文摘

背景。(18F] FEPPA有力TSPO显像剂,被发现是一个潜在的示踪成像存在炎症。为了满足需求的示踪剂临床前和临床研究,我们已经开发出一种锅自动合成简化高效液相色谱纯化的示踪剂,并用于PET成像存在的细颗粒物(PM2.5)——暴露大鼠。结果。使用这个自动合成方法,红十字青少年的18F] FEPPA是 ( ,在合成的情报 分钟从区块。放射化学纯度大于99%,和摩尔活动 GBq /μ摩尔(EOS, ),分别。的质量(18F] FEPPA合成了该方法符合美国药典(USP)的标准。稳定性试验表明,(18F] FEPPA稳定在 °C长达4小时结束后合成(EOS)。此外,microPET成像显示,示踪剂活动增加的18F] FEPPA PM2.5-exposed老鼠的大脑( )高于正常对照组( )和regional-specific。结论。使用改进的半制备高效液相色谱纯化,18F] FEPPA一直生产的高质量,高品质,高重现性,首次用于PET成像PM2.5在老鼠大脑的影响。准备用于成像炎症在各种临床或临床前研究中,尤其是对附近的宠物中心没有回旋加速器。

1。介绍

神经炎症炎症和适应性反应在中枢神经系统(CNS) [1)和疾病进展的驱动力,如阿尔茨海默病(AD) [2),重度抑郁症3,精神分裂症4),和脑损伤4]。能够激活神经病理学(5,6),小胶质细胞和星形胶质细胞被认为是主要的神经炎症过程中介质。跨膜域蛋白、转运蛋白protein-18 kDa (TSPO),是各种表达整个身体和大脑中表达较低(7- - - - - -9]。然而,TSPO水平显著增加时大脑的小胶质细胞和星形胶质细胞被激活10,11]。最近,荟萃分析的结果TSPO水平轻度认知障碍和广告协会进一步支持增加神经炎症在轻度认知障碍和广告的发展,相对于健康对照组(12]。除了中枢神经系统,增加TSPO表达中也发现了各种各样的恶性的人类细胞和组织包括大脑癌症(13,14),前列腺癌(15,16],结肠癌[17- - - - - -19],乳腺癌[20.,21),食道癌症22),子宫内膜癌(23)、卵巢癌和肝癌(24]。尽管缺乏特异性活化的小胶质细胞,TSPO水平有时反映神经炎症在活的有机体内(10]。

暴露在细颗粒物(PM2.5)与不良的神经和行为健康影响,包括增加的风险认知能力下降(广告)25,26),帕金森病(27),缺血性中风(28),和焦虑或抑郁29日,30.在流行病学研究。增加神经炎症和氧化应激已经被确认为假定的机制好PM2.5可能损害中枢神经系统功能31日,32),其中的一个例子发生在恶化和不受管制的小胶质促炎反应起着至关重要的因素参与脑损伤(33]。慢性激活的小胶质细胞(活性microgliosis)与神经损伤和神经损伤后暴露PM2.5 (34]。小胶质激活的标志之一是TSPO的过度35,36]。我们所知,TSPO成像剂的应用为研究PM2.5对人体健康的影响还没有被报道。因此,我们开发了一锅自动合成的18F] FEPPA有力TSPO显像剂,和用它来调查(1)PET成像是否能无创检测小胶质细胞激活后慢性亚急性暴露于环境PM2.5自发高血压大鼠和(2)是否有一个特定的模式后小胶质细胞激活大脑中的慢性亚急性环境PM2.5曝光。

第一个TSPO宠物配体,11C] pk - 11195合成了二十多年前(37- - - - - -39]。然而,它的效用是有限的大脑由于其低渗透、高特异性的结合,高血浆蛋白结合,短半衰期(审查,请参阅[37,38])。因此,几代18F-labelled TSPO宠物配体,包括(18F] FEPPA [40- - - - - -43]、[18F] FEDAA1106 [44,45]、[18F] dpa - 714 [46,47),(18F] PBR06 [48,49)开发(审查,请参阅[50,51])。最近,一种新型第三代TSPO宠物配体,18F] GE180开发(52- - - - - -54为TSPO成像[]和被证明是有用的53,55,56]。然而,神经影像学的应用非常有限,因为它患有大脑普及率很低,类似于(11C] pk - 11195。具体地说,在人类中,VT的18比[F] GE180低20倍11C] PRB28 [57]。在这些示踪剂,18F) - n - (2 - (2-fluoroethoxy)苄基)- n - (4-phenoxypyridin-3-yl)乙酰胺([18关于亲和力F] FEPPA)显示了出色的性能,稳定,亲油性,辐射合成[43),已被应用在一些临床前(40,58,59)和临床设置(60- - - - - -66年]。为了方便的实用性18F] FEPPA在临床前和临床研究中,必须有一个完全自动化的,简单,产量高,可靠的制造过程用于示踪剂的生产方法。因此,我们采用了威尔逊的方法(43),一些修改,完全自动化的综合有效TSPO显像剂使用TRACERlab外汇FN模块(通用电气医疗集团,密尔沃基,WI)用乙醇和水净化的高质量和高重现性。Vignal等人报道类似合成使用乙醇、水和磷酸的净化(18F] FEPPA [42]。在此我们报告(1)锅自动合成的18F] FEPPA简化高效液相色谱纯化,(2)的USP兼容的质量控制和稳定性测试18F] FEPPA, (3) microPET成像(18F] FEPPA PM2.5-exposed老鼠。

2。材料和方法

前体(N - [[2 - [2 - (((4-methylphenyl)磺酰)氧)乙氧基)苯基)甲基]- N - (4-phenoxy-3-pyridinyl)乙酰胺,TsEPPA, 1)和非放射性真实样品N - (2 - (2-fluoroethoxy)苄基)- N - (4-phenoxypyridin-3-yl)乙酰胺(FEPPA, 2)从ABX购买先进的生化药剂(Radeberg,德国)。所有其他化学品和溶剂都购买了从Sigma-Aldrich(美国密尔沃基,WI)或在穿越有机物(美国新泽西州莫里斯平原),使用前未经纯化。(18O] O2H(纯度> 98%)购买从Rotem产业(啤酒舍瓦,以色列)。水(18F]氟生产在我们的宠物跟踪回旋加速器(通用电气医疗系统,乌普萨拉,瑞典)通过18O (p, n)18F核反应。所有Sep-Pak®墨盒购买从水域Associates(米尔福德,妈,美国)。

2.1。自动辐射合成

(18F] FEPPA(2)是由自动合成通过氟化的TsEPPA与K [(1)18F] / K2.2。2其次是净化,高效液相色谱法,给18F] FEPPA(2)如前所报道(计划1)[43]。
方案1
辐射合成的18F] FEPPA (2)。

(18F] FEPPA(2)是由自动合成使用修改后的TRACERlab外汇FN模块(通用电气医疗集团,密尔沃基,WI;图1)。短暂,氟化TsEPPA与K [(1)18F] / K2.2。2在无水MeCN 20分钟给原油产品的70°C(1)(计划1)。与H稀释后2O,原油产品(1)与半制备高效液相色谱纯化(水域Xterra RP-18, 10μ米, 毫米,35%乙醇水溶液在注射用水,254 nm, 4毫升/分钟)。包含[的分数18F] FEPPA(2)收集,再形成,无菌过滤提供(2)< 10%的乙醇浓度对PM2.5的老鼠PET成像的影响。请参考补充数据辐射合成的详细步骤。


图1
修改TRACERLab外汇FN模块(18F] FEPPA(2)辐射合成。
2.2。质量控制(QC)和稳定性的测试18F] FEPPA (2)

放射化学纯度、化学纯度和2摩尔的活动进行了分析与高效液相色谱系统(安捷伦1100系列)配备Bioscan FC3300流计算辐射探测器( 针孔)和紫外检测器(254海里)使用水域Xterra列(RP-18 5μ米, 毫米)有50%的水MeCN洗脱液和1.0毫升/分钟的流量。的化学特性18证实了F] FEPPA(2)与非放射性真实FEPPA coinjection。2进一步分析了广播的放射化学杂质TLC (60 F254硅胶板,10厘米,乙酸乙酯/正己烷(3/1))和检测Raytest miniGita radio-TLC扫描仪(Raytest, Straubenhardt,德国)。请参考补充数据和图S1获取详细信息。

其他项目的质量控制测试和相应标准的2组根据美国药典(USP)放射性药物(67年),其中包括目视检查,pH值,放射性核素的半衰期,放射性核素纯洁,放射化学纯度、化学纯度,剩余K2.2。2、残留溶剂、木糖醇、过滤器完整性和无菌试验。

2的稳定性 °第一监控与薄层色谱和高效液相色谱如上所述EOS后长达4小时。

2.3。MicroPET成像(18F] FEPPA(2)注入大鼠暴露于环境细颗粒物(PM2.5)
2.3.1。动物

雄性自发性高血压大鼠(7-week-old,平均体重350克, )获得国家实验动物中心(台北,台湾),随机分为环境好点暴露组(空气动力学直径< 2.5μ米,PM2.5; )和高效微粒空气——(HEPA)过滤空气(FL, )条件组使用台北空气污染暴露系统(磁带)对健康的影响68年,69年每天24小时,每周7天,共计6个月。粗(PM2.5-10)和细(PM2.5)浓度大小构成了0.4和99.6%的全身接触系统[70年]。因此,老鼠大多是暴露PM2.5。老鼠被安置在通风笼条件下环境如我们先前的研究[68年]。实验室提供饮食和水随意在研究过程中。动物实验坚持协议制度动物保健和使用委员会(IACUC)国立台湾大学实验动物中心(ACUC没有:20160025)。

最后的接触,18F] FEPPA microPET / CT脑扫描每个老鼠进行评估神经炎症的程度。在扫描期间,老鼠被麻醉的被动吸入异氟烷的混合物进行维护感应(5%和2%)在氧气,后跟一个丸尾静脉注射 兆贝可, )(2)。老鼠的大脑传输和发射扫描获得Argus的小动物PET / CT扫描仪(SEDECAL,马德里,西班牙)。十分钟posttail静脉注射(2),静态正弦图生产了30分钟为每个感兴趣的器官。使用商业PMOD图像分析软件(PMOD技术有限责任公司,3.6版本,苏黎世瑞士)coregistration microCT图像后天生的阿特拉斯先生。大脑区域放射性浓度(兆贝可/厘米3)规范化注入活动(兆贝可)和体重(g)的器官产生放射性示踪剂结合的半定量的测量,标准摄入值(SUV) [71年]。每一个大脑区域的平均SUV(感兴趣的体积,VOI)等整个大脑,大脑额叶、顶叶、岛叶、枕叶、中脑、颞叶、海马、retrosplenial皮质颞叶和小脑进行了计算和分析。

2.4。免疫组织化学分析

PET图像采集后,所有老鼠都牺牲了。大脑组织使用一个自动处理组织处理器(Shandon精益求精、热科学、英国),嵌入在石蜡、减少厚度3 - 5μ的免疫组织化学染色(包含IHC)。电离钙结合衔接分子(Iba1)是一个macrophage-specific钙结合蛋白,参与膜波动和活化的小胶质细胞的吞噬作用。Iba1染色,大脑组织染色对激活小胶质标记Iba1(美国GeneTex、圣安东尼奥、TX) (72年]。区域的百分比被活化的小胶质细胞的细胞核染色40 x高功率场(0.26毫米/像素)在大鼠的海马区域计算使用数字幻灯片扫描仪(MoticEasyScan, Motic®,加拿大)。大脑组织检查由histopathologist蒙蔽的曝光数据。

2.5。统计分析

数据被表示为 。Wilcoxon等级和测试是用来比较不同地区PM2.5和FL老鼠的大脑。 被认为是具有统计学意义。统计分析用JMP®version 10统计软件包(SAS研究所Inc .,卡里、数控、美国)。

3所示。结果

3.1。一个锅自动合成的18F] FEPPA(2)使用修改后的外汇FN模块

在本文中,我们提出了详细的自动化生产的18F] FEPPA连同一套完整的质量控制规范和USP合规。使用这个修改后的净化方法,我们能够经常产生2外汇FN模块 收益率(区块, )在合成的时候 分钟从区块。通常,从35 GBq [18F]氟8 GBq 2在EOS产生。2的化学和放射化学纯度大于90%摩尔的活动 GBq /μ摩尔( ,EOS)和用于PET成像的PM2.5对老鼠的影响。

2的质量控制测试结果列在下表中1。此外,稳定性试验表明,2合成了这种方法在室温下稳定( °C) EOS(表后长达4小时2)。(详细的质量控制数据18F] FEPPA用我们的方法披露本补充数据所示。

表1
的质量控制测试18F] FEPPA (2)。
表2
稳定连续的三个产品的18F] FEPPA (2) ( )。
3.2。MicroPET成像(18F] FEPPA(2)注入大鼠暴露于环境细颗粒物(PM2.5)

在曝光期间PM2.5的平均质量浓度 μg / m3。困的主要化学成分粒子点组硫意味着PM2.5浓度(16.0%),(1.2%)、钾和铁(0.6%),类似于之前的接触点数据68年,70年]。没有显著改变老鼠的重量后环境PM2.5 PM2.5和FL团体之间的接触。

典型的整个大脑biodistribution [18F] FEPPA PM2.5和FL老鼠是描绘在图2。示踪剂活动增加的18F] FEPPA在选定的大脑区域是显示在表3和图3并表示为SUV的意思。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
代表图像的冠状、矢状和轴向老鼠大脑的部分暴露于环境PM2.5 (PM2.5,左面板)和过滤空气((b) FL,右面板)。
表3
MicroPET成像(18在环境PM2.5-exposed F] FEPPA (2) ( )与过滤air-exposed ( )老鼠。
(一)
(一)
(b)
(b)
图3
示踪剂分布(18海马的F] FEPPA (2) (a)和retrosplenial地区(b)的颞叶。

具体来说,显著增加(18F] FEPPA示踪活动观察颞叶的PM2.5 FL的老鼠相比,( ),尤其是在海马体(图2红色轮廓, )和retrosplenic地区(图2绿色的轮廓, )。示踪剂活动增加的趋势被发现在孤立的区域(图2靛蓝轮廓)和额叶(图中未显示)的PM2.5老鼠,但是没有达到统计学差异(表3)。

3.3。免疫组织化学染色(包含IHC)老鼠的大脑

IHC染色的海马体与Iba1染色显示区域的% 40 x高功率领域 FL组vs。 PM2.5组(图4, )。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图4
疣状(棕色原子核,红色箭头)的海马体点老鼠(a), FL老鼠(b),这两个组(c)之间的差异。

有一种趋势高等Iba1染色(棕色原子核,红色箭头)点老鼠的海马(a)相比FL组(b),但差异并不显著(染色面积 vs。 , (c))。

4所示。讨论

(18F] FEPPA有力TSPO显像剂,被发现是一个潜在的示踪成像存在炎症。为了满足需求的示踪剂临床前和临床研究,我们已经开发出一种锅自动合成简化高效液相色谱纯化示踪,当时,首次用于PET成像的PM2.5对老鼠的影响。

(18F] FEPPA(2)合成了几种方法在各种放射化学的收益率和放射化学纯度(42,43,58,73年]。最初,手动2合成亲核氟化相应的tosylate-precursor (TsEPPA, 1)与(18F氟化),其次是与高效液相色谱纯化,给2 71 ~ 85%的收益率(区块)(计划1)[43]。后,几个自动化合成2据报道[42,58,73年)(表4)。

表4
合成的18通过各种方法F] FEPPA (2)。

然而,大多数这些自动化合成使用有毒MeCN作为半制备高效液相色谱净化溶剂,因此,重构是必要的。因此,我们和其他人42)选择使用乙醇水溶液的流动相净化2高效液相色谱法。2已优化的高效液相色谱纯化条件通过水域Xterra RP-18列(10μ米, 毫米)和淋洗不同流量和不同浓度的乙醇水溶液为流动相(图S2)。虽然保留时间略长分离时使用EtOH 35%而不是40%,但由于实际考虑,包括非放射性杂质分离和容易准备流动相(图S3),35% EtOH 4毫升/分钟的流量被选为最佳净化条件2(图5)。


图5
代表半制备高效液相色谱纯化色谱(18F] FEPPA (2)。

然而,少量的18F]氟洗出液中检测到,这可能会影响宠物图像质量(74年]。因此,洗出液进一步通过Alumina-N盒和聚四氟乙烯无菌过滤器串联删除剩余(18F]氟和导致的纯粹和无菌2 收益率(区块, )在合成的时候 分钟从区块,与通过其他方法(表2合成4)。摩尔TSPO-targeting研究活动建议尽可能高所需研究针对受体。与以前发表的方法相比,我们的方法达到一个合理的和高摩尔的活动 GBq /μ摩尔,EOS ( )如表所示4。质量控制和稳定性测试证实,2合成了该方法遇到了早餐。据我们所知,我们的方法仍然是唯一解决剩余18F]氟化问题在自动化生产,以及剩余的质量控制项目18F]氟测定使用radio-TLC分析,以达到高质量的生产(18F] FEPPA临床前或临床研究。

在老鼠的PET成像显示,整个大脑(18F] FEPPA PM2.5的示踪活动大鼠明显高于他们的年龄FL老鼠。此外,大脑示踪的活动18F] FEPPA被发现regional-specific,时间的差异更加明显,岛叶。在颞叶,只有海马体和retrosplenial皮层显示统计高(18F] FEPPA活动PM2.5的老鼠相比,FL老鼠(表3,图3)。示踪剂活动增加的趋势被发现在孤立和额地区PM2.5老鼠但没有达到统计上的显著差异。

IHC染色结果表明,尽管没有一个统计上的显著差异在海马体中,增加的趋势Iba1小神经胶质细胞的染色观察PM2.5组过滤的空气组相比,这表明小胶质激活和炎症,特别是在颞叶,可能扮演了一个重要的角色在大脑的反应与交通有关的点。

总的来说,我们已经开发出一种改进的方法来自动产生18F] FEPPA高质量、高品质、高重现性,使用动物首次阐明后小胶质老鼠的大脑不同区域的变化subchronic实际接触环境PM2.5。我们的研究证实,慢性亚急性环境暴露PM2.5可能导致分散小胶质激活。特别容易受到PM2.5影响的大脑区域是颞叶,尤其是海马体和retrosplenial皮层。这些地区起着至关重要的作用,在内存中,学习,和导航,尤其是在海马体。然而,有一些局限性的啮齿动物的研究。首先,有限的样本大小可能会影响测试的总功率。手,这也表明,更大的样本量,也许更多的大脑区域会受到影响,我们做了观察增加的趋势(18F] FEPPA活动(没有达到统计学意义)的孤立和额叶区域PM2.5老鼠相比,他们的控制。第二,高血压大鼠使用在目前的实验中,一个小组可能更容易受到好点比正常血压大鼠暴露。自发性高血压大鼠选择因为心血管疾病是公认的人类神经退行性疾病发展的风险因素,因此可能更容易受到交通PM2.5曝光。第三,阻断实验使用一个非放射性FEPPA或其他非放射性TSPO配体并不是表现在当前的研究中。尽管如此,(18F] FEPPA是一种比较流行的配体,被用在许多临床前和临床研究(75年,76年),包括和不限于精神疾病(62年,77年]。各种研究也表明,(18大脑中F] FEPPA可靠结合TSPO (78年- - - - - -80年]。最后,并不是所有的大脑区域Iba1染色进行了分析。然而,增加的地区Iba1染色符合(18F] FEPPA宠物的发现。

5。结论

用这个锅自动合成和改善净化的18使用外汇F] FEPPA (2)FN模块,18F] FEPPA(2)可以产生高质量、数量和再现性。PET成像在大鼠暴露于低级PM2.5证明肺接触好点可能产生的健康影响大脑的特定区域,包括海马体。小胶质激活和炎症可以无创评估,紧随其后的是(18F] FEPPA PET成像。低级细PM2.5曝光后小胶质反应的作用需要进一步调查。的应用程序18F] FEPPA(2)为研究周边器官炎症的动物和人类的进步。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

伦理批准

动物实验坚持指南的护理和使用实验室动物和被批准的国立台湾大学实验动物中心(台北,台湾)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

高分子量,MFC, TJC YLG WSH,半胱氨酸负责研究和设计概念。TJC、高分子量和WSH负责给予支持。YYH肉干和放射性药物合成和质量控制执行。MFC做了动物实验。MFC和RFY解释microPET图像并进行数据分析。MFC和YYH写手稿的主要贡献者。半胱氨酸批判性审查和编辑知识内容的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。Ya-Yao黄、黄Wen-Sheng Chyng-Yann Shiue贡献同样这项工作。

确认

我们感激Kwanyu林女士,女士Yu-Ning Cheng Pei-Yau林先生和吴Chi-Han先生,因为他们的技术支持。这项工作由科技部支持台湾(大多数b 103 - 2314 - 002 - 040 - my3,大多数105 - 2314 - b - 075 - 060 my3和most109 - 2314 - b - 002 - 101),国立台湾大学医院(109 - s4475台大医院)。

补充材料

信息提供辐射合成和质量控制测试。(补充材料)