文摘
Multisample nonindexed池结合下一代测序(上天)被用来发现受潮湿腐烂原癌基因序列变异在一组已知影响多发性内分泌瘤2型(MEN2)。DNA样本(113年白种人,其他种族的人23日)被放大受潮湿腐烂基因内区9基因内区16然后分成5 < 30样品池之前图书馆准备和门店。两个控件都包括在这项研究中,一个样品和一个50个样品池,先前测序同样的门店的方法。所有59变异之前发现50-pool控制。61个变异的检测在不受影响的人群中,20变体小说的变化。几个变种被高分辨率分析和融化Sanger测序验证,及其相关的等位基因频率与那些由上天决定的。结果从这个队列将添加到的影响受潮湿腐烂MEN2数据库。
1。介绍
多发性内分泌瘤2型(MEN2)是一种罕见的常染色体显性遗传疾病的高寿命风险甲状腺髓样癌(MTC) (1,2]。MEN2包含三个症状:家族性甲状腺髓样癌(FMTC) MEN2A, MEN2B [1,3]。FMTC家庭只有矿渣MTC。MEN2A家庭申请者至少有一个人嗜铬细胞瘤发展,甲状旁腺增生,或两者兼而有之。MEN2B病人矿渣MTC(有或没有嗜铬细胞瘤)的临床特征和其他特征:粘膜星形胶质细胞瘤,胃肠道星形胶质细胞瘤,眼睛异常,骨骼异常包括marfanoid身体体质(4- - - - - -7]。MEN2是由致病性突变只找到受潮湿腐烂原癌基因转染期间(重新)。这些功能是显性突变通常杂合的错义突变发现在特定的密码子受潮湿腐烂外显子10、11和13 - 16中,很少发现外显子5和8 [1,8- - - - - -10]。病人的医疗管理和潜在的家庭成员是基于家族受潮湿腐烂变异,通常由Sanger测序(1]。发现一个已知MEN2致病性受潮湿腐烂在一个家庭中突变导致筛查矿渣MTC,嗜铬细胞瘤,或甲状旁腺增生,并有可能预防甲状腺切除术增加存活率棘手,激进的矿渣MTC。大约75 - 80%的矿渣MTC患者矿渣MTC的零星的形式(即。孤立的,分家MTC),而不是MEN2 [6]。明显的零星的矿渣MTC患者总是进行一个测试受潮湿腐烂生殖系突变,以防他们实际上有MEN2和需要不同的医疗管理。尽管有许多知名的致病性受潮湿腐烂MEN2诱发突变,它可能很难知道一个罕见的生殖系或小说受潮湿腐烂变异是一个致病突变(病人MEN2)或不致病的多态性(病人有零星的MTC)。
罕见的解释和小说变异的重要性将会增加更多的人外显子组测序,整个基因组,或有针对性的基因水平。许多新变化将会发现与未知的临床意义及其存在和等位基因频率在一般人群的重要性,以帮助确定致病性变异的状态。财团的1000个基因组测序和其它大型项目正在取得巨大的进步在理解人口变化序列。更多的直接研究单个基因或基因板可以产生更高的测序读覆盖率和更具成本效益的顺序在一个较小的基因区域。另外,选择一个特定的队列可以测序一个特定的轨迹,如在这项研究中,一群自称没有个人或家族病史的MEN2或矿渣MTC的测序的部分受潮湿腐烂protooncogene大多数致病MEN2诱发突变。受潮湿腐烂序列变化检测在这个MEN2人口可以被添加到MEN2未受影响受潮湿腐烂数据库(8]。这些数据可以用于以下几个原因:(1)帮助解释临床上的致病性检测受潮湿腐烂序列变异;(2)作为将来的参考MEN2案例研究(变异不存在在那些影响MEN2疾病);(3)改进遗传测试设计,避免或最小化设计探针或引物受潮湿腐烂序列变异。
进一步减少测序的成本大量的个人,可以合并多个样本(没有索引)在新一代测序(门店)。这是一些研究的重点,分析了检测能力真正的变体在nonindexed合并样本集(11- - - - - -16]。30样品(60等位基因)最大池数量表明了我们之前的研究和在其他报告12,14,17,18),可再生的和准确的单等位基因检测池内(池)中的一个单例是一个独特的等位基因。一池的大小将读单等位基因频率为1.67%,考虑测序错误率和潜在的方差挥动变体阅读频率决定,单变量预计将检测到截止> 1%以上变体读(17,18]。
在这项研究中,136人的MEN2影响群体基因组测序在illumina公司分析仪利用实验室和生物信息学nonindexed协议从我们先前的研究,多个样品池。不到30池的大小是有限的,这是以前确定的最优池大小对准确检测单变体(12,14,17,18]。总共61个变异被发现在MEN2影响群体,其中包括20小说变异。
2。材料和方法
2.1。样品
外周血样本136名成年志愿者(113白人种族多样性中非白种人和23)收集并使用犹他大学IRB协议没有鉴定。7740年。这个影响队列的捐助者被自称是没有个人或家族病史的甲状腺髓样癌和多发性内分泌瘤2型(MEN2)。51个样本作为控制根据IRB没有鉴定。7275年,桑格测序受潮湿腐烂外显子10、11和13 - 16,包括外显子/内含子的边界。没有“single-sample控制”受潮湿腐烂MEN2突变使役动词,而“50池”控制包含许多样本与已知MEN2使役动词受潮湿腐烂突变。50池控制在illumina公司基因组测序分析仪之前几次(17,18]。
2.2。PCR、图书馆准备,和门店
DNA样本被放大受潮湿腐烂基因内区9基因内区16使用远程PCR技术。扩增子被SequalPrep规范化(英杰公司集团,卡尔斯巴德,CA),量化使用Quant-iT Picogreen dsDNA工具包(英杰公司集团)和克分子数相等的汇集Illumina公司图书馆准备之前,利用先前描述的协议(18]。27日至29日高加索样品的扩增子组合成四个独立池(P1, P2, P3, P4)之前Illumina公司图书馆准备和门店。非白种人群的23个样本测序(民族池)在一个单独的池。的PCR-amplified受潮湿腐烂位置1 - 9180位置参考序列NC_000010.10(表43608691 - 436178701)。两个控件也包括在这项研究中,一个样本和50个样品池。每个池和控制在一个单独的测序流动池巷illumina公司基因分析仪,用单头读化学。
2.3。数据分析
测序图像文件和读取对齐处理受潮湿腐烂参考序列与SeqMan NGen 2.1版本软件(DNAstar,麦迪逊,WI),如前所述[17,18]。读取使用的67个基长度自3′末端的位置再读阅读可以增加测序背景错误,如图所示在先前的研究17,19,20.]。如前所述,一些基质量分数筛选阈值(Q-threshold)评估阅读报道,错误(尤其是对离群值错误,这可能被误认为是池中的假阳性),变体阅读百分比,和基质量分数统计数据来确定30 Q-threshold应该用于分析的数据集,而最小化错误,同时保持足够的阅读目标覆盖率(数据未显示)17,18]。
排除在分析一个地区的重复和均聚物引起的失调误差在所有的数据集(指定“重复区域,”扩增子位置7686年至7720年)。改变指定参考序列的变异,变异读百分比是NGS-determined等位基因频率。变体的以前开发的减去校正方法检测应用中控制的变体阅读百分比(在每个位置变化和可能的变体)减去汇集数据变异的阅读百分比,产生一个集中的数据集没有背景测序错误(17,18]。
2.4。版本验证
的一个子集NGS-detected受潮湿腐烂序列变异是验证通过高分辨率分析(人力资源管理)和/或融化Sanger测序。人力资源管理分析PCR引物受潮湿腐烂外显子13和15前面描述的(21]。受潮湿腐烂基因内区9使用人力资源管理分析引物(5′,3′):向前ACA CTG CAA TGT GCG GGT CA和反向GTC CCC CAA CAA TGC TGC CC。样本DNA(~ 5到15 ng / uL最终浓度)是放大和分析如前所述21),除了LightScanner 32仪器(爱达荷州技术,Inc .,盐湖城,UT)是用于PCR和人力资源管理分析。LightScanner参数包括Uracil-DNA糖基化酶步骤(50°C 10分钟);聚合酶激活(95°C 10分钟);40 PCR循环(变性为1 s在95°C,退火1 s的62°C,扩展为4 s在72°C);形成的扩增子heteroduplexes (95°C 1 s,然后迅速冷却至40°C 10 s与坡道20°C / s)的速度;高分辨率融化协议(70到96°C匝道利率为0.3°C / s) (21]。为了检测样品纯合子受潮湿腐烂变异不能区别纯合子的野生型样品在人力资源管理分析,执行同样的程序,除了野生型DNA (~ 5 ng / uL最终浓度)飙升到PCR反应(22]。如果需要,桑格测序是用来证实人力资源管理确定变异的结果。
3所示。结果
3.1。下一代测序(上天)50-Pool和Single-Sample控制
single-sample控制本研究中使用的顺序完全匹配的参考序列,因此没有真正的变量变化的参考序列,只有背景测序错误(表1)。这个示例是一个理想控制的任何变体读取以来的错误率受潮湿腐烂参考在每个序列的位置反映了背景挥动错误率,同时分析仪illumina公司基因组测序已经演示了可再生的、非均匀,sequence-specific背景错误率,阅读报道,基质量分数之间的车道和运行使用相同版本化学[11,12,17- - - - - -20.,23,24]。这一个样品池内的sequence-specific错误率控制数据集通过减去校正方法,如我们之前所述的研究(17,18]。减去校正,single-sample控制的变体读取每一个可能的序列的位置,并改变从池中减去参考序列的变异阅读百分比。这种收益率的估计汇集数据没有背景测序错误率为变体阅读百分比(示例图1)。single-sample控制和50-pool数据也被用于选择的前30 Q-threshold用于筛选的数据质量分析(数据未显示)17,18]。
(一)
(b)
(c)
50-pool控制了敏感性检测已知的变异与低阅读百分比这总会在运行和使用减去校正方法(如图1)。50-pool包含100等位基因和预期的1%单变体阅读频率(singleton是独一无二的池内)。50-pool在场所有59变异之前发现在相似比例> 0.5%变异读和读值作为确定前一个变体门店运行相同的库(,图1(一))。50-pool数据有一些潜在的假阳性的截止后0.5%变体读取但减去single-sample控制数据校正,和真正的变异都是容易从背景中检测到错误(图1 (b))。
3.2。门店的MEN2群体的影响
基于我们之前的工作和其他的研究,样品池被限制到30或更少的样本在每个池变异导致阅读比例在1%以上,最准确的选择截单变异检测(12,14,17]。113年白人样本分为4用不到30样品池。高加索池P1 27个样本,P2已经29岁,P3 28,和P4 29样本,预期的1.85%,1.72%,1.77%,和1.72%的单变量读取频率,分别。所有池数据集进行评估和没有减去校正使用single-sample测序背景的错误率控制(图1 (c)和数据未显示)。共有51个变种被发现在高加索MEN2影响队列读值> 1%的变种,其中23例中从未出现过的非白种MEN2队列(民族池)(表的影响1)。最低的单变量在高加索的数据集是在P2变体阅读频率为1.12%。23非白种样本在一个池(民族池),预期的2.17%读单等位基因频率。共有38个变种被发现在这个种族多样化MEN2影响队列读值> 1%的变种,其中10例中没有高加索数据集。民族池中最低的单变量变异1.79%阅读频率。每个检测到变异的变异阅读百分比如表所示1每池,也总结了四个白人池。相比较而言,NCBI dbSNP发现变异的等位基因频率值也显示。被检测出变异intronic变化,除了预期的常见第11外显子多态性,13、14和15。总数的61个变异中发现MEN2群体影响,20变体小说改变,未见在NCBI dbSNP132 50-pool控制或。
3.3。验证NGS-Detected变化
自从136年未受影响人群样本没有测序之前通过桑格或门店方法,几个变种位置在三池(共79个样本)选择验证。高分辨率融化(人力资源管理)分析方法,它是一个快速、封闭管突变扫描分析,选择基因型个体样本的验证挥动变异检测和捷变异等位基因频率(表确定2)。高分辨率分析检测序列变异在融化PCR扩增子使用饱和dsDNA染料,在许多情况下可以唯一地标识每个变体基于微分融化概要文件(图2(一个))[25- - - - - -28]。人力资源管理分析州100%的特异性和灵敏度检测中的杂合变异体小扩增子(< 300个基点)29日]。人力资源管理分析是用来检测在一段序列的变化受潮湿腐烂第9和外显子内含子13和15(图2和数据未显示)。受潮湿腐烂外显子13和15是选择,因为他们每一个标题都包含一个常见的多态存在于所有池,可以检测到使用之前开发的人力资源管理分析[21]。外显子13包含c。2307G>T variant and exon 15 contains c.2712C>G variant (受潮湿腐烂扩增子位置5153年和6943年分别表1和2)。基因内区9被选中,因为它包含三个NGS-detected变体在附近受潮湿腐烂扩增子位置117、156和174 (c。1760−197 g > T、c。1760−158C>G, and c.1760−140C>G, resp.), and also to verify the novel c.1760−158C>G variant detected in Caucasian pool P2 which had the lowest variant read percentage of 1.12% (expected 1.72% singleton read frequency within that pool of 29 samples). Since some homozygous variants can have similar melting profiles as the wild-type sample [22),这种技术峰值野生型DNA PCR反应允许区别的纯合子的变体进行任何样品测试后出现野生型人力资源管理分析。这种技术识别四个变异纯合子受潮湿腐烂在第15外显子和一个纯合子的变体受潮湿腐烂基因内区9(图2 (b)和数据未显示)。人力资源管理确定等位基因频率与捷变体相关阅读百分比为每个变量在每个池(表2)。最低的变体阅读百分比(位置156年P2, 1.12%)被证实为现在和杂合的在一个样本在高加索池P2。
(一)
(b)
4所示。讨论
本文描述了受潮湿腐烂原癌基因序列变异检测到在一个MEN2未受影响的136人。前面的基因组分析测序50-pool库(17,18)是用来控制检测的变化与低阅读频率,和所有已知的变异检测变体读取> 0.5%。具有类似错误率之间基因组分析仪道相同的运行(11,12,17,19,20.,23,24),单例变异小于或等于30-sample池应该准确地检测到高于背景误差使用我们之前确定截断值> 1%的变异阅读频率。单一样本背景测序错误率控制在每一个受潮湿腐烂序列位置和用于变异检测池的减去校正法(17,18]。
大多数MEN2影响群体的白种人的种族,而23个样本非高加索(民族池)和用于识别受潮湿腐烂内变异更种族多样化的样本集。136年样本分成五个nonindexed池和测序在五个单独的细胞通道流动。使用先前描述的协议对于生物信息学,减去校正,变体读截断值> 1%17,18,共61年受潮湿腐烂变异被发现在MEN2群体的影响。20这些变异是小说,不是在NCBI dbSNP 132(包括1000基因组数据)或发现在我们之前的样品池的研究受潮湿腐烂原型致癌基因(17,18]。许多这些小说的变化是特定于白种人或样品和民族的变体阅读频率低,所以他们可能是单或双张中的一张牌池内的变异。几个变种被人力资源管理和Sanger测序验证,包括小说的变化(c.1760−158 c > G)最低的变体阅读百分比(1.12%)。
的受潮湿腐烂MEN2数据库由作者开发的到目前为止有147个条目,其中74是已知的致病突变,62是不确定意义的变体。这个数据库已经被用来作为预测模型中的临床意义不明的表型变异的严重性受潮湿腐烂原型致癌基因(30.]。受潮湿腐烂这些MEN2序列变异数据的学生将被添加到MEN2的影响受潮湿腐烂数据库(8]。这种变体数据将有助于医学解释的变化中发现这一点受潮湿腐烂原癌基因区域利用Sanger测序等方法或门店(目标受潮湿腐烂基因外显子组,或全基因组测序)。任何受潮湿腐烂序列变化中发现个人与家庭的历史MEN2症状或者MEN2怀疑(明显的零星的矿渣MTC患者或嗜铬细胞瘤)可以相比受潮湿腐烂MEN2数据库,以及良性的受潮湿腐烂序列变异出现在生成的大群影响个人。这突出临床相关数据库的重要性不仅知道致病性变化,但也包含已知的良性变化对临床试验的解释。MEN2未受影响群体的变异的结果还可以用于比较变量中发现疑似MEN2病人的病例报告。基因测试设计的一个潜在的问题是未知的变异存在于PCR引物的位置,桑格测序引物,或融化的分析调查。结果从这个影响人口与基因测试将帮助设计,所以引物和探针设计将不会超过已知的受潮湿腐烂序列的变化。
介绍了序列变异检测方法可用于其他基因和分析为特定人群(影响和影响,通过不同种族,或那些与特定疾病的症状)。结果数据可以添加到locus-specific数据库来帮助解释临床检测序列的致病性变异。这些验证方法也可以适用于其他混合样品(如基因位置对GWAS跟踪或策略的数量)和自然池(如线粒体heteroplasmy或混合瘤数量)。
缩写
| MEN2: | 多发性内分泌瘤2型 |
| 受潮湿腐烂: | 重新安排在转染 |
| 矿渣MTC: | 甲状腺髓样癌 |
| FMTC: | 家族性甲状腺髓样癌 |
| 聚合酶链反应: | 聚合酶链反应 |
| Q-threshold: | 基质量分数筛选阈值 |
| 门店: | 下一代测序。 |
确认
作者感谢布莱恩Dalley猎人癌症研究所的大卫Nix illumina公司基因分析仪运行样本库。