文摘

液是30 - 100海里,包围的囊泡含有特定的细胞蛋白,mrna,小分子核糖核酸参与细胞间细胞之间的沟通。液的可能角色甲状腺功能尚未充分探讨。在目前的研究中,FRTL-5大鼠甲状腺细胞成长为媒介融合和接收包含促甲状腺激素(TSH)、外生牛甲状腺球蛋白(巴西),或没有添加剂24或48小时之后,收集了中、超速离心法分离小泡。透射电子显微镜和免疫印迹CD9指示液的存在。免疫印迹的外来体提取使用单克隆抗体显示Tg-positive anti-Tg乐队~ 330 kDa(单体的Tg的预期大小)和更高密度TSH-treated细胞相比,在未经处理的细胞。这些结果是第一个表明正常的甲状腺细胞在文化产生包含未经碰撞的Tg液。

1。介绍

甲状腺球蛋白(Tg)运输通过甲状腺滤泡细胞进入滤泡腔(在有限程度上穿过基底膜,进入循环)包含了一系列的质膜受体和内部运输系统直接Tg分子特定细胞内和细胞外的位置1,2]。虽然内部Tg运输发生面上细胞器(如核内体和高尔基体),Tg运输在细胞外只有迄今为止被认为包含可溶性Tg的分泌细胞外领域如甲状腺滤泡腔,细胞外空间,和循环系统(1]。

几个独立的发现(3- - - - - -5]然而总的来说建议Tg也可以分泌甲状腺细胞的组成membrane-delimited囊泡(液)产生的内陷后期核内体称为多泡体(多功能车辆总线)6]。液直接从质膜与微泡在一起,芽到细胞外空间包含蛋白质,mrna和小分子核糖核酸,正越来越被视为执行重要的监管作用在正常和异常(如肿瘤)细胞(7]。没有特定的角色类型的泡在甲状腺尚未定义。

液的生产thyroid-derived细胞在最近的一项研究表明[3]显示三行甲状腺癌细胞(所有最初来自甲状腺滤泡细胞)囊泡释放液成定义良好的形态学特征的细胞环境。然而,许多肿瘤细胞可以分泌大量的液液不同的蛋白质和核酸的内容从起源的细胞类型6,8,9),因此很难得出结论从癌细胞液包含什么和他们所做的事情在正常甲状腺。然而,最近的蛋白质组学分析胎儿牛serum-derived液上市Tg的51个不同蛋白质包含在一个exosome-enriched血清的一部分,但不是在一个exosome-free分数(4]。这一发现将支持的假设thyroglobulin-containing液可以从正常的甲状腺细胞释放到健康人的血液循环。另一方面,TEM研究Risso甲状腺的海豚,大铁钳将(5],显示圆形膜结合囊泡< 100 nM大小位于甲状腺滤泡腔内充分远离上皮以免代表微绒毛可能是囊泡分泌到胶体卵泡的证据,类似于已被证明发生在卵泡(10]。

在目前的研究中我们首次展示的功能(FRTL-5)甲状腺细胞分泌Tg-containing液培养基,这表明Tg的释放液可能是一个正常的生理过程,作为替代目前的理解途径Tg分泌和处理。

2。材料和方法

2.1。FRTL-5细胞培养

FRTL-5,连续,二倍体细胞系来源于甲状腺的费舍尔老鼠和留住许多甲状腺滤泡细胞的生化标记(如TSH依赖)是从事这项研究11]。细胞生长在一个黑人组成的介质(6 h介质)的修改火腿F-12解决方案包含六个关键激素(胰岛素(10μ转铁蛋白(5 g / mL)μ0.01 g / mL)、生长抑素(μ(0.1 g / mL), glycyl-L-histidyl-L-lysine乙酸酯μg / mL),氢化可的松(0.362 ng / mL)和促甲状腺激素(TSH)(0.001国际单位/毫升))+ 5%胎牛血清,谷氨酰胺,青霉素和链霉素。中包含所有这些组件被称为6 h介质,介质和所有组件除了TSH称为5 h介质(12]。

收集液对TEM, FRTL-5细胞生长在塑料75厘米²培养瓶包含10毫升的6 h介质在37°C公司的5%₂在湿润孵化器。中每3天更换一次直到细胞达到融合,此时文化使胰蛋白酶化,分成四个烧瓶内包含6 h媒体。样品花了6小时媒体收集和储存在−80°C为以后外来体收集和TEM。

免疫印迹,支流FRTL-5文化在6、75厘米²烧瓶与哈佛商学院和接收5 h媒介洗3天,之后3文化收到一卷7毫升的5 h中,其余3收到7毫升的6 h媒介。中24小时后收集细胞使胰蛋白酶化和颗粒状。媒体和细胞颗粒样品储存在−80°C。

2.2。外来体隔离

收集所有研究纯化液中使用两个步骤的超速离心法如前所述[13]。短暂,条件培养基从FRTL-5文化,蛋白酶抑制剂鸡尾酒(完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒平板电脑,罗氏诊断)补充道,和媒介在1500转离心10分钟去除细胞碎片。当时上层清液冻结在−80°C到外来体隔离。细胞单层然后洗,使胰蛋白酶化,细胞计数与血细胞计数器测定。

孤立微泡,冷冻介质解冻和离心机17000 g×18分钟颗粒较大的细胞器和其他膜结构,其次是最后一个在200000×g离心1小时15分钟和收集的颗粒(exosomal分数)电子显微镜或蛋白质提取。一些研究,额外的颗粒和上层清液收集两个离心步骤的蛋白质测定和免疫印迹。一些免疫印迹研究外来体收集从5 h和6 h介质,分别由连续介质超速离心法收集最大化的三个烧瓶在同一离心管,增加介质的颗粒前一轮超速离心法。外来体颗粒对免疫印迹resuspended在15μL(裂解缓冲包含亮抑酶肽和phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF)和冻结在−4°C。外来体颗粒用于TEM resuspended磷酸盐。

2.3。透射电子显微镜(TEM)

约5μL的外来体样本应用电子显微镜表面科学formvar-coated carbon-stabilized 3毫米铜网格。每个样本都留在一个网格5分钟前使用多余的液体是邪恶的一块滤纸的边缘。接下来,5μL 2%水醋酸双氧铀染色电镜科学应用于网格1分钟负染色,过剩的解决方案是邪恶的,样品被允许晾干前观察。成像是使用JEOL jem - 1011透射电子显微镜和图像收集使用先进的显微镜技术XR50S-A数码相机。

2.4。sds - page及免疫印迹

外来体样本5 h和6 h细胞混合15μ9.25 L Bio-Rad 2 x Laemmli缓冲区。μ3.75 L上层清液样本混合μL NuPAGE摩门教的样品缓冲(4 x浓度)含有十二烷基硫酸锂和1.5μL NuPAGE样品的还原剂(10倍浓度)包含500毫米二硫苏糖醇(德勤)。所有样本被加热到70°C 10分钟和15μL每个样本都加载到车道的预制聚丙烯酰胺凝胶与Bio-Rad精度+ 4 - 12%的蛋白质万花筒标准(Bio-Rad实验室)。样品在凝胶被转移到PDVF膜使用干传输系统(iBlot热费希尔科学)。膜被5%的脱脂牛奶/ immuno-TRIS Tween-20 0.05%。外来体标记CD9使用兔多克隆抗体检测(系统生物科学)和一只山羊anti-rabbit免疫球蛋白抗体结合辣根过氧化物酶(合)。抗体都应用于膜溶解在10毫升的屏蔽解决方案的主要抗体应用在一夜之间大约24小时和二次抗体申请1小时。sds - page过程是由索尼娅问:Doi博士作为一个优化现有的sds - page和西方墨点法程序。积极信号检测与添加底物(SuperSignal西毫微微化学发光试剂,费舍尔科学)和图像被液晶摄像系统。随后,膜被剥夺了抗体使用缓冲区包含3 - (N-morpholino) propanesulfonic酸(拖把),β巯基乙醇和SDS。第二个免疫染色过程进行检测甲状腺球蛋白(Tg)使用Dako鼠标anti-human-Tg克隆DAK-Tg6作为主要抗体(Dako,安捷伦科技)和一匹马anti-mouse免疫球蛋白结合以合为二级抗体。这些墨迹了SuperSignal西Pico化学发光设备和成像如上所述。

3所示。结果

3.1。透射电子显微镜法

液由超速离心法收集条件FRTL-5 6 h生长培养基检查使用TEM resuspended颗粒内容固定和染色对铜网格(图1)。图像显示不同大小的球形结构主要是直径小于100纳米,符合液的大小和形状。

3.2。对甲状腺球蛋白免疫印迹

图2显示了Tg代表免疫印迹结果颗粒和上层的分数的差速离心收集6 h媒介接触FRTL-5细胞培养48 h(通道1 - 4),从新鲜5 h中含有1毫克/毫升外生牛Tg (bTg)(道5 - 8)。丸和上层清液保存后17000×g(低速)和200000×g(高速)从低速和高速离心和蛋白质(即。外来体)丸提取并受电泳样品一起的低速和高速(即。、可溶性Tg)上层清液。凝胶被transblotted和Tg进行免疫印迹免疫染色。

图清晰地显示了出现的免疫反应性的预期大小的乐队~ 330 kDa的单体的Tg在每个样本中暴露于FRTL-5细胞(通道1 - 4)。乐队的强度差异,由于上层清液之间的内在差异蛋白质浓度和颗粒提取物,下面我们将演示,因为微分Tg分割成可溶状态(上层清液)或membrane-delimited液最后离心后(颗粒)。200000×g外来体颗粒也表现出密度较低的220 kDa(图2)。

与收集FRTL-5细胞条件培养液(通道1 - 4),新鲜5 h介质1毫克/毫升bTg添加没有显示任何330 kDa免疫反应性的乐队(第5 - 8车道),确认Dako anti-human-Tg单克隆抗体用于这项研究识别老鼠但不是牛Tg(图2)。的物种特异性抗体对后续实验来检查的影响是有利外生Tg和TSH分泌FRTL-5 exosomal Tg的细胞。

为了更好地了解Tg定位成高——和low-TSH条件下液,Tg分割成颗粒和上层的分数5 h - 6 h-treated细胞如图2也检查了两个额外的研究(图3),仔细测量总蛋白。

如上所述,200000×g丸也显示了强劲的330 kDa Tg免疫反应性,并在较小的程度上在220 kDa, 6小时提取收益率乐队的密度大于相应的5 h提取物(图3)。Immunopositive Tg乐队也观察到在17000年和200000××g g浮在表面的,但这些最终颗粒的密度低于由于低浓度蛋白质加载上层的分数比颗粒分数。

确定的存在与否在这些提取液,西方墨迹的外来体标记CD9也表现(图4)。CD9免疫反应性的乐队合适的分子量(31000年和28000年的两个乐队D, resp)。观察只有200000×g颗粒和没有观察到17000年200000×g上层清液或×g颗粒。此外,结果表明,CD9的数量是大6 h样品比5 h样品(图4)。

蛋白质浓度以来exosomal丸5 h - 6 h-treated细胞之间的不同,我们规范化Tg exosomal内容(以未校准的光密度)的总蛋白质含量,使有效的比较总Tg现在在最后200000×g颗粒细胞生长的TSH(表的存在与否1)。结果显示一个约2倍大的Tg含量液从6比5 h-treated h-treated细胞细胞。这一发现表明,高Tg含量在200000×g颗粒从6 h细胞不仅可以代表更多的液从6小时暴露细胞分泌,而且选择性分区的Tg相比,这些液液收集从5 h暴露的细胞。

最近的研究表明,Tg施加一个FRTL-5自行生产细胞自身调节的影响。因此我们感兴趣的是确定是否治疗的细胞含量高的牛Tg (bTg)可以显著影响大鼠的数量Tg(轮胎式龙门吊)划分为液。

图5显示了这样一个研究的结果FRTL-5细胞受到6 h介质,bTg 5 h中含有1毫克/毫升、或5 h中只有(控制)48 h之前收集外来体介质的准备。相同体积的上层清液从17000×g离心,理论上含可溶性蛋白和微泡/ exosomal分数,产生的免疫反应性的Tg乐队~ 330 kDa显示小密度差三个治疗组(图5道8 - 10)。相同量的提取从低速球,理论上包含粒子大于液和其他高MW颗粒物,显示更可变性Tg含量比相应的小球,TSH-treated组显示2倍密度乐队比5 h组(图5道11 - 13)。

在低速球相比,相同量的提取从200000×g丸5 h-treated 6 h-treated,分别和牛Tg-treated细胞(图5道1 - 3),有较大的变异性,TSH-treated(6小时)外来体提取物表现出一个大约10倍密度大于5 h提取。有关乐队的Tg-treated外来体提取中间在其他两组之间的密度。牛Tg-treated示例还显示“漏斗式”和带失真类型与一个超载的样品中总蛋白(巷3)。与外来体分数,Tg在200000×g浮层显示更少的变化,但TSH-treated组表现出密度比其他两组Tg乐队(图5道5 - 7)。

4所示。讨论

目前的研究表明,使用透射电子显微照相和免疫印迹CD9、液产生在体外文化的thyroid-derived细胞。此外,使用单克隆抗体免疫印迹Tg表明Tg是封装在这些囊泡分泌和释放到培养基以及Tg通过传统胞外分泌。

微泡的TEM图像颗粒从条件6 h媒体一直表现出球形结构的预期exosomal大小范围内直径30到100海里。很可能这些结构液,但存在其他可能的结构在这些样本具有相似大小和形状(包括球形蛋白质总量和其他membrane-delimited囊泡结构)不能排除使用这种技术。西方墨点法对外来体标记支持在这些样品液的存在,但观察到球形结构的明确的身份将需要进一步TEM对外来体标记染色然后成像与电镜下观察。

Tg的结果表明,固液可以代表一个正常的Tg处理在甲状腺细胞的替代途径,Tg的转移从溶酶体降解的途径和生产的T₃和T₄,发布完整的细胞(1]。考虑到这一发现的新奇,还应该考虑替代简单的解释这些结果,包括不溶性的共同沉淀Tg与液液和Tg的特异性的附件。

胶体Tg是由不同的酶促反应共价连接在不同的物种形成不溶性高分子量聚合(小球)可能共沉淀的Tg液(14]。事实上获得的Tg从牛甲状腺用于这项研究包含大量分数(11%,根据制造商)的交联,不溶性Tg (15],可能占大黄色的小球的最后200000×g离心后收集从bTg-treated细胞条件培养基或新鲜培养基,1毫克/毫升外生bTg补充道。自交联的Tg成不溶性形式只发生在甲状腺滤泡(12],单层FRTL-5中会包含很少,如果有的话,不溶性老鼠Tg(轮胎式龙门吊)与液共沉淀。此外,老鼠Tg一直吸附其他蛋白质在高浓度培养介质,尤其是1毫克/毫升bTg补充道在一些研究中,然后从细胞bTg对待外来体分数(图5外来体颗粒,巷3)应该包含更大数量的330 KDa免疫反应性的轮胎式龙门吊比其他两个治疗,通过非特异性吸附与巴西和可溶性轮胎式龙门吊的共同沉淀。

先前的调查从这个实验室和其他显示抑制效应由FRTL-5细胞外源性bTg Tg生产过剩的,我们认为构成本地负面反馈系统(16]。然而,没有明确的影响,外生Tg“exosomal轮胎式龙门吊的比较可以看出Tg染色液的密度控制,TSH-treated, Tg-treated细胞图所示5。自分泌监管Tg对Tg的包装或分泌物液从而无法推断。原因上面所讨论的,然而,实验支持的假设大多数的Tg的外来体颗粒包含在囊泡,而不是连接到聚合的表面。

与外生Tg,产生影响的TSH exosomal从甲状腺细胞分泌大量的支持目前的免疫印迹结果一致表明外来体提取物接收TSH细胞免疫反应性的Tg含量高于细胞缺乏Tg。此外,我们的研究结果表明,TSH的影响可能是由于更大的内容Tg /外来体(两个)除了分泌更多的液在给定的时期。

我们当前的研究在FRTL-5液细胞单层培养不区分顶端和基底分泌囊泡。调查FRTL-5细胞极化液的文化将是重要的彻底解决这个问题。前面的识别与液膜结合囊泡的大小一致的卵泡腔的TEM研究[11)表明,至少有一部分液分泌到卵泡胶体。外来体分泌穿过基底膜,进入循环,另一方面,被观察到在许多上皮细胞类型和可能因此发生在甲状腺滤泡细胞17]。有证据表明从胎牛血清蛋白质组分析液(的边后卫)这发生4]。在这项研究中,蛋白质组学的分析exosome-enriched (EEM)和exosome-free (EFM)牛血清的分数显示,Tg一共有51个蛋白质的发现只有在额4]。这些结果提供的证据表明,exosome-enclosed Tg分泌甲状腺细胞的基底外侧方面和环流。

总之,我们已经表明,Tg分泌FRTL-5细胞在文化membrane-enclosed形式。未来的研究旨在识别机制Tg流向exosomal通路,而不是transcytotic或溶酶体通路,需要确定Tg exosomal分泌我们观察到在单层培养的大鼠甲状腺细胞发生作为一个正常的过程在活的有机体内,如果是,什么功能(s) Tg可以进行内部和外部的甲状腺。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

在透射电子显微镜研究中,制备样品后外来体提取和TEM影像进行的健康科学统一服务大学生物医学仪器中心的丹尼斯·麦克丹尼尔主任显微成像。作者还想承认帮助审查本文马可Colombini博士,化学和生物化学、马里兰大学学院公园,医学博士,美国。