文摘

抑制肿瘤血管生成封锁了血管内皮生长因子(VEGF)信号通路是一种很有前途的治疗甲状腺癌的策略。Lenvatinib甲磺酸盐(Lenvatinib)是一个强大的VEGF受体抑制剂(VEGFR1-3)和其他prooncogenic prooncogenic受体酪氨酸激酶,包括纤维母细胞生长因子受体(FGFR1-4),血小板衍生生长因子受体α(PDGFRα)、装备和后悔。我们检查lenvatinib的抗肿瘤活性与人类甲状腺癌在裸鼠异种移植模型。口头管理lenvatinib显示显著的抗肿瘤活性5分化型甲状腺癌(DTC), 5未分化甲状腺癌(ATC), 1甲状腺髓样癌(MTC)异种移植模型。Lenvatinib还显示抗血管活动对5 DTC和5 ATC异种移植,而Lenvatinib显示体外抗增殖活动只针对2的11甲状腺癌症细胞系:也就是说,RO82-W-1和TT细胞。免疫印迹分析表明,培养RO82-W-1细胞过表达FGFR1而且lenvatinib FGFR1的磷酸化,抑制其下游效应FRS2。Lenvatinib也抑制磷酸化激活的RET突变C634W TT细胞。这些数据表明lenvatinib提供抗肿瘤活性主要通过抑制血管生成抑制FGFR和RET信号通路在人类临床甲状腺癌模型。

1。介绍

甲状腺癌是一种常见的内分泌肿瘤,恶性最近增加的发病率。超过90%的甲状腺癌是滤泡或乳头状类型称为分化型甲状腺癌(DTC) (1),包括全球所有癌症的1%。百分之九十的DTC患者生存至少10年(2];然而,DTC患者放射性碘- (RAI)难治性疾病的平均生存2.5到3.5年后发现远处转移(3,4]。细胞毒性药物用于治疗RAI耐火病普遍列为只有边际效力和大量的毒性(5,6]。大约10%的甲状腺癌是甲状腺髓样癌(MTC) [7),这是一个明显的C-cell甲状腺肿瘤。矿渣MTC发生零星的(75%的患者)和遗传的设置,而后者包括三个不同的遗传性癌症综合征:家族申请者多发性内分泌瘤2型(MEN2A),和MEN2B8]。矿渣MTC与良好的预后(即相关联。,10-year survival rate, ~70%) in the case that the disease is treated at an early stage, but the prognosis is poor (i.e., 10-year survival rate, <50%) in patients with distant metastatic disease [9]。未分化甲状腺癌(ATC)仍然是人类最致命的疾病之一,但占不到2%的所有甲状腺癌(10,11]。诊断后平均生存只有4到6个月(10,12),肿瘤通常是先进的诊断。ATC一般抗肿瘤化疗,目前没有有效的治疗方案治疗ATC。

各种基因改变参与肿瘤发生甲状腺癌(13]。BRAF V600E是一种最常见的突变,发生在大约45%的乳头状甲状腺癌(ptc) [14)和26%的atc (14,15]。其他基因改变在PTC点突变在RAS (13,16和的重排17]。在滤泡性甲状腺癌(FTC), RAS突变(18,19)和PPAR的重排γ和PAX8基因(18也很普遍。在RET原癌基因的种系突变引起的遗传性矿渣MTC [20.- - - - - -22),大约有50%的零星的矿渣MTC患者体细胞RET突变(23,24]。因此,需要新的分子靶向治疗甲状腺癌的治疗。

angiogenesis-the肿瘤内血管的形成tumors-plays癌细胞生存的关键作用,局部肿瘤生长,和远处转移的发展25- - - - - -28]。众多的血管生成因素已确定,包括VEGF、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF),肝细胞生长因子,interleukin-8, PDGF。VEGF是生理和病理性血管生成的关键调节器通过其同源受体VEGFR2绑定。由于VEGF表达增加是在晚期甲状腺癌显著相关(29日),使用抑制剂对VEGFR2信号通路可能代表一个可行的方法来控制恶性甲状腺癌(30.]。VEGFR2信号通路显示抗癌活性的抑制剂对各种类型的肿瘤,因此他们中的很多人现在在临床使用31日]。在第二阶段临床试验motesanib的甲状腺癌,axitinib, pazopanib,多个受体酪氨酸激酶抑制剂,显示有前途的抗癌活性(32]。美国食品和药物管理局最近批准了索拉非尼治疗患者的局部复发或转移,进步DTC RAI治疗无效的(33]。Vandetanib [34)和cabozantinib已经被批准用于治疗晚期或转移性矿渣MTC。因此,分子靶向制剂的VEGFR2信号通路预计随着新的甲状腺癌治疗。旁边VEGFR2信号通路,其他受体酪氨酸激酶(rtk)在甲状腺癌有明显的作用。过度的纤维母细胞生长因子受体(35)和RET突变(23,24)据报道,参与开发和表型的甲状腺癌。鉴于大多数针对多个受体VEGFR2抑制剂,抑制rtk可以提高甲状腺癌的治疗除了针对VEGFR2信号通路。

Lenvatinib甲磺酸盐(Lenvatinib)抑制多个目标的rtk VEGF受体(VEGFR1-3), FGF受体(FGFR1-4), PDGF受体α(PDGFRα)、装备和RET [36]。除了基于VEGFR2抑制其抗血管活性(36],lenvatinib还显示基于抑制抗肿瘤活性RET磷酸化在PTC携带RET / PCT融合基因(37]。Lenvatinib显示抗癌活性与多种肿瘤类型,如DTC,申请者黑色素瘤、子宫内膜癌和肝细胞(38,39]。本研究的目的是评估抗肿瘤活性lenvatinib并探索其作用方式在人类甲状腺癌临床前模型,利用直接转矩、申请者和ATC细胞系。在这里,我们描述如何lenvatinib抑制体内肿瘤的生长和肿瘤导致血管生成在不同的人类甲状腺癌异种移植模型。我们还表明,lenvatinib直接抑制甲状腺癌症细胞系的体外增殖携带突变激活RET FGFR1的或过表达。

2。材料和方法

2.1。化合物

Lenvatinib甲磺酸盐(Lenvatinib) PD166866 PD173074,伊马替尼,在卫材和Ki6783合成有限公司。(日本茨城县)。索拉非尼是购买从拜耳公司(日本东京)。

2.2。免费细胞激酶抑制试验

lenvatinib激酶抑制活性和索拉非尼对66纯化重组蛋白激酶(包括酪氨酸激酶和丝氨酸苏氨酸激酶)检查用ELISA和片外流动试验(MSA)从Carna生物科学转变,Inc .(神户,日本)。简而言之,每个测试化合物与酶混合,衬底,ATP, Mg ELISA和MSA在适当的缓冲条件下。反应控制的读出值(完整的反应混合物)设置为0%,抑制和读出值的背景(酶(−))被设置为100%的抑制;每个测试解决方案的抑制百分比计算。集成电路₅₀计算值(半抑制浓度最大)的浓度与%抑制曲线。

2.3。细胞

人类DTC细胞系K1, ftc - 133, ftc - 236, ftc - 238和RO82-W-1人类甲状腺滤泡上皮细胞系Nthy-ori 3:1获得从DS医药生物有限公司,有限公司(日本大阪)。人类从美国获得了矿渣MTC细胞系TT型文化集合(弗吉尼亚州马纳萨斯)。人类的ATC细胞系8305 c, 8505 c, HTC / C3, KHM-5M, TCO-1从日本获得收集研究生物细胞库(日本大阪)。K1和RO82-W-1细胞培养在杜尔贝科的混合物的修改鹰介质(DMEM),火腿的F12培养基和MCDB 105培养基(2:1:1,v / v / v)与10%的边后卫;ftc - 133, ftc - 236, ftc - 238细胞在DMEM和火腿的混合培养的F12培养基(1:1,v / v)与10%的边后卫,Nthy-ori rpmi - 1640年3 - 1细胞培养中有10%的边后卫,TT在rpmi - 1640细胞培养中有15%的边后卫,TCO-1细胞在DMEM培养10% FCS, 8305 c, 8505 c在鹰的最小基本培养基培养细胞(EMEM)补充10%的边后卫。rpmi - 1640年KHM-5M细胞培养中有15%的边后卫。HTC / C3细胞在DMEM培养补充4500 mg / L葡萄糖和10%的边后卫。所有细胞种植有限公司5%₂和37°C。DMEM EMEM,火腿的F12培养基,rpmi - 1640介质和光(日本大阪)购买kouichi。MCDB 105培养基从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州)。

2.4。动物

裸小鼠(在校园里。Cg-Foxn1nu / CrlCrlj,女,5 - 6周大)从查尔斯河实验室获得日本(日本神奈川)。老鼠保持特定的无菌条件下和安置在屏障设施在12 h光/暗周期,提供食物和水随意。所有程序使用实验动物都是按照所有适用的制度和政府监管工作的方针、政策和执行在动物设施认证中心认证的实验室动物的日本健康科学的基础。

2.5。人类甲状腺癌异种移植模型

肿瘤细胞培养在适当的文化媒介。细胞收获了0.05%或0.25% (w / v)胰蛋白酶/ EDTA和暂停50% (v / v) BD基底膜基质(BD生物科学,圣何塞,CA)的混合文化媒介的密度5 - 10×10⁷细胞/毫升。然后,0.1 - -0.2毫升的细胞悬液接种皮下注射的右翼地区每一个鼠标。当肿瘤体积达到100至300毫米³,老鼠选择根据他们的肿瘤体积、肿瘤形状、物理条件,和身体重量被随机分成每个治疗组:车辆,lenvatinib, PD173074或索拉非尼(每组)。Lenvatinib PD173074,索拉非尼在无菌蒸馏水溶解,无菌蒸馏水包含克分子数相等的盐酸,和蒸馏水中含有12.5% (v / v)乙醇和12.5% (v / v) Cremophor EL,分别口服每日一次。肿瘤大小是使用卡尺测量的两个维度,和体积计算使用公式:肿瘤体积(毫米³)= 1/2长度(毫米)×(宽度(毫米))²。治疗组肿瘤体积的变化相对于对照组按照下列公式计算:,在那里和肿瘤体积的变化(即。,growth) for the treated and vehicle control group, respectively. The percentage of tumor growth inhibition (%TGI) was calculated from the formula:。

2.6。定量rt - pcr

细胞(5×10⁶被播种和培养6-well文化板块。后一夜之间文化,从培养细胞总RNA孤立使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的协议。与纯化RNA逆转录进行了通过使用一个高容量cDNA逆转录工具包(生活技术,卡尔斯巴德,CA)。合成互补dna作为模板用于定量聚合酶链反应(PCR)检测使用TaqMan普遍PCR反应混合液(技术),AmpErase)(技术)和TaqMan调查(FGFR1(Hs 00241111),FGFR2(Hs 01552926),FGFR3(Hs 00179829),FGFR4(Hs 00242558),VEGFR1(Hs 01904119),VEGFR2(Hs 00176676),VEGFR3(Hs 01047687),工具包(Hs 00174029),表皮生长因子受体(Hs 00193306),PDGFRA(Hs 00183486),PDGFRB(Hs 00182163),见过(Hs 01565580),受潮湿腐烂(Hs 01120032),18 s rRNA(Hs 99999901)](生活技术,卡尔斯巴德,CA) 7900年ABI PCR系统(技术)。标准曲线是用来确定PCR效率。循环阈值(Ct)值是由使用SDS软件(技术)。相对基因表达是规范化的看家基因(18 s rRNA)。

2.7。质粒构建

人类全身KIF5B-RET基因(37)是化学合成了GenScript corp .)(皮斯卡塔韦,新泽西),然后放大使用一套引物聚合酶链反应(PCR)包含attB重组序列。输入向量的网关克隆系统(技术)生成通过BP Clonase使用PCR产品和质粒pDONR221反应。表达向量pCLxIP KIF5B-RET每个条目之间通过LR Clonase反应生成向量和目标向量pCLxIP-DEST [37]。表达向量KIF5B-RET M918T生成通过引入一个点突变pCLxIP KIF5B-RET表达载体。

2.8。免疫印迹分析

细胞(1×10⁵3×10⁶)被播种和培养在6-well subconfluency, 100毫米,150毫米细胞培养板在一夜之间适当的文化媒介。RO82-W-1细胞细胞溶解在缓冲区里帕(50毫米玫瑰(pH值7.4),氯化钠150毫米,1.5毫米MgCl₂,10% (v / v)甘油,1% (v / v)特里同x - 100, EDTA-free蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏,曼海姆,德国),磷酸酶抑制剂鸡尾酒2 (Sigma-Aldrich),磷酸酶抑制剂鸡尾酒3 (Sigma-Aldrich))。TT细胞细胞溶解在裂解缓冲(50毫米玫瑰(pH值7.4),150毫米氯化钠,MgCl 1毫米₂,10% (v / v)甘油,1% (v / v)特里同x - 100, 1毫米EDTA (pH值8.0),100毫米氟化钠、氟化1毫米phenylmethylsulfonyl, 1毫米原钒酸钠,10μ50 g / mL抑肽酶,μg / mL亮抑酶肽,1μg / mL抑肽素A)。RO82-W-1细胞被饿死在培养基含有0.5% (w / v)牛血清白蛋白(BSA),对待PD173074, lenvatinib或索拉非尼表示浓度为1 h,然后刺激与bFGF 10分钟(20 ng / mL;研发系统、明尼阿波利斯、MN)和肝素(Sigma-Aldrich)细胞溶解。培养TT细胞治疗与lenvatinib 1 h表示浓度细胞溶解。Nthy-ori 3 - 1细胞转染KIF5B-RET——或KIF5B-RET M918T-expressing质粒通过使用X-tremeGENE9(罗氏诊断K·K。日本东京)。第二天,转染细胞治疗lenvatinib 1 h细胞溶解。从RO82-W-1细胞溶解产物免疫沉淀反应的anti-FGFR1单克隆抗体(WH0002260M3 [5 e9], Sigma-Aldrich)。裸小鼠轴承RO82-W-1或TT异种移植治疗一次口头与车辆或lenvatinib为10、30和100毫克/公斤。裸小鼠轴承RO82-W-1也用索拉非尼治疗在100毫克/公斤。收集肿瘤2 h后政府RO82-W-1异种移植和2,8日,12日和政府TT异种移植后24 h,然后被细胞溶解里帕缓冲区或裂解缓冲,分别。细胞溶解RO82-W-1异种移植治疗lenvatinib 30和100毫克/公斤,索拉非尼与一个anti-FRS2——免疫沉淀反应α多克隆抗体(FRS2 AF4069;研发系统)。免疫沉淀反应样品和细胞溶解样品(20 - 30μ在10克的蛋白质μL)电泳在5% -20%或4% -20%聚丙烯酰胺凝胶(RET检测)。分离蛋白质被转移到PVDF膜(微孔,贝德福德,MA)或Hybond-P(通用电气医疗集团生命科学,乌普萨拉,瑞典)和膜孵化与以下主要抗体:FGFR1 (ab76464;abcam、剑桥、马),FGFR1 (# 3472;细胞信号,贝弗利,MA)免疫沉淀物样本,FGFR2 (MAB6842;研发系统),FGFR3 (# 4574;细胞信号),FGFR4 (sc - 136988;圣克鲁斯、达拉斯、TX)、phospho-FGFR1 (sc - 30262 - r;Santa Cruz), FRS2 -α(FRS2, sc - 8318;圣克鲁斯)细胞溶解产物,FRS2 -α(FRS2 AF4069;研发系统)对肿瘤组织溶解产物,phospho-FRS2 -α[Thr196] (phospho-FRS2 # 3864;细胞信号),RET (sc - 1290;Sigma-Aldrich), phospho-RET(# 3221,细胞信号),MEK1/2(# 9122,细胞信号),phospho-MEK [Ser217/221](# 9121,细胞信号),ERK1/2(# 9102,细胞信号),和phospho-ERK1/2(# 9101,细胞信号)。墨迹被发现与发射极耦合逻辑主要免疫印迹检测系统(通用电气医疗集团生命科学)或SuperSignal增强化学发光试剂盒(皮尔斯,罗克福德,IL)。免疫反应性的乐队是由使用一个可视化las - 4000发光图像分析仪(富士胶片、东京、日本),图像主(通用电气医疗集团生命科学),或化学Doc XRS (BioRad大力神,CA)。

2.9。抗试验

细胞(1000 - 3000)被播种和96年培养文化板块。一夜之间文化后,细胞被孵化与各种化合物的浓度为3天(TT细胞10天)。细胞数量取决于使用WST-8 (Dojindo、熊本、日本);10μL WST-8被添加到每个好,吸光度测量的波长450 nm并与参考测量在660或665海里使用mtp - 500标(电晕电、茨城、日本)或一个设想Multilabel读者(珀金埃尔默,图尔库,芬兰)。集成电路₅₀是图形得到的剂量反应曲线。

2.10。免疫组织化学分析

从裸体小鼠切除肿瘤组织,嵌入在最佳切削温度(10月)化合物(樱花Finetek日本,东京,日本),冷冻干燥ice-acetone,然后切割(8μm),或者他们是嵌入在石蜡,固定在免疫组织化学(包含IHC)锌固定剂(BD生物科学),然后分段(6μ米)。肿瘤微血管被间接immunoperoxidase染色方法与一只老鼠anti-mouse CD31单克隆抗体(克隆MEC13.3, BD生物科学),然后利用Vectastain可视化ABC (Dako、东京、日本)。周皮细胞被间接的碱性磷酸酶染色方法与一个反α平滑肌肌动蛋白(SMA)抗体结合碱性磷酸酶(5691年,Sigma-Aldrich)和可视化通过使用简单的染色美联社(R) (Nichirei生物科学公司,东京,日本)。相邻的部分与Hematoxylin-Eosin染色。微血管密度(MVD)决心像前面描述的那样40]。每个部分被使用扫描显微镜(VANOX AHBS3,奥林巴斯,东京,日本)低倍镜下鉴定5微血管CD31-stained密度最高的区域。所选地区的微血管数在400 x放大。MVD是记录为每毫米的微血管数量²。DTC异种移植,微血管pericyte-covered的比例进行了分析。Pericyte-covered船只通过检查colocalization CD31 -(内皮细胞)的积极的船只和αSMA -(周)阳性细胞。pericyte-covered船只的数量相比,在选择区域,然后计算的总数CD31-stained微血管在同一地区。微血管pericyte-covered的百分比计算的微血管pericyte-covered /微血管数量×100年选中的区域。ATC的MVD异种移植模型是由使用数字病理系统ScanScope XT (Aperio, Vista, CA)。短暂,CD31-stained整个组织切片进行扫描ScanScope系统(Aperio)来生成高分辨率数字幻灯片。通过使用数字幻灯片,Aperio透视仪(v10.0.36.1805 Aperio), 5个感兴趣的区域(roi:每个500μ平方)手动选为密度最高的地区CD31-stained每个肿瘤切片微血管。微血管的数量在每个投资回报率是衡量使用微脉管分析算法v1.0 (Aperio),自动检测和量化幻灯片沾上微血管内皮标记。MVD表达为每毫米的微血管数量²。5的平均MVD roi被定义为肿瘤MVD。微脉管抑制的百分比(%本)计算的微血管密度(MVD)按照下列公式:[(1−肿瘤MVD在每个compound-treated动物/意味着肿瘤MVD的车辆control-treated集团)×100]。

2.11。基因突变分析

细胞(2×10⁶被播种和培养6-well文化板块。一夜之间文化后,基因组DNA分离培养的细胞(K1、RO82-W-1 ftc - 133, ftc - 236和ftc - 238)通过使用DNeasy血液和组织工具包(试剂盒)。突变分析443基因突变在32ABL1,AKT1,AKT2,APC,BRAF,到,CDKN2A,CSF1R,CTNNB1,表皮生长因子受体,FGFR1,FGFR3,FLT3,极品,JAK2,JAK3,工具包,喀斯特,见过,一种,国家管制当局方面,P53,PDGFRA,PIK3CA,PTEN,RB1,受潮湿腐烂,SRC,STK11,VH1)是由使用MassARRAY系统(Sequenom,圣地亚哥,CA) OncoCarta面板版本1.0和3.0。

2.12。统计分析

统计分析都是由使用GraphPad Prism 6.0软件(GraphPad软件公司,拉霍亚,CA)。车辆之间的差异的重要性和治疗组在抗肿瘤和抗血管活动在人类肿瘤异种移植模型是由使用Dunnett的多重比较检验。结果被认为是重要的。分析抗肿瘤活性之间的关系(%家)和antivascular活动(%本),平均%家和%本值绘制- - -分别相互重合。协方差分析(ANCOVA) %家被使用%本作为协变量检查。

3所示。结果

3.1。抗肿瘤活性Lenvatinib人类甲状腺癌在裸鼠异种移植模型

我们检查了抗肿瘤活性lenvatinib 11人甲状腺癌异种移植模型3的组织学类型,如DTC、矿渣MTC, ATC。五DTC细胞系[1 (K1)和乳头状甲状腺癌行4滤泡性甲状腺癌细胞系(RO82-W-1, ftc - 133, ftc - 236和ftc - 238)], 1矿渣MTC细胞系(TT)和5 ATC细胞系(8305 c, 8505 c, TCO-1、KHM-5M和HTC / C3)检查。肿瘤细胞皮下接种到裸鼠的后侧面地区。肿瘤被允许长到100至300毫米的大小³与lenvatinib每日口服治疗开始前14天(TT细胞治疗29天)。治疗期间lenvatinib,没有宏观变化或失去体重观察(数据没有显示)。Lenvatinib显示显著的抗肿瘤活性在30和100毫克/公斤5 DTC异种移植模型和在较低剂量(1、3和10毫克/公斤)K1和RO82-W-1异种移植模型(图1(一),补充图S1 (a)在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/638747)。Lenvatinib也表现出显著的抗肿瘤活性剂量的所有5 ATC异种移植模型(图10和100毫克/公斤1 (b)、补充图S1 (b))。此外,lenvatinib抑制体内肿瘤生长的TT异种移植在10方式存在剂量依赖的相关性,30和100毫克/公斤,导致肿瘤收缩在100毫克/公斤(图1 (c)、补充图S1 (c))。这些结果说明lenvatinib显示了显著的抗肿瘤活性的11人甲状腺癌异种移植模型与不同组织学的甲状腺癌。

3.2。抗血管Lenvatinib活动在人类甲状腺癌在裸鼠异种移植模型

lenvatinib抗血管活动的评估通过使用相同的11人甲状腺癌异种移植模型,研究了抗肿瘤活性。免疫组织化学分析肿瘤组织切除第二天从裸小鼠移植肿瘤异种移植上届政府后,接受的剂量lenvatinib 10或100毫克/公斤。肿瘤微血管与抗体免疫组织化学染色对内皮细胞CD31标志,并分析了肿瘤组织中MVD(图2)。MVD显著减少4的5 DTC异种移植治疗lenvatinib 10毫克/公斤,在所有的5 DTC异种移植接受lenvatinib 100毫克/公斤。人类的MVDs矿渣MTC TT异种移植与车辆的最低治疗11例甲状腺癌异种移植模型中测试,和lenvatinib没有减少MVDs TT异种移植。所有5中的MVDs ATC异种移植模型显著降低lenvatinib治疗10和100毫克/公斤。这些结果说明lenvatinib显示抗血管活动几乎所有DTC和ATC模型而不是矿渣MTC。这也许可以解释抗血管活动lenvatinib的抗肿瘤的作用机制活动图中观察到1。然而,另一个机制也可能导致的抗肿瘤活性lenvatinib反对人类的矿渣MTC TT模型,因为lenvatinib没有减少MVD在这个模型。

我们进行了免疫组织化学分析5 DTC异种移植模型中通过染色的周和内皮细胞反α分别SMA抗体和anti-CD31抗体(补充图S2),因为据报道,VEGF信号抑制剂治疗增加协会的周与内皮细胞(外膜细胞覆盖),事件相关的电阻(41]。周皮细胞覆盖率K1和RO82-W1细胞的百分比低于其他3 DTC细胞类型(补充图S3)。有趣的是,K1和RO82-W-1也MVDs(> 200 /毫米高³)比其他3 DTC细胞系(< 200 /毫米³(图)在5 DTC异种移植模型2)。Lenvatinib显示显著的抗肿瘤活性的K1和RO82-W-1模型低剂量的1到10毫克/公斤。这些血管参数(低周皮细胞覆盖和高MVD)的抗肿瘤活性lenvatinib表明lenvatinib的抗血管活动背后的作用机制的抗肿瘤效应lenvatinib在这些模型。

3.3。抗增殖活动Lenvatinib对人体甲状腺癌体外细胞系

我们检查的抗增殖活动lenvatinib对11人甲状腺癌细胞系,以确定RTK信号通路在人类甲状腺癌症细胞系的体外增殖。抗增殖活动lenvatinib被评估使用集成电路₅₀价值观和IC的比率₅₀值的甲状腺癌症细胞系相对于Nthy-ori(表3 - 1细胞1)。Lenvatinib没有显示有效的体外抗增殖活动9 11细胞系IC₅₀值大于10μ(补充图S4)。Lenvatinib,然而,显示抗增殖活动对人类的DTC RO82-W-1和MTC TT细胞系,与集成电路₅₀3.8和0.078的值μM,分别;此外,它是有选择性的对这两个DTC细胞系与正常甲状腺细胞(和0.01,分别地)。这些数据表明,RTK在致癌信号通路可能角色这两个人类甲状腺癌细胞扩散。

3.4。抗增殖活性选择性受体酪氨酸激酶抑制剂对人类的DTC细胞株体外

调查,RTK信号通路参与RO82-W-1细胞的增殖,我们测试了选择性RTK抑制剂的活性(42- - - - - -46)针对VEGFR(索拉非尼),FGFR (PD166866和PD173074),设备(伊马替尼),和PDGFR (Ki6783) 5 DTC细胞系包括RO82-W-1(表2),因为lenvatinib抑制这些rtk在IC₅₀的值小于100纳米(补充表S1)和RO82-W-1细胞的信使rna表达一些rtk(补充图S5)。每个RTK抑制剂的抑制活性变化与正常甲状腺细胞(Nthy-ori 3 - 1)。我们首先决定了集成电路₅₀值对甲状腺癌症细胞系和Nthy-ori 3 - 1,然后,我们比较了IC的比率₅₀肿瘤细胞和正常细胞之间的值(例如,)。在5 DTC细胞系,RO82-W-1细胞系表现出选择性的敏感性FGFR抑制剂(PD166866和PD173074)。没有任何细胞系表现出选择性敏感的RTK抑制剂研究除了PD166866, PD173074, lenvatinib反对RO82-W-1细胞;因此,lenvatinib可能目标FGFR信号通路抑制RO82-W-1细胞的增殖。

3.5。上的选择性FGFR激酶抑制剂PD173074 FGFR人类DTC RO82-W-1细胞信号通路

我们的数据表明FGFR信号通路的作用RO82-W-1体外增殖的细胞。因此,我们进行了免疫印迹分析检查是否在RO82-W-1 FGFR1-4是调节细胞的表达水平与正常甲状腺细胞(图3(一个)),因为定量rt - pcr显示超表达的一些FGFRs(补充图S5)。在4 FGFRs FGFR1的表达在RO82-W-1调节细胞与正常甲状腺细胞相比,而FGFR2 FGFR3蛋白表达下调。FGFR4蛋白表达在RO82-W-1和正常甲状腺细胞相似的水平。接下来,我们检查是否PD173074,选择性FGFR激酶抑制剂,影响FGFR1-mediated RO82-W-1细胞信号通路在体外通过执行免疫印迹分析评估FGFR1的磷酸化状态及其下游效应器(即。,FRS2 MEK和ERK)(图3 (b))。PD173074 bFGF-induced磷酸化的抑制FGFR1、FRS2 MEK, ERK浓度的方式,这表明FGFR1信号通路在RO82-W-1细胞系很活跃。评估的作用FGFR信号的肿瘤发生RO82-W-1细胞系,我们检查了PD173074的抗肿瘤效果的体内肿瘤生长RO82-W-1异种移植在裸小鼠(图3 (c))。每日口服PD173074 14天导致显著的抗肿瘤活性的RO82-W-1异种移植模型。这些结果表明,FGFR1信号通路参与肿瘤发生的人类DTC RO82-W-1细胞系。

3.6。Lenvatinib对FGFR1的影响信号通路在人类DTC RO82-W-1模型

我们检查是否lenvatinib抑制FGFR1 RO82-W-1细胞信号通路在体外通过执行免疫印迹分析评估FGFR1的磷酸化状态及其下游效应器(图4)。Lenvatinib抑制FGFR1的磷酸化和FRS2, MEK,兵,浓度的方式类似的浓度,它显示抗增殖活动(3μ米)。Lenvatinib-induced磷酸化的抑制FRS2也检测到的band-shift FRS2体外。我们还研究了索拉非尼是否影响了FGFR1 WO82-W-1细胞信号通路作为参考。另一个目标激酶抑制剂索拉非尼目标装备,flt3, RAF1, RET, VEGFR1-3和PDGFR据报道,但不抑制FGFR信号通路。索拉非尼弱抑制磷酸化MEK的10μ米,但没有明显抑制FGFR1的磷酸化或其其他下游效应器,即使使用的浓度足以RO82-W-1细胞产生抗增殖效果,IC₅₀价值4.2μM(表2)。我们还测试了是否lenvatinib抑制磷酸化的FRS2 RO82-W-1异种移植于裸小鼠(补充图S6)。两小时后管理lenvatinib 3, 10日,30日或100毫克/公斤,FRS2的磷酸化是减少RO82-W-1异种移植。不过,我们不可能发现一个明确的磷酸化的减少FRS2连同乐队转变与索拉非尼治疗100毫克/公斤。这些数据表明lenvatinib FGFR信号通路的抑制体外和体内和建议的抗肿瘤效应lenvatinib反对RO82-W-1异种移植是通过抑制FGFR信号衰减的癌症细胞,除了抗血管新生活动通过VEGFR2信号的抑制内皮细胞。我们还研究了索拉非尼的活动RO82-W-1 DTC模型在体外和体内。索拉非尼没有抑制FGFR1的磷酸化RO82-W-1细胞体外即使在浓度(表产生抗增殖活动2和图4)。口服服用索拉非尼抑制肿瘤生长的RO82-W-1在裸鼠异种移植剂量30至300毫克/公斤(补充图S7)。lenvatinib的最高剂量(100毫克/公斤)相比与索拉非尼(300毫克/公斤),lenvatinib显示显著的抗肿瘤活性与肿瘤生长的RO82-W-1异种移植于裸小鼠(补充图S7)。当我们为每个治疗与抗肿瘤抗血管活动活动相比,我们发现lenvatinib显示更强的抗肿瘤活性(肿瘤生长抑制的百分比,%家)比索拉非尼在两个治疗规范化为血管生成抑制由减少MVD(微脉管抑制百分比,%本)(补充图S7)。这些结果表明lenvatinib一些额外的活动,除了抗血管生成的影响,可能导致更有效的抗肿瘤活性在RO82-W-1异种移植模型。

3.7。Lenvatinib对激活RET人类矿渣MTC TT细胞信号通路

Lenvatinib显示强大的抗增殖活动对人类矿渣MTC TT细胞IC₅₀值为0.078μM体外(表1)。因为TT细胞携带C634W激活RET突变(47),lenvatinib可能产生抗增殖对TT细胞通过抑制RET RTK的影响。检查是否lenvatinib影响RET所激活的信号通路C634W突变我们进行免疫印迹分析检测磷酸化RET及其下游效应器phosphor-ERK1/2体外。治疗与lenvatinib 1 h抑制磷酸化ERK1/2的RET和培养TT细胞(图5(一个))。此外,TT RET磷酸化的抑制异种移植也观察到2 h后口腔政府lenvatinib(补充图S8)在剂量产生抗肿瘤活性如图1 (c)。我们还研究了lenvatinib的效果与M918T RET突变的磷酸化。我们生成的转染子overexpressing KIF-RET的融合基因(野生型)和KIF-RET (M918T) Nthy-ori 3 - 1细胞比较野生型RET lenvatinib对磷酸化的影响和M918T突变。Lenvatinib磷酸化的抑制野生型RET和M918T变异(图5 (b))在一个类似的浓度,抑制RET (C634W突变)的磷酸化。这些数据表明lenvatinib抑制RET信号通路的激活突变RET体外,因此lenvatinib可能显示显著的抗肿瘤作用在人类矿渣MTC TT异种移植模型。

3.8。分子变异人类DTC细胞系的概要文件

我们决定5 DTC细胞系的基因突变谱利用MassARRAY系统来评估443基因突变在32。总结我们的突变分析补充表所示S2。K1细胞被发现携带BRAF突变(V600E)和PIK3CA基因突变(E542K)。ftc - 133, ftc - 236, ftc - 238细胞PTEN缺失突变()和TP53突变(R273H)。我们没有发现任何RAS突变5 DTC细胞系。

4所示。讨论

在这个报告中,我们决定lenvatinib的抗肿瘤和抗血管活动,一个目标的多个rtk的血管生成抑制剂,在11个人类甲状腺癌异种移植模型3的组织学类型(DTC、MTC, ATC)。口头管理lenvatinib显著抑制肿瘤生长的PTC (DTC)的主要类型,4 FTC (DTC)的另一个主要类型,1矿渣MTC, 5 ATC裸鼠异种移植。在5 DTC Lenvatinib抑制肿瘤血管生成和5 ATC异种移植模型就是明证MVD下降。我们发现lenvatinib没有显示强力的抗增殖活性对9的11人甲状腺癌细胞株体外的抗肿瘤活性lenvatinib反对人类甲状腺癌的广泛的面板模型主要从其抗血管新生的影响。

Lenvatinib体外增殖抑制了甲状腺癌的细胞系:也就是说,RO82-W-1和TT细胞系。我们执行中存在分析检查13 rtk的信使rna表达水平,包括lenvatinib-targeted rtk, 5 DTC细胞系相比,那些在正常甲状腺细胞(补充图S5)。FGFR1 mRNA水平调节WO82-W-1细胞相比Nthy-ori 3 - 1,表示FGFR1 mRNA的最高水平。装备和PDGFα信使rna RO82-W-1细胞中高度表达。然而,选择性RTK抑制剂(伊马替尼)和PDGFR的工具包α对RO82-W-1 (Ki6783)没有显示出抗增殖活动,但FGFR抑制剂(PD166866和PD174073)。与这些数据一致,免疫印迹分析表明,RO82-W-1细胞过表达FGFR1蛋白质。这些结果表明选择性作用FGFR RO82-W-1细胞系的信号通路。

我们的研究结果表明,lenvatinib FGFR信号通路的抑制体外和体内(图4和补充图S6)。虽然对VEGFR1-R3 lenvatinib显示抑制活动,FGFR1-R4,装备,RET和PDGFRα酪氨酸激酶(补充表S1),我们的数据表明,lenvatinib显示直接抗肿瘤活性针对RO82-W-1细胞株的抑制FGFR信号通路。FGFR1 FGFR3在高分化甲状腺癌,和ATC细胞过表达FGFR4 [35]。这将是有趣的调查lenvatinib显示抗癌活性是否对人体甲状腺癌FGFR信号通路与活跃。

我们发现lenvatinib显示有效的体外抗增殖活动(IC₅₀值为0.078μ米)对TT矿渣MTC细胞,RET突变信号通路被激活的RET (C634W)。作为参考,索拉非尼对TT细胞和一个集成电路抗增殖活动₅₀值为0.26μm . Lenvatinib抑制磷酸化的RET体外(图5)和体内(补充图S8)。我们没有发现明显降低在MVD TT异种移植模型,尽管lenvatinib显示明显的抗肿瘤活性,导致肿瘤收缩在100毫克/公斤(图1)。因此,lenvatinib可能导致其抗癌的抗增殖活动活动TT矿渣MTC异种移植模型。我们还研究了影响lenvatinib磷酸化的RET背着另一个激活突变(M918T) Nthy-ori 3 - 1细胞ectopically表示要么KIF5B-RET(野生型)或KIF5B-RET (M918T)(图5 (b))。Lenvatinib抑制野生型和M918T RET突变蛋白在体外的类似的浓度。我们之前报道,lenvatinib磷酸化的抑制CCDC-RET体内和体外增殖和肿瘤生长的人类DTC TPC1细胞系(37]。这些结果说明lenvatinib抑制RET信号在RET基因改变的存在,如一个激活突变或基因重排。矿渣MTC患者的3期临床试验,vandetanib VEGFR2 / RET抑制剂,临床益处是RET基因突变状态(独立的34),这表明多个受体酪氨酸激酶抑制剂可以基于抗血管活动针对VEGFR2显示抗癌活性。在TT异种移植模型中,我们没有发现在MVD明显减少。Lenvatinib显示显著的抗肿瘤活性对这个模型的磷酸化的抑制,表明对TT Lenvatinib细胞的抗肿瘤活性是源自RET抑制。然而,需要进一步的研究来确定lenvatinib参与其抗肿瘤活性的抗血管活动对矿渣mtc RET突变激活。

5 DTC细胞系的分子分析表明,K1细胞携带BRAF V600E突变(补充表S2)。的激活MAPK通路由于RAS和BRAF基因突变与甲状腺癌(恶性表型48]。因为lenvatinib显示抗肿瘤和抗血管活动K1 DTC异种移植模型低剂量(1 - 10毫克/公斤),激活BRAF突变可能不是参与抵抗抗血管治疗的临床前模型。总的来说,这些结果表明,lenvatinib具有抗肿瘤活性,尽管存在甲状腺癌相关基因改变的11个临床前我们检查甲状腺癌模型。

总之,lenvatinib显示11例甲状腺癌异种移植模型中有前途的抗癌活性来源于DTC,矿渣MTC, ATC细胞系。Lenvatinib显示抗癌活性在大多数人类的甲状腺癌模型由于其抗血管活性测试。此外,lenvatinib通过抑制多个rtk的活动可能导致其抗肿瘤活性对甲状腺癌症细胞系基因改变(例如,突变或重组)和有针对性的rtk的过度表达,如RET和FGFR1。Lenvatinib因此,一个有效的治疗代理在大多数甲状腺癌异种移植模型。

信息披露

所有的作者都是受薪雇员的卫材有限公司,有限公司,或卫材公司。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢Watanabe-Miyano纱织,渡边,麦上杉和Hiroyuki Muto准备在这项研究中使用的材料。他们也感谢美岛绿川俣,静香的谷口,Tomoya Shiina, Yusuke丹羽宇一郎,Syugo Hasuike为技术支持和伊诺村三帮助准备论文。

补充材料