。SAMHD1不足也会影响大脑,导致炎症的神经退行性疾病,Aicardi-Goutieres综合症(AGS)。考虑平衡的重要性核苷酸池,似是而非的是信号在大脑中反映出低生理大脑中脱氧鸟苷积累通过SAMHD1的活动,发现在大脑中高度表达。SAMHD1的其他组织高表达,如肌肉和骨髓,也显示低(18F] F-AraG吸收。在肝脏和肾脏,组织最高的(18F] F-AraG积累,SAMHD1蛋白质尚未检测到(32]。dGK和SAMHD1活动直接与线粒体,在一个更高的层面上,我们预期18F] F-AraG表现出类似biodistribution模式显像剂累积在线粒体,比如99 Tc-MIBI。事实上,(18F] F-AraG积累的心,甲状腺,唾液腺的相似那些器官[99 Tc-MIBI之一33]。
除了组织中线粒体的生物起源的监管功能相互作用dGK SAMHD1,观察到的信号在不同的器官也可能反映了T细胞的存在和功能状态经过或居住在那里。Tissue-resident T细胞(TRM)是一种特殊子集的长期效应记忆T细胞,血液不流通,并允许快速反应在抗原过速(34]。Tissue-resident CD8+T细胞已被描述在不同组织和在障碍组织尤为重要,它们能立即提供当地环境病原体的免疫力。此外,肿瘤浸润TRM年代表达检查站受体抑制剂如PD-1和被发现抗肿瘤免疫的关键(35),在黑色素瘤患者与生存相关(36]。T的存在和作用RM在器官显示高18F] F-AraG吸收,如唾液腺(37,38),肝脏(39,40),和肾脏41),已经好了。肝脏,有趣的是,以往被视为只在免疫耐受的背景下,正在积极调查作为淋巴器官(42)影响nonhepatic免疫反应(43和免疫治疗的结果44]。考虑到这些发现,似乎谨慎的调查(是否18F] F-AraG吸收在肝脏和其他TRM丰富的器官可能提供有用的信息来评估系统性反应T cell-modulating疗法。
估计埃德(18F] F-AraG为0.0162毫西弗/兆贝可(0.0167毫西弗/兆贝可为雌性和雄性0.0157毫西弗/兆贝可),类似于估计蒋春暄对于费马大定理等核苷示踪剂(0.0305毫西弗/兆贝可)45]和[18 f] CFA(0.0203毫西弗/兆贝可)46),以及最常用的示踪FDG(0.0199毫西弗/兆贝可)47]。一剂185兆贝可将导致3.1 mSv接触病人,一个值与6 - 7 mSv暴露为一个典型的FDG扫描和远低于30 mSv设定的限制在人类研究放射性药物研究委员会(RDRC)。肾脏接受最高的吸收剂量(关键器官),而辐射灵敏的器官,比如红骨髓,睾丸和卵巢好RDRC内定义的限制。
本研究的局限性包括少量的参与者和时间曲线的数据点。尽管参与者的数量是典型的这种类型的研究中,相对比较小的样本大小可能不代表生理积累的一个更大的人口。未来的研究将涉及更大的主题和连续成像,使基线值的综合评价。
5。结论
评价(18F] F-AraG在健康人体临床成像显示其适用性。(18F] F-AraG耐受性良好,类似于其他常用的辐射剂量学资料18F]标记示踪剂。其biodistribution是反光的18胞内积累的F] F-AraG提出的机制。(18F] F-AraG协会与线粒体生物起源和有利biodistribution特点使它具有吸引力的示踪与各种潜在的应用。
数据可用性
数据包含在研究可从相应的作者在合理的请求。
的利益冲突
CellSight技术(CST)合并是商业化18F] F-AraG。伊莲娜李维,Shahriar Yaghoubi,朱丽叶Packiasamy Lyna Huynh,和蒂娜林或受雇于CST和持有公司的股权。耶莱娜利未持有相关专利(18F] F-AraG。Faiq谢赫被春秋国旅的顾问和持有公司的股权。迪帕克Behera和香港歌CST顾问和持有股权。没有其他潜在的利益冲突与本文相关的存在。
确认
这项工作是由美国国立卫生研究院的资助NCI SBIR HHSN261201300063C (SY)和1 r01hl160688-01 (JL和y)。