甲状腺激素进入孤立的白色脂肪细胞主要由一个系统L1-type氨基酸转运蛋白<我>途中我>运用基因操作。分化3 t3-l1小鼠脂肪细胞在文化表达mRNA LAT1(高亲和性系统L1)的催化亚基。L - (125年 我]- t3 吸收成3 t3-l1大量饱和脂肪细胞包括组件被亮氨酸。L - (3 H]苯丙氨酸成3 t3-l1细胞吸收饱和(
31
米),竞争性抑制T3 (
1.2
米)和被亮氨酸、BCH和rT3 如预期为底物的相互作用系统L1。射流预紧L - (3 从3 H]苯丙氨酸t3-l1脂肪细胞<我>反式我>由外部刺激亮氨酸,展示系统L1运输的义务交流机制。T3 (10
米)不显著<我>反式我>刺激L - (3 H]苯丙氨酸流出,但竞争性抑制<我>反式我>刺激的效果十
M亮氨酸。结果突出显示强大的竞争iodothyronines (T之间的相互作用3 ,rT3 )和氨基酸运输系统L1脂肪细胞,这可能会影响细胞iodothyronine交流期间改变状态的蛋白质营养。
1。介绍
甲状腺激素(黑色)甲状腺素和L-triiodothyronine iodothyronines施加他们的主要生理作用在靶细胞基因表达的调节,它们必须首先进入跨越质膜(1 - - - - - -3 ]。Iodothyronines目前已知可能促使细胞膜通过多种机制,包括运输系统的共享大中性氨基酸(LNAAs;主要是芳香和支链氨基酸)和有机阴离子(见,例如,(4 - - - - - -6 ]审查)。TH保留tyrosine-derived氨基酸iodothyronine分子结构中的一部分,让他们被接受为基质等LNAA运输车系统L(特别是“系统L1”SLC7A5 / SLC3A2异质二聚体同种型LAT1) (7 ,8 T)和系统(MCT10;SLC16A10) [9 ]。
白色脂肪组织是一个重要的目标组织行动,脂肪形成的影响包括刺激本身(10 ),调制的脂肪酸合成通过调节脂肪生成的酶的表达(10 - - - - - -12 )和瘦素分泌的调制13 ,14 ]。TH进入大鼠脂肪细胞主要由一个系统L1-type氨基酸转运蛋白(15 ),LAT1 mRNA表达在大鼠脂肪细胞16 ]。系统L1也可能是氨基酸代谢的主要重要性的脂肪组织,这是一个网站的重要BCAA降解和利用脂肪酸、甾醇合成(17 ,18 ]。特别是系统L1衬底亮氨酸似乎参与mTOR的调制信号通路在脂肪细胞19 ]。系统L1脂肪细胞的活动和表达,及其监管的,因此可能是定量重要性全身iodothyronine和氨基酸的营业额。在目前的研究中使用3 t3-l1小鼠脂肪细胞分化[20. ,21 ),我们调查系统L1运输的机制是如何影响iodothyronines。
2。实验程序
2.1。材料
L - (2、3、4、5、6 -3 得到H]苯丙氨酸Amersham(通用电气医疗集团、绝望、英国)和L - (125年 我从PerkinElmer]三碘甲状腺氨酸(美元,英国)。细胞培养媒体获得GibcoBRL生命技术(英国佩斯利)除非另有规定;其他化学物质得到从西格玛化学品(英国多塞特郡普尔)或BDH默克公司(英国多塞特郡普尔)。
2.2。细胞培养
3 t3-l1小鼠成纤维细胞(写明ATCC cl - 173)在培养3
C, 95%空气:5%的股份有限公司2 杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM;high-glucose)和10%的供体牛血清(DBS)和1%的抗生素/抗真菌的(A / A)的解决方案。之前融合,细胞被trypsinisation resuspended然后到6 -或12-well实验板。分化成脂肪细胞(22 ),3 t3-l1成纤维细胞发展到融合(preadipocytes),然后改变了媒介与10%胎牛血清DMEM(的边后卫)和1% /解决方案/分化过程的持续时间。前两天的分化,1
g
毫升1 胰岛素,5
M isobutylmethylxanthine, 100点地塞米松也添加到媒体和随后两天1
g
毫升1 胰岛素就补充道。贴壁细胞被允许完全区分在进一步的六天,然后用实验天11或12。
2.3。(125年 我]- t3 和[3 H]苯丙氨酸的吸收
立即一个实验之前,媒体从井和吸气PBS的细胞被洗两次。传输缓冲区(121毫米氯化钠,氯化钾4.9毫米,2.5毫米MgSO4 CaCl 20毫米Tris-HCl 1毫米2 ,pH值7.4)包含L - (125年 我]- t3 30 kBq
毫升1 或L -3 kBq 18.5 H)苯丙氨酸
毫升1 和任何其他必要的化合物(例如,抑制剂)被添加到细胞中。一旦细胞被孵化的传输缓冲区指定时间段,缓冲吸气,细胞迅速洗了三次在寒冷的PBS停止吸收过程。细胞被细胞溶解在1.25毫升50 mM氢氧化钠在室温下过夜前测定放射性的液体闪烁计数并使用布拉德福德蛋白质浓度测定试剂(Biorad英国)。初步实验(数据未显示)表明,5的吸收
米(3 H]苯基丙氨酸是线性至少5分钟,因此,在所有后续的实验报道,苯丙氨酸吸收测量超过3分钟的时间。L - (125年 我]- t3 在10分钟内吸收测定(15 ]。金刚石的具体活动
pmol1 计算)的放射性示踪剂的放射性(DPM) 10
L传输缓冲区使用液体闪烁计数测量;示踪剂摄取和pmol表示
毫克的蛋白质1
10分钟。为<我>反式我>刺激研究3 t3-l1脂肪细胞在传输缓冲区包含2毫米亮氨酸preincubated 15分钟前初始PBS洗涤。
2.4。(3 H]苯丙氨酸流出
3 t3-l1细胞被预装(3 H]苯丙氨酸一段15分钟根据上述协议吸收。放射性缓冲然后吸气,细胞迅速与PBS洗了三次。(非放射性)的细胞被re-incubated传输缓冲区,其中一半时间间隔被拆除,立即补充新鲜缓冲区。在每个试验中,剩下的缓冲是吸气和细胞细胞溶解在氢氧化钠1.25毫升50毫米。孵化缓冲整除和细胞溶解产物化验了放射性物质和溶解产物也对蛋白质浓度如上所述。
2.5。RNA提取和rt - pcr
RNA是使用试剂盒从细胞中提取试剂(表达载体,普尔,英国)根据制造商的指示,resuspended RNase-free H2 通过紫外光谱法O和量化。1
0.5 g RNA是变性的存在
g OligodT(低聚糖合成服务,邓迪大学)7
C 5分钟然后使用Moloney reverse-transcribed小鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV RT) 100 U /
g RNA在25
其中包括500 L反应缓冲区
M核苷酸(Fermentas) 4
C 1小时。结果第一链cDNA被存储
2
C使用之前使用gene-specific引物PCR检测特定的信使rna表达。PCR程序中使用的引物组
LAT1向前
-tctccttgcccattgtcacc -
反向
-atgactcccaggtggtagttcc -
LAT2向前
-aagggaacccgacagcgaaacaac -
反向
-gggggaagcaggtagggaagagtg -
。
对于每一个PCR, 2
L第一链的DNA, 1
米每个引物和标准2 x GoTaq绿色PCR反应混合液(Promega)用于20
L总量。PCR项目使用的是9
C, 3分钟;[9
C, 30年代;5
C, 30年代;7
40 C, 1分钟)周期;7
C, 2分钟使用一个热科学Hybaid Px2热循环。
2.6。数据分析
数据表示为手段
S.E.米为
脂肪细胞的准备。统计学意义的吸收测量由单向方差分析来评估一个Dunnet紧随其后<我>事后我>测试。对于射流测试,Graphpad软件(美国圣地亚哥,CA)被用来确定最适合的渐变线(速率常数)明显不同于控制。差异被认为是重要的地方
。
3所示。结果
3.1。L-T3 吸收
的吸收50 nM L - (125年 我]- t3 成3 t3-l1大量饱和脂肪细胞包括组件,减少约40%在10嗯未标记的T3 (图1 )。这个饱和组件的大小(约1 - 1.2 pmol
毫克的蛋白质1
10分钟1 )在脂肪细胞和pre-adipocytes相似,尽管总吸收在pre-adipocytes高出大约50%。过量的LNAA亮氨酸(10毫米),抑制了超过80%的饱和T3 吸收(图1 )。Pre-incubation 3 t3-l1脂肪细胞在运输缓冲区包含2毫米亮氨酸15分钟(其次是快速洗PBS)导致未成年人<我>反式我>刺激增加饱和50 nM L - (125年 我]- t3 吸收(20
8.5%,
),尽管这一增长没有达到统计学意义。