文摘

研究的角色不变的自然杀伤T细胞(iNKT)细胞在自身免疫性甲状腺炎,我们两个iNKT细胞系来自点头·H2的脾脏^h4老鼠,应变发展自发的自身免疫性甲状腺炎饮食过剩加剧了碘。这两条线是CD1d-restricted CD4和表达⁺,DX5⁺和Vα4 jα281年基因片段,t细胞受体α轨迹。在刺激与α半乳糖神经酰胺(α-GalCer),两行迅速产生2、il - 4,干扰素-γ、il - 10和TNF -α。引人注目的是,类似的细胞因子反应也是引起甲状腺球蛋白,最丰富的蛋白质之一甲状腺和人类自身免疫性甲状腺炎的主要自身抗原。转让iNKT细胞系同源的主机增强自身免疫性甲状腺炎。腹腔内注射α在碘-GalCer老鼠也会诱发甲状腺疾病。本文首次报道iNKT细胞应对甲状腺球蛋白和增强自身免疫性甲状腺炎在碘美联储点头·H2^h4老鼠。

1。介绍

自身免疫性甲状腺炎,也称为桥本甲状腺炎,在自身免疫性疾病中发病率排名第三(在美国1,都取决于遗传和环境因素(2]。桥本氏甲状腺炎的某些方面可以重复使用的点头H2^h4鼠标,应变,自发发展甲状腺炎发病率低。甲状腺炎的发生率和严重程度可以加剧了补充钠碘(奈)的饮用水;几乎100%的点头·H2^h4老鼠NaI-enriched喝水6到8周发展中度到重度甲状腺炎(3,4]。点头·H2的免疫病理反应^h4甲状腺炎是类似桥本甲状腺炎,特点是自身抗体的发展甲状腺球蛋白和慢性甲状腺的渗透CD4等单核细胞⁺CD8 T细胞,⁺T细胞、B细胞和巨噬细胞(4- - - - - -6]。

对监管的作用的免疫细胞在自身免疫性甲状腺炎的发病机制。最近的研究表明,iNKT细胞是一个独特的人口淋巴细胞表达下调一些自身免疫性疾病,如1型糖尿病和实验性自身免疫性脑脊髓炎(7,8]。然而,其他对比研究表明,iNKT细胞可能致病见CD8 T cell-induced点头糖尿病(9)和反面A-induced肝炎(10,11]。因此,疾病的改善和恶化以来,即使在相同的疾病模型(点头I型糖尿病)的决定性作用iNKT细胞自身免疫发病机制尚不清楚。

分享典型iNKT细胞受体T细胞和NK细胞(NK1.1和/或DX5) [9,12),有一个t细胞受体的α链编码不变的基因片段,Vα14 Jα18在老鼠身上,Vα人类24-JQ [13- - - - - -15]。两个小说iNKT抗原目标细胞,外源微生物细胞抗原和内源性溶酶体鞘糖脂isoglobotrihexosylceramide (iGb3),发现了(16,17]。大多数iNKT细胞合成配体及时回复α半乳糖神经酰胺(α-GalCer)和分泌多种细胞因子的特点Th1 (IFN -γ)和Th2型(il - 4和IL-13)反应(18,19]。iNKT细胞疏水性相互作用目标抗原的上下文中CD1d, nonpolymorphic, MHC分子类我喜欢通常表示传统抗原呈递细胞(APC) (13,20.]。几项研究已经记录了广泛的异质性和多样性iNKT细胞群,导致他们分类成几个子集(18,19]。独特的子集iNKT细胞也被记录下来,熊CD1d表面,缺乏NK1.1, autopresentα-GalCer没有传统的APC (21]。

以前的研究已经表明thyroglobulin-stimulated过继转移的小鼠脾细胞诱导自身免疫性甲状腺炎(22,23]。然而,特定的免疫细胞的确切性质,负责转移疾病并没有被很好的描述。在本文中,我们描述了两行iNKT细胞表面表达CD4细胞的表型⁺DX5⁺CD1d-restricted, autopresent甲状腺球蛋白,产生Th1、Th2细胞因子。我们的报告,这些行iNKT细胞nonprotective iodine-fed点头·H2和提高甲状腺自身免疫^h4老鼠。

2。材料和方法

2.1。老鼠

点头H2^h4老鼠在约翰霍普金斯大学培育和维护传统的动物设施。雄性和雌性小鼠年龄在10到12周的研究中使用了。测试老鼠0.15%的奈饮用水和控制老鼠收到普通的自来水。

2.2。净化小鼠甲状腺球蛋白

甲状腺球蛋白是纯化如前所述24]。简单,鼠标甲状腺腺解剖和均质蛋白酶抑制剂缓冲区。碎片被离心分离,上层清液应用于1.6×88厘米的Sephacryl S300列(Sigma-Aldrich化学品,圣路易斯,密苏里州)平衡和PBS在4°C。每一列的蛋白质含量用分光光度法测定分数(OD_280年),最后由BCA蛋白质分析工具包(OD_560年)(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。收集小整除的甲状腺球蛋白和冷冻−20°C到使用。

2.3。内毒素测试

在甲状腺球蛋白净化过程中,已采取预防措施,以避免任何微生物和内毒素污染。所有甲状腺球蛋白制剂使用定量分析显色qcl - 1000 LAL-test装备从Bio-Whittaker购买,Walkersville,医学博士,美国。分析了根据制造商的协议。短暂,一系列的双重的稀释内毒素标准的欧盟/毫升(0.5到0.008欧盟/毫升)。Pyrogen-free, endotoxin-tested水(欧盟< 0.03,英杰公司公司,加利福尼亚州卡尔斯巴德)被用来准备样品和消极的控制。连续稀释50μL测试或标准样品的制备和孵化与100年10分钟37°Cμ与100年L(鲎amoebolysate,然后μ的显色底物L 6分钟。反应在100年停止使用μL停止解决方案。吸光度是阅读在405 nm spectrophotometrically ELISA板读者(Dynatech实验室、美国)。甲状腺球蛋白制剂与< 0.125欧盟被认为endotoxin-free和被用于所有化验。

2.4。甲状腺球蛋白Antibody-Specific ELISA

纯化甲状腺球蛋白是涂在96年Immunolon II板块(美国Dynatech) 2的浓度μ在碳酸盐/ g / mL碳酸氢盐缓冲(pH值9.6)和孵化一夜之间在4°C。盘子都洗4次PBS-Tween 20(0.05%)和阻塞2小时BSA-PBS为1%。盘子洗3次,然后孵化一夜之间用鼠标血清稀释1:100年的PBS。发现了老鼠thyroglobulin-specific免疫球蛋白子类使用适当稀释的二次抗体IgG1和IgG2b (ICN Inc .,极光,哦)。颜色是与开发p-nitrophenylphosphate衬底(σ,圣路易斯,密苏里州)。光密度(OD_405年)读者继续阅读MRX板(Dynatech实验室、美国)。

2.5。细胞系细胞制备和发展

点头H2^h4老鼠低剂量的碘化钠(0.05%)在为期12周的饮用水。脾脏单核细胞(跨国公司)在聚蔗糖密度梯度离心法分离Paque(法玛西亚,生物技术,瑞典)。细胞被清洗和培养在24孔板的密度10⁶细胞/毫升与完整的RPMI 1640补充10%的边后卫,20国际单位/毫升青霉素、20μg / mL链霉素,20毫米/ L谷酰胺,100μ不必要的氨基酸(美国马里兰州从GIBCO BRL)。骨髓衍生树突细胞被用作喂食器。- 2 (10 ng / mL), il - 4 (100 U /毫升)和gm - csf (50 ng / mL) (PharMingen,圣地亚哥,CA)被添加到每3 - 4天,细胞和细胞被刺激甲状腺球蛋白每14 - 18天。细胞增殖在甲状腺球蛋白选择紧急细胞系,然后被开发的96孔板的密度3×10⁻²细胞/毫升。两条线1 f1和2这里选择;1号线f1.1 f1派生的两次,被指定为1。骨髓树突状细胞来自同一个鼠标应变作为支线层。控制细胞系来源于一个MHC II与卵巢转基因小鼠。CD4⁺使用CD4细胞被磁选分离(L3T4)微(Miltenyi生物技术公司。奥本大学,美国加州)。细胞培养在6孔板补充完全培养基RPMI 1640和脉冲5μM鸡卵_{323 - 339}肽(ISQAVHAAHAEINEAGR)(柯林斯堡有限公司美国)使用附着装甲运兵车24和48小时前过继转移。

2.6。抗体和流式细胞术

iNKT细胞表面表达进行了分析使用异硫氰酸荧光素(FITC) / peridinin叶绿素蛋白质(PerCP)共轭anti-CD4 (L3T4)和藻红蛋白(PE)耦合锅NK anti-DX5单克隆抗体(mAb)。PE-coupled mCD1d马伯(克隆1 b1)(美国圣地亚哥BD PharMingen CA)是用于分析CD1d表达式。胞内细胞因子表达是用鼠标- 2单克隆抗体,il - 4,干扰素-γ、il - 10和TNF -α圣地亚哥与PE (PharMingen CA)。三色染色分析细胞表面标记,和细胞内细胞因子使用标准协议提供的制造商(美国圣地亚哥BD PharMingen CA)。简单地说,发达iNKT细胞被刺激的4小时45μ克/毫升的甲状腺球蛋白完全rpmi - 1640和孵化与高尔基体持续2小时停止(美国圣地亚哥BD PharMingen CA)。细胞与细胞表面清洗和彩色30分钟标记之后,细胞与细胞内细胞因子染色标记固定。流仪分析与Cellquest FACSCalibur完成软件(德国海德堡,正欲)。

2.7。V的表达式α14 jα281年iNKT细胞

老鼠iNKT细胞表达细胞αβ利用不变的Vα14和Jα281基因片段15,25]。从每个细胞总RNA提取线(RNA容易迷你工具,试剂盒,瓦伦西亚,CA)和反向转录使用引物5^”-TGGCGTTGGTCTCTTT-GAAG-3^”,结合常数α识别的区域。使用上游引物PCR扩增当时执行5^”-TCCTGGTTGACCAAAAAGAC-3^”,结合Vα14个地区。443年英国石油公司扩增子是2%琼脂糖凝胶上分离。

2.8。扩散分析

为期三天的扩散试验进行测试的响应iNKT细胞系甲状腺球蛋白。细胞(2×10⁴细胞/)培养72小时完成rpmi - 1640年附着腹膜巨噬细胞作为装甲运兵车和刺激了45岁μ甲状腺球蛋白的g / mL。评估是否thyroglobulin-specific iNKT细胞扩散取决于CD1d订婚,扩散进行了分析与不同浓度的纯化小鼠anti-CD1d马伯阻挠(3.0 - -0.19μg /嗯,0表示没有mAb)。与1细胞脉冲μCi (methyl-3H)胸苷(美国新泽西州Amersham,法玛西亚)在过去的18个小时。合并[甲基-扩散测量³胸苷H)在96年一个矩阵直接β闪烁计数器(华莱士,德国)。数据代表平均值4分钟后一式三份井数计数管。

2.9。CD1d四聚物染色

重组可溶性CD1d蛋白(a . Bendelac博士的礼物)孵化与甲状腺球蛋白(100 ng)或2μ米的解决方案αGalCer 0.005%渐变20;的蛋白质被离心透析在Microcon YM-30管(微孔,贝德福德,MA)。四聚体是由甲状腺球蛋白或混合α与PE-conjugated GalCer-loaded单体链霉亲和素(5点:1)。染色是由孵化细胞冷冻保存与四聚体3 h浓度相当于3 - 5μCD1d1 g / mL。的测定- 2 NKT杂种细胞同样孵化CD1d加载和分泌2是浮在表面的测量。

2.10。过继转移

iNKT细胞系是孵化与甲状腺球蛋白4小时37°C湿润,5%的股份有限公司₂孵化器转移到前10到12周前点头H2^h4老鼠。这些细胞被洗两次,resuspended无菌PBS和静脉注射(注射)。在天0和2 5×10的浓度⁶细胞/鼠标。所有老鼠0.15%奈饮用水前2周细胞转移。老鼠牺牲14天接受;甲状腺被解剖,收集的血清自身抗体的检测甲状腺球蛋白。对照组收到碘水和注射无菌PBS输液的同时测试老鼠而不是细胞转移。作为一个控制细胞系,OVA-specific CD4⁺细胞同样转移到美联储碘和年龄小鼠刺激后5μM鸡卵_{323 - 339}肽(ISQAVHAAHAEINEAGR)(柯林斯堡有限公司美国)使用附着装甲运兵车24或48小时前过继转移。

2.11。转移细胞的跟踪

为了追踪这些细胞,iNKT细胞系来源于Thy1.2点头·H2^h4老鼠过继转移到美联储Thy1.1点头·H2碘^h4老鼠在上述浓度。甲状腺细胞被孤立于14天后posttransfers酶消化后,分析了通过流式细胞术如前所述[26]。

2.12。在活的有机体内α-GalCer治疗和碘启动的老鼠

点头·H2^h4老鼠使用:实验组和控制的车辆和碘单独组。雄性和雌性都被包括在研究。在他们的饮用水碘补充前两周α-GalCer注射。两个α100年-GalCer ip注射μg /鼠标天0 & 7。在14天小鼠牺牲。

2.13。组织和血清收集

之前收集血清碘水处理(14天),在细胞过继转移(第0天),在第14天posttransfer。甲状腺缓冲福尔马林固定在10% 2天,并提交以组织学染色。血样孵化在室温下30分钟;离心后收集血清,储存在−80°C到使用。

2.14。组织学

石蜡包埋部分甲状腺的苏木精和伊红染色和分级从0到4分数基于单核细胞浸润的程度。0被分配的等级没有损伤,1 < 20%的渗透,2为20 - 30%,3 > 30 - 50%,4 > 50%甲状腺的渗透。

2.15。统计数据

正态分布数据的比较都是通过学生的以及;否则,Mann-Whitney测试使用。测试值被认为是控制价值显著。

3所示。结果

3.1。过继转移细胞株导致自身免疫性甲状腺炎

两个iNKT细胞系来自点头·H2的脾细胞^h4老鼠刺激与甲状腺球蛋白中描述的方法。这些细胞系在自身免疫性甲状腺炎的可能的作用首先是确定。过继转移进行与iNKT细胞系和适当控制细胞如OVA-specific CD4 +细胞。过继转移实验与细胞系进行碘点头·H2预处理^h4老鼠。在第14天老鼠牺牲过继转移后,和结果分析(i)得分甲状腺组织病理学,和(2)评估甲状腺球蛋白抗体ELISA。

3.1.1。甲状腺组织学显示增加细胞的渗透

组织学分析细胞浸润的老鼠接受f1.1细胞株1或2这里细胞显示中度到致密细胞渗透得分从2 - 3(30 - 50%)以及强烈的滤泡破坏与控件(数字1(一)和1 (b))。表1显示结果的摘要疾病的病变发展postadoptive转移的频率和严重程度。两个对照组使用;一组收到碘但没有细胞转移和其他没有收到碘但收到同等数量的细胞实验小组。对照组接受奈在饮用水同一时间段实验组没有出现在甲状腺病变除了一个鼠标,开发了一种低水平的甲状腺炎,可能由于自发表型小鼠模型。1号线的过继转移f1.1导致病变的发展成绩12 8 1 - 3的老鼠。类似第2行这里导致病变的分数在所有4的老鼠(表1 - 21)。OVA-specific CD4过继转移控制⁺细胞没有渗透的甲状腺的老鼠(表1)。

3.1.2。甲状腺球蛋白抗体水平增加NKT细胞的过继转移后

Thyroglobulin-specific IgG1和IgG2b自身抗体检测到了子类血清iNKT细胞转移的接受者。图2显示的结果代表从第1行f1.1过继转移实验。IgG1水平显著增加(数据2(一个)和2 (b))()和IgG2b抗体(数字2 (c)和2 (d))()甲状腺球蛋白被认为几乎所有的老鼠接受转移控制老鼠相比仅接受奈(图2)。由于自身抗体的产生表明甲状腺自身免疫甲状腺球蛋白,这些结果表明,所有的老鼠接受1 f1.1细胞在这个特定的实验()开发增强响应在甲状腺炎甲状腺自身抗原最终。所有的老鼠接受OVA-specific CD4的控制⁺细胞发达抗体甲状腺球蛋白(数据没有显示)。因为我们现在知道我们的细胞系可以诱导自身免疫性甲状腺炎在NaI-treated点头·H2^h4老鼠,我们开始详细描述这些细胞。

3.2。增生性反应细胞系小鼠甲状腺球蛋白

表明甲状腺球蛋白的细胞系回应,我们执行一个在体外扩散试验。两个细胞系,1 f1.1和2这里,培养72小时的细胞浓度2×10⁴/在辐照附着腹膜巨噬细胞与45μ甲状腺球蛋白的g / mL。相同与卵清蛋白或培养基培养细胞系是单独控制。两个细胞系表现出更高的扩散对甲状腺球蛋白();然而,两线对卵清蛋白(图也显示出疲软3)。因此,我们假设iNKT细胞强烈回应我们的甲状腺球蛋白制备增强甲状腺自身免疫和导致疾病。

3.3。细胞内细胞因子的细胞系

iNKT细胞迅速产生各种细胞因子在回应α-GalCer。确定胞浆内细胞因子表达,刺激甲状腺球蛋白或两行α-GalCer。细胞内immunofluorescent染色进行了在不同的时间点(2、4、8、18、24和48小时),以确定的最佳时间点细胞内细胞因子的表达两行(数据没有显示)。在执行动力学之后,我们发现,两行表示在4小时内细胞内细胞因子的刺激。大多数细胞因子的表达10小时后消失。因此,4小时的时间点是用于进一步的化验和分析。有趣的是,两个细胞系显示不同的细胞内细胞因子的生产模式(数据4(一)和4 (b))。虽然两个细胞系有大量IL-2-producing细胞最初,但在长期文化- 2分泌的他们失去了这种能力。1号线f1.1显示极化对Th1反应。大量的干扰素-γ产生细胞与甲状腺球蛋白(大约72 - 82%α-GalCer resp)和il - 4分泌细胞(~ 2%)记录如图4(一)。第2行这里显示适度的数字,干扰素-γ与甲状腺球蛋白(约50 - 54%α-GalCer resp)和il - 4和甲状腺球蛋白(约28 - 44%α-GalCer分别生产细胞(图)4 (b))。因此,第2行这里显示不同的细胞因子与1号线f1.1相比。il - 10在相当比例的细胞被发现在25 - 70%的线路1 f1.1(甲状腺球蛋白或α-GalCer职责。在第2行)和38 - 42%这里(甲状腺球蛋白或α-GalCer,职责)。肿瘤坏死因子-α几乎所有的细胞中发现了1号线f1.1但只有30 - 35%的细胞行2这里。因此,尽管细胞因子分泌细胞的数量变化存在两条线,线内细胞因子的模式对甲状腺球蛋白或回应α-GalCer是相似的。此外,在反复刺激,细胞因子产生细胞的百分比的线保持不变(图4代表数据从一个代表性的实验)。

3.4。描述的细胞系的表型

iNKT细胞系中扩散反应甲状腺球蛋白和Th1、Th2型细胞因子产生各种细胞表型标记的表达特点。这些细胞被染色的特点与T细胞(细胞表面标记相关αβ、CD4和CD3)和NK细胞(DX5 pan-NK细胞标记)。如果细胞系也染色确定各种表面标记的组成型表达。休息的细胞系以及刺激状态对细胞表面标记αβ⁺,CD4⁺,CD3⁺,DX5⁺和CD69⁺如表所示2。除了常见的iNKT细胞标记,我们iNKT细胞也表达了CD1d表面。为了检测巨噬细胞是否可以出现在细胞培养中,占CD1d表达式,巨噬细胞和树突细胞标记(Mac1、CD80和CD86)也被测试。没有一个细胞系表现出可检测水平的这种标记为巨噬细胞,树突状细胞或其他CD8等人群⁺或B220⁺。然而,coexpression CD4细胞⁺和DX5⁺发现在95 - 99%的细胞细胞系(表吗2,图5)。难怪NK1.1,常见的NK细胞的标志,没有观察到在细胞系来自父母点头小鼠的NK细胞不显示该等位基因标记(12]。

虽然这些结果表明iNKT线的确是一个子集的细胞,需要进一步确认。大多数iNKT细胞的一个经典特征是不变的链TCR的限制使用αβ由V编码α14 jα281基因重排14,15]。重要的是,这两个细胞系表达Vα14 jα281年通过rt - pcr(图所示6)。相比之下,CD4细胞⁺NK1.1⁻/ DX5⁻T细胞克隆,作为消极的控制,并没有显示任何这样的表达式(图6)。这些结果证实细胞系生产和刺激我们的甲状腺球蛋白制备来源于点头H2^h4老鼠是iNKT细胞的一个子集。因此,混合Th1 / Th2细胞因子从这些细胞如上所示并不奇怪,因为自身免疫性甲状腺炎显示Th1、Th2细胞因子与疾病病理学(5,27),和iNKT细胞释放大量的两种类型的细胞因子刺激后四个小时。

3.5。CD1d-Restriction iNKT细胞系

大多数iNKT细胞识别子集脂质或疏水肽抗原的上下文中CD1d,通常表达抗原呈递细胞(28]。我们发现我们iNKT细胞系表达CD1d甲状腺球蛋白和扩散反应没有传统的装甲运兵车(图7)。扩散试验结果表明,CD1d轴承iNKT细胞能够auto-presenting抗原在缺乏传统的装甲运兵车如前所述Hameg et al。21]。测试的依赖细胞株对CD1d刺激甲状腺球蛋白,我们阻止了CD1d使用CD1d单克隆抗体(mAb)。我们发现thyroglobulin-specific扩散是剂量依赖性的方式完全废除CD1d马伯治疗,而疏通细胞有效地扩散在甲状腺球蛋白刺激(图中7)。

确认CD1d iNKT细胞株特异性,我们使用CD1d四聚体。流式细胞仪使用的染色α-GalCer-CD1d-specific四聚体证实,线条iNKT细胞。克隆细胞CD4的大门⁺DX5⁺被发现是> 88%阳性CD1d四聚物染色(数据吗8(一)和8(b))。这些结果验证我们的细胞系功能CD1d-restricted和认可α-GalCer像典型iNKT细胞克隆。

3.6。体内的治疗α-GalCer增强甲状腺炎点头H2^h4老鼠

老鼠能有两个α-GalCer注射ip后短时间内(两周)的碘治疗。如表所示1,55%的老鼠α-GalCer注射了渗透的甲状腺后14天。大约有22%的老鼠(2 9)也表现出自身抗体对甲状腺球蛋白(数据没有显示)。从对照组,只有14%的小鼠(1 7)发达轻度甲状腺组织学,但是没有一个发达的甲状腺自身抗体(表可检测水平1)。

3.7。跟踪iNKT甲状腺细胞

因为iNKT细胞导致自身免疫性甲状腺自身免疫在转移实验中,重要的是确定网站的行动过继转移。为了解决这个问题我们进行了过继转移实验使用iNKT细胞系点头H2^h4小鼠Thy1.2表达成点头·H2^h4老鼠表达Thy1.1。这些细胞被转移到以类似的方式如前所述。甲状腺疾病评估后14天收集细胞转移。单细胞悬浮体的准备和分析检测Thy1.2 iNKT细胞。没有检测到表达iNKT细胞浸润Thy1.2流式细胞术分析(数据未显示)。然而,我们可以检测CD45⁺浸润淋巴细胞14天,表明疾病进展。我们解释这些结果表明这些细胞(i)是短暂的和/或(ii)疾病发展最可能通过细胞因子间接影响当地的淋巴结,但没有侵入性甲状腺本身。

4所示。讨论

在本文中,我们报告的过继转移iNKT细胞系增强自发在敏感受体小鼠甲状腺炎。细胞系建立最初的表征通过检测表面CD4细胞的表型⁺和DX5⁺(pan-NK细胞标记),然后由不变的细胞受体的表达α链:Vα14 jα281年。两个细胞系被发现coexpress CD4⁺和DX5⁺在他们的表面。NK1.1,常用标志识别NK细胞,没有发现细胞系。这并不奇怪,因为老鼠点头,以及许多其他鼠标菌株不表达NK1.1抗原(12]。DX5蛋白质的表达已被证明是积极的所有鼠标菌株研究,因此被广泛用作标记来识别NK细胞(9,13]。整体细胞系的表型分析表明,绝大多数的细胞在文化中,至少有95 - 99%的细胞,表达了iNKT细胞表型。

为了更好地理解的功能特征iNKT细胞系,我们检查他们对甲状腺球蛋白或卵白蛋白刺激的反应。除了扩散甲状腺球蛋白,两线对卵白蛋白反应弱。CD1d已知有一个更深的槽比经典的MHC分子,具有高亲和力结合糖脂和疏水肽(28]。众所周知,卵白蛋白的疏水端也结合CD1d槽高亲和力。也许甲状腺球蛋白,有许多疏水区域,也同样由CD1d iNKT细胞(29日]。即使iNKT细胞识别抗原由CD1d的子集,对外源性疏水肽抗原的作用,如甲状腺球蛋白或其他天然配体,在加工、表示、iNKT细胞的选择和发展。我们的扩散数据表明,甲状腺球蛋白或衍生肽,可能是一个候选配体CD1d-dependent iNKT细胞刺激iodine-fed点头H2^h4老鼠。碘进一步修改可能导致甲状腺自身抗原的疏水性和稳定性(30.,31日]。

表面的存在CD1d iNKT细胞系表明这些细胞可能会出现甲状腺球蛋白自分泌或旁分泌的方式。因为CD1d阻断抑制这些细胞的刺激,这证实了他们的CD1d限制。然而,目前尚不清楚如何处理甲状腺球蛋白。人类甲状腺球蛋白的特性研究和序列(高温凝胶)认可的disease-inducing效果40-amino酸(F40D)从高温凝胶肽。人类甲状腺球蛋白的致病性F40D肽被发现高度疏水性质和位于第二第三的甲状腺球蛋白分子。注入这个肽thyroiditis-susceptible CBA / J小鼠应变诱导严重自身免疫性甲状腺炎(32]。这个可能性iNKT细胞可能识别疏水肽F40D或类似的疏水肽,从而导致点头致病性·H2^h4类似于CBA / J。或者可能autopresent iNKT细胞抗原的机制类似于CD8的子集⁺T细胞autopresentsα-GalCer [21]。最近的研究表明,人类T细胞通过CD1d限制αβ细胞,在某些炎症和自身免疫系统条件下,有能力识别nonlipid小肽分子的分子结构33]。看来处理抗原可能发生的方法不止一种体内取决于抗原的性质导致一代致病对多个抗原决定基的甲状腺球蛋白免疫反应。最近的一项研究表明,一种plasminogen-like蛋白,存在于甲状腺上皮细胞顶端地区的自然降解甲状腺球蛋白为了维持甲状腺球蛋白浓度此外[我们的流明34]。我们推测,在这个过程中降解小疏水形成抗原片段,可以提交给iNKT细胞CD1d的上下文。因此,研究促进因素致病抗原表位在处理和表示的甲状腺球蛋白CD1d-bearing装甲运兵车应有助于了解更多关于甲状腺球蛋白的识别iNKT细胞及其在疾病发病机理中的作用。

iNKT细胞的独特能力迅速释放细胞因子在抗原刺激被认为是他们的监管职能的基础效应阶段的免疫反应,尤其是在监管的自身免疫性疾病(8,35]。iNKT细胞可能通过分泌细胞因子的表达下调的疾病,保护(7)或通过招募耐受性树突状细胞(36]。流式细胞仪分析细胞内细胞因子的我们iNKT细胞系透露代表Th1、Th2细胞因子不同类型刺激甲状腺球蛋白(图4小时后4),由先前的研究从iNKT细胞刺激在体外(37,38]或在活的有机体内(39]。iNKT细胞的不同细胞因子资料,相关抗原,刺激他们的性质(38,40]。例如,α-GalCer被用来确定的功能意义iNKT细胞群的保护或自身免疫性疾病,如1型糖尿病的预防实验性自身免疫性脑脊髓炎和地方保护的老鼠与偏见Th2反应(35,40]。

我们的iNKT细胞株与甲状腺球蛋白或刺激α-GalCer透露仅略有不同的细胞因子两行之间的配置文件。后与甲状腺球蛋白或刺激α-GalCer,细胞系迅速产生某些关键细胞因子如- 2、il - 4,干扰素-γ、il - 10和TNF -α。虽然iNKT细胞株产生不同的细胞因子的水平,都能够提高疾病易感基因老鼠。自从iNKT细胞被刺激甲状腺球蛋白的准备,CD1d分子,不同抗原表位的甲状腺球蛋白可能iNKT细胞的配体。我们因此怀疑在点头H2^h4老鼠和可能受到人类自身免疫性甲状腺炎是由细胞因子间接增强iNKT甲状腺球蛋白刺激细胞的产物。

尽管Th1-type CD4⁺T细胞被认为是主要的贡献者的起始和持久性自身免疫性甲状腺炎(5,41),我们的研究使用thyroglobulin-stimulated iNKT细胞系表达- 2,干扰素-γ、il - 10和TNF -α暗示iNKT细胞的作用在增强自身免疫性甲状腺炎。显著增加血清水平的IgG1和IgG2b甲状腺球蛋白抗体过继转移后14天iNKT细胞系进一步表明了关键作用增强thyroidal iNKT细胞自身免疫。自身免疫性甲状腺炎的确切机制增强这些iNKT细胞系仍不清楚。工作由其他调查人员表明NKT细胞促进自身免疫性疾病在一定条件下(10,11,42,43]。有人建议,NKT细胞的疾病阶段引入实验系统发挥重要作用在疾病的结果。例如,如果早,开始之前疾病结果是保护,但如果开始后的疾病,结果是疾病增强[44]。在我们的实验模型iodine-induced甲状腺炎点头H2^h4鼠标,转让1 f1.1 iNKT细胞系提升疾病只在iodine-primed老鼠,进一步表明这些细胞的作用是增强而不是引发疾病。

总之,iNKT细胞系来自点头·H2的脾脏^h4老鼠通过重复刺激小鼠甲状腺球蛋白的准备。这些细胞系都T细胞的分子和功能拨款墨水。当这些线转移到iodine-primed点头·H2^h4收件人、甲状腺自身免疫增强。在这个模型中系统iodine-induced甲状腺炎,这些iNKT细胞可以产生大量的Th1细胞因子,如IFNg或TNFα,主导Th2细胞因子反应的保护作用。这些实验进一步放贷谨慎态度NKT细胞治疗自身免疫性疾病,被保护在一个可能导致疾病增强在另一个。

缩写

APC:	抗原呈递细胞
BM:	骨髓
置信区间:	居里
ELISA:	酶联免疫吸附试验
的边后卫:	胎牛血清
FITC:	异硫氰酸荧光素
gm - csf:	粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子
h:	小时
干扰素:	干扰素
搞笑:	免疫球蛋白
IL:	白介素
i.p。	腹腔内(ly)
注射。	静脉注射(ly)
马伯:	单克隆抗体
NK细胞:	自然杀手细胞
OD:	光密度
卵巢:	卵清蛋白
PBS:	磷酸盐
RT:	反转录
聚合酶链反应:	聚合酶链反应
识别:	t细胞抗原受体。

确认

作者衷心感谢卢克Teyton博士从免疫学、斯克里普斯研究所,10550年北Torrey Pines,拉霍亚,CA 92037年美国和阿尔伯特Bendelac博士,芝加哥大学病理学系,芝加哥,60637年,美国为他们提供指导和礼物α-GalCer和CD1d四聚体的研究。他们也感谢海伦博士Braley-Mullen内科,密苏里大学医学院的哥伦比亚,美国密苏里州的分享你的1.1点头H2^h4老鼠和Sarat达赖的病理学博士OVA-specific CD4的约翰霍普金斯大学⁺细胞系。这项工作是由国家卫生研究院的基金DK42174支持部分,ES10285, DK55670。