文摘

杀虫剂抗性的蚊子需要一种自然的发展,安全,植物性矢量控制方法。不幸的是,没有有效的疫苗或特定的药物可用于抗击疟疾;因此,必须有针对性的直接蚊子。先前的研究已经显示对健康的好处曼佗罗,但其生物活性肽或蛋白质探索。这是第一个研究d .曼陀罗抑制蛋白质用于蚊子幼虫。本研究旨在确定纯化蚊子幼虫蛋白粗提取液的d .曼陀罗阀杆。粗蛋白分离,沉淀、透析和净化通过使用离子交换层析,本地页面,和高效液相色谱法。观察幼虫死亡率最高为5.5毫克/毫升的粗蛋白浓度。本地页面用于活性蛋白质的分析和净化。单一均匀纯化杀灭幼虫蛋白出现作为一个乐队30 kDa的sds - page。这部小说生物活性肽被电喷雾质谱质/特征。吉祥物的肽的同源性搜索的搜索引擎。所示的数据库搜索显示没有肽相似d .曼陀罗蛋白质,但与另一个植物拟南芥同源蛋白是蛋白质磷酸酶的可能。纯化蛋白的致死浓度与3^{理查德·道金斯}龄的幼虫按蚊stephensi有信用证₅₀和信用证_90年值25μ40 g / mlμ克/毫升。它展示了新的见解杀灭幼虫活动和可以用作治疗疟疾和其他蚊媒疾病的新药。

1。介绍

蜘蛛、螨、螃蟹、蜈蚣、千足虫、龙虾、昆虫和节肢动物门的所有成员,这是最大的动物王国。蚊子属于昆虫家族,他们是一个著名的向量对各种致病感染(1]。世卫组织分类蚊子的头号公敌(2]。基孔肯雅热、登革热、疟疾和丝虫病仍在许多国家主要的健康问题。蚊媒疾病正在成为传染病由于生活方式的改变和城市化,导致幼虫栖息地的扩散(3]。人类受苦受难,由于这些疾病。疟疾、黑热病、黄热病、恰加斯病,日本脑炎和锥虫病都是媒介传播疾病,每年杀死超过70000人(4]。尽管在抗击疟疾重大进展,估计有32亿人,将近一半的世界人口,分布在91个国家和地区仍然处于危险之中。疟疾夺去了409000人的生命,2019年2.29亿人患病5]。

d .曼陀罗高是一种开花植物,每年,分支和属于茄科的家庭。曼陀罗属植物在十个物种,然而,只有他们两个,曼陀罗innoxia和d .曼陀罗,有已知的药物如影响6]。植物作为杀虫剂,抗氧化,抗菌,抗癌,抗炎剂,杀灭幼虫及蚊香,抗胆碱能活性(7]。植物含有生物碱,类固醇、苷、丹宁酸、类黄酮、皂苷、阿托品,苯酚,蛋白质,碳水化合物,和脂肪,根据植物化学的分析(8]。曼佗罗乙醇叶提取物具有杀灭幼虫及其讨厌的行动按蚊stephensi和这种致倦库蚊(9]。植物已经被用于治疗人类疾病在世界各地自古以来。合成农药可能影响水、土壤和环境。植物杀虫剂是安全的,更少的有毒的,有效的,负担得起的和环保的10]。蚊子是由蛋白质来自几个植物有效控制(11- - - - - -13]。各种有毒蛋白质(凝集素,蓖麻毒素,裂口,α淀粉酶抑制剂,π)被发现在植物和杀虫活动反对各种昆虫14]。一个简短的文献研究表明,对于孤立的研究并不多,特征和净化antilarvae从植物的蛋白质d .曼陀罗抑制蛋白的特点是其特定的杀灭幼虫的活动。

目前的研究进行了分析的杀灭幼虫势干的d .曼陀罗蛋白质。茎的粗蛋白被隔离d .曼陀罗TBS缓冲区和硫酸铵沉淀。蛋白质的提取受到蚊子杀灭幼虫的生物测定根据世卫组织的指导方针。粗蛋白受到了deae纤维素柱层析法纯化和本地页面。高效液相色谱法和sds - page也执行检查提取的纯度。本机页面纯化蛋白胰蛋白酶消化和确定的LC / MS。肽通过LC / MS与吉祥物的帮助搜索和识别搜索引擎。

2。材料和方法

2.1。植物样品的收集和识别

工厂已经收集了一部分的草药花园m . d . U。、Rohtak哈里亚纳邦。植物材料的识别已经由植物分类学者Surender Yadav博士,助理教授,植物学,m . d . U。、Rohtak哈里亚纳邦。

2.2。蚊子饲养

幼虫的一个。stephensi从指出采购,新德里。蚊子的文化是保持在(26±2)°C的光周期12:12 h(光明:黑暗)insectory生物技术中心,M.D.U.、Rohtak幼虫被喂食狗粮。蛹被转移在一个小塑料碗和保存在一个蚊子笼成人出现。棉花垫水浸泡在10%葡萄糖溶液和笼子里的蚊子喂养。兔子在笼子里蚊子食血。蚊子产卵,一个塑料肠含有滤纸的边界与水浸是关在笼子里。

2.3。优化不同的蛋白质缓冲来获取更高的收益

总蛋白提取通过使用不同的缓冲区,(a)磷酸盐缓冲剂(50毫米,pH值7.8);(b)醋酸钠缓冲(50毫米,pH值5.5);(c)三羟甲基氨基甲烷缓冲液(0.1 M, pH值7.5);(d)三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐(50毫米,pH值7.5),获得更高收益率的蛋白质。

2.4。从干细胞中提取蛋白质

收集到的植物是首先用自来水洗净,然后用蒸馏水和保持阴影在室温下干燥。样品是粉末的帮助下一个电磨机和液氮。总蛋白的提取是提取缓冲三羟甲基氨基甲烷缓冲液的使用生理盐水(50毫米Tris-HCl (pH值7.5),150毫米氯化钠,和聚乙烯吡咯烷)略微修改提取比例的缓冲区。提取总蛋白被隔离在一个缓冲区的比率1:7 (w / v)。样品和2̶3层棉布过滤,滤液样品一直在4°C磁搅拌过夜。样品在13000 rpm离心机30分钟在4°C。上层清液收集和颗粒都被丢弃。

2.5。蛋白质沉淀

粗蛋白提取通过三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐和沉淀了不同饱和度最初百分比20%,30 - 40%,50 - 60%,70 - 80%,90 - 100%的硫酸铵。80%的饱和硫酸铵溶液离心后给了一个优质球在4°C 13000 30分钟。上层清液的沉淀与饱和硫酸铵80%,和样品保存在−20°C一夜之间完全沉淀的蛋白质。第二天早上样本离心机在14000 rpm 30分钟在4°C,上层清液被丢弃,颗粒与丙酮洗5̶6倍样品是干的。蛋白质样本对蒸馏水透析24小时在4°C。蛋白质样品保存在−20°C进行进一步的生物测定和净化。

2.6。蛋白定量

的总蛋白质含量计算的孤立样本标准布拉德福德法通过紫外分光光度计波长在595 (15]。BSA作为标准储备溶液1毫克/毫升。

2.7。杀灭幼虫的生物测定

进行了杀灭幼虫的生物测定使用第三龄幼虫一个。stephensi根据世卫组织的指导方针16]。十个幼虫的3^{理查德·道金斯}龄阶段被放置在一个塑料碗包含水(99毫升)和测试解决方案(1毫升),100毫升的最后一卷。6个不同浓度的粗蛋白提取(0.172,0.34,0.68,1.37,2.75,和5.5毫克/毫升)和纯化蛋白(10年,20年,30、40、50、60μg / ml)准备从蛋白质提取的储备溶液与蒸馏水和用于生物测定。幼虫死亡率监测后24、48和72小时。与三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐控制设置。实验进行了一式三份。

2.8。deae纤维素柱色谱分离

蛋白质纯化了IEC(离子交换色谱法)。透析蛋白质样本显示较高杀灭幼虫活动受到了净化用离子交换色谱法通过蛋白质通过deae纤维素列。冻干样本蛋白质溶解在Tris-HCl(50毫米;pH值7.5)和加载到deae纤维素列在0.5毫升/分钟的流量。释放的蛋白质与Tris-HCl筛选了(50毫米;pH值7.5),和绑定蛋白相同的缓冲区的梯度眠氯化钠(0.0 - -0.5米)。游离和结合蛋白在无菌收集管。不同数量的分数从所有样本,收集和他们进行杀灭幼虫的活性检测使用协议生物测定。这些分数显示杀灭幼虫活动汇集在一起,透析Tris-HCl缓冲区。透析样本冻干和储存在−20°C和进一步杀灭幼虫的测试分析。

2.9。制备原生页面

蛋白质分数获得deae纤维素柱层析法具有最高的杀灭幼虫活动分析制备原生页面(17]。进行电泳Bio-Rad叠加凝胶凝胶板通过使用5%和12%解决凝胶。测试样品中可溶性样品缓冲和加载的凝胶,50 V,电流是首先应用然后150 V的供应。当染料到达底部,电源关闭,这种凝胶在考马斯亮蓝g - 250染色溶液在4°C隔夜用颤抖的。早上,凝胶使退色,我们可视化乐队。标准的蛋白质标记被用来确定测试样品的分子量。蛋白质的一小部分被切断从凝胶的帮助下无菌叶片和保存在一个完全删除染料使脱色的解决方案。凝胶的蛋白质筛选了由冷研钵和研杵磨,泥浆被绑在透析和凝胶膜。透析膜的沉浸在一个本地页面缓冲区和运行1 h。膜的样本收集和离心机在4°C 12500 rpm 30分钟。 The protein was present in the supernatant and used for purity and larvicidal bioassay.

2.10。高效液相色谱分析

纯化蛋白的同质性分析通过使用安捷伦1100高效液相色谱(HPLC)(美国安捷伦科技)C18柱(USCFX03064 EC-C18, 2.7μ美国米,3.0×100毫米)所描述的施瓦兹(18]。60μg混合后的样本准备DDT,甲醇,水和年级的女士。样品在黑暗中孕育了30分钟,装上高效液相色谱法。峰保留时间的观察分钟正好恰逢Tris-HCl缓冲区的最初溶解的蛋白质。样品的色谱图的空白被用于分析。

2.11。通过sds - page分子质量测定

纯化蛋白在sds - page凝胶电泳和蛋白质分子量标准标记(美国Bio-Rad)。纯化蛋白的分子量决定通过与考马斯亮蓝染色,比较乐队以及一个标准的蛋白质标记。

2.12。电喷雾质谱质/分析

电喷雾质谱质/ (ESI-QUAD-TOF)分析证实蛋白质的纯度。从凝胶纯化蛋白乐队被切断的帮助下无菌手术刀片和投入鄙视的解决方案并受胰蛋白酶消化。胰蛋白酶消化肽被电喷雾质谱质/确认。

2.13。蛋白质识别

通过吉祥物搜索引擎(矩阵科学),肽肽进行匹配和识别。MS和MS / MS数据提交给吉祥物搜索程序(https://www.matrixscience.com/)。搜索也使用Swiss-Prot NCBI数据库,执行限制Viridiplantae(绿色植物)。搜索条件建立了考虑羧甲基(C)修改的变更固定效应和蛋氨酸作为变量的氧化效果。胰蛋白酶水解,可能损失的裂解位点被认为是,和宽容的肽片段大众±0.3哒。

2.14。统计分析

这些数据受到probit分析计算LC₅₀,信用证_90年、95%置信上限R平方值。所有的实验进行了一式三份。Microsoft Excel 2007软件版本是用于统计分析。死亡率的帮助纠正了雅培的修正公式19]。

3所示。结果

3.1。优化不同的缓冲区更高收益率的蛋白质

总蛋白提取通过使用不同的缓冲区:(a)磷酸盐缓冲剂(50毫米,pH值7.8),(b)醋酸钠缓冲(50毫米,pH值5.5),(c)三羟甲基氨基甲烷缓冲液(0.1米,pH值7.5),(d)和三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐(50毫米,pH值7.5),如表所示1。但是一个更高比例的收益率与三羟甲基氨基甲烷缓冲液提取获得了盐水。然后,三羟甲基氨基甲烷缓冲液的蛋白质分离使用盐水提取干细胞的缓冲d .曼陀罗。

3.2。筛选杀灭幼虫蛋白质提取的植物茎

从干细胞中提取的蛋白质d .曼陀罗是筛查蚊虫杀灭幼虫活动使用世卫组织协议对3^{理查德·道金斯}龄的幼虫一个。stephensi。净化的第一步是由与硫酸铵沉淀,和蛋白质分离与70 - 80%硫酸铵被用于测试杀灭幼虫的活动。部分纯化硫酸铵提取和透析蛋白显示80 - 90%死亡率5.5毫克/毫升的浓度后48 h。表2显示死亡率百分比在不同系列稀释后浓度从0.172到5.5毫克/毫升的粗蛋白提取和纯化蛋白在不同浓度(10到60)μ克/毫升。幼虫死亡率在不同浓度的蛋白质中以图形的方式显示数据1和2。LC₅₀和信用证_90年值的第三龄幼虫的植物蛋白质一个。stephensi经过48小时的接触如表所示3。死亡率成正比的速度增加浓度剂量。之间存在相关性的饱和沉淀和蛋白质的分子质量。较小饱和沉淀蛋白质的分子质量更高和更高的饱和沉淀的低分子质量的蛋白质。在目前的研究中,高杀灭幼虫活动观察粗蛋白提取浓度为5.5毫克/毫升。死亡率的帮助纠正了雅培的修正公式。LC₅₀和信用证_90年值的第三龄幼虫的植物蛋白质一个。stephensi72 h后接触如表所示3。

3.3。由deae纤维素柱层析法纯化的蛋白质

死亡率最高的粗蛋白提取用于进一步净化deae纤维素离子交换色谱法(阴离子)。总共35分数收集每个如图1毫升示例3,每个分数是检测杀灭幼虫的生物测定使用协议。幼虫死亡率为20%,10%,25%,10%,30%,25%是观察在不同筛选了部分数字6尺11寸。活动分数6尺11寸汇集在一起和透析TBS (pH值7.5)和冻干。蛋白质产量的比例色谱样品获得了4.2%,如表所示4。池活性蛋白质分数显示90%杀灭幼虫的潜在60的浓度μ克/毫升,如图2。蛋白质分数只有一个峰值,如图3,这清楚地表明,干的d .曼陀罗只有一个杀灭幼虫蛋白质。进一步净化进行确认的存在同质蛋白质筛选了分数。

3.4。杀灭幼虫蛋白质的纯化制备原生页面

本机页面做了分析粗蛋白的存在和纯化蛋白质存在于干的d .曼陀罗。单一蛋白质乐队从本地页面观察凝胶,如图4。这种纯化单一蛋白杀灭幼虫的活动,和这个乐队是筛选了凝胶的电渗析方法。制备获得的收益率为2.2%的总百分比本地页面,如表所示4。纯化蛋白是用于杀灭幼虫的生物测定对幼虫一个。stephensi和进一步的分子鉴定。纯化蛋白的分子质量被推断流动值(计算射频值)的纯化蛋白的相对流动值标准分子量蛋白质(图4)。

3.5。高效液相色谱分析

高效液相色谱技术用于分离单个化合物从组件基于峰值分析的混合物。纯化蛋白的同质性分析了使用高效液相色谱法和峰纯度分析,而单峰值观测属于纯化蛋白纯度高的指数。它显示只有一个峰值,证实蛋白质是100%纯的,没有任何杂质。色谱图显示两座山峰一个峰保留时间的最小值代表纯化蛋白的存在,另一个峰的保留时间最小值代表的三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐蛋白质溶解。色谱图清楚地表明存在一个峰值,证实蛋白质100%纯(图5)。

3.6。质量的决心通过sds - page

sds - page显示一个单一的同质乐队出现在凝胶。纯化蛋白的分子质量测定30 kDa(图6)。

3.7。质/ MS分析

纯化蛋白分离D。曼陀罗用胰蛋白酶消化,并受到质/谱分析获得的肽。质谱(图7)与吉祥物的搜索引擎进行搜索匹配,和肽被确定如表所示5。纯化肽没有显示相似的d .曼陀罗蛋白质。纯化肽(R.LVAKAAAR.A)显示相似的蛋白质磷酸酶拟南芥如表所示5。蛋白质NCBI blast还显示最大相似性的磷酸酶蛋白拟南芥。的完整基因组序列d .曼陀罗带注释的信息直到现在不在。这可能是某些如缺乏相似的原因。

4所示。讨论

寻找幼虫植物来源的蛋白质是一种新方法来对抗矢量控制和蛋白质药物的配方。植物蛋白已报告在许多生物活性,包括抗菌、antilarvicidal和抗病毒属性(20.- - - - - -22]。考虑蛋白质纯化Myracrodruon urundeuva叶,它表现出信用证₅₀值为0.202毫克/毫升埃及伊蚊幼虫(23]。从樟脑种子类型IInd RIP (樟树)信用证₅₀值168 ppm的幼虫库蚊皮平pallens(24]。ApTI蛋白质的生物学效应埃及伊蚊幼虫存活率下降是治疗96 h后,分别从93.08±5.01%至69.22±10.88%。1毫克/毫升ApTI,死亡率为100%,而对照组的死亡率达到了最高的10%25]。一种方法来减少蚊子种群包括打断蚊子的生命周期在幼虫阶段(26]。合成杀幼虫剂相比,自然杀幼虫剂有害水生生物和环境由于其疏水性。按蚊stephensi据报道容易和LC双硫磷在印度吗₅₀范围0.008 - -0.015 ppm (27- - - - - -29日]。在过去的三十年中,双硫磷,有机磷化合物,被认为是一个安全的杀幼虫剂(LC₅₀= 8600 mg / l)的矢量控制程序(30.]。有报道称,阻力等杀虫剂DDT, diledrin,马拉松一个。stephensi,以及一些对拟除虫菊酯的耐药性在当前年的迹象31日,32]。另一项研究在双硫磷揭示了信用证₅₀0.0523 ppm和LC的价值_90年0.3822 ppm的价值一个。stephensi(33]。谁提出了一个双硫磷剂量杀1 ppm的水体。我们的研究结果有信用证₅₀和信用证_90年值20μ40 g / mlμ克/毫升的纯化蛋白一个。stephensi幼虫,它是一个可接受的剂量根据其他杀幼虫剂化合物。Swathi et al ., 2012年,报道,ethanolic提取的曼佗罗叶子显示LD₅₀(86.2518 ppm)和LD_90年(196.389 ppm)埃及伊蚊华夏基金₅₀(16.0783 ppm)和LD_90年(41.9599 ppm),(比如按蚊)和LD₅₀(6.25 ppm)和LD_90年(11.25 ppm)这种致倦库蚊。的根中提取d .曼陀罗有100%的死亡率治疗24小时后在100%浓度(34]。曼佗罗和烟草tabaccum杀灭幼虫的属性和高可以作为环境友好型和可持续的杀虫剂来控制蚊子(35]。ethanolic叶提取的d .曼陀罗有信用证₅₀3.29 ppm和信用证_90年55.25和正己烷LC较低₅₀2.52 ppm和信用证_90年值为30.51 ppmc . quenquifaciatus幼虫。分数的毒性DSEE-F1叶中提取的d .曼陀罗显示的最大活动99%在100 ppm 24小时后这种致倦c .,第三、四龄幼虫(36]。有效的死亡率在93%至25 ppm找到治疗24小时后最低的信用证₅₀和信用证_90年值分别为4.390 ppm, 6.957 ppm。小说20.9 kDa抗菌蛋白质纯化的幼苗紫荆花紫竹和表现出强大的抗菌活性蜡样芽胞杆菌和大肠杆菌。麦克风(最低抑制浓度)纯化蛋白13岁μ克/毫升,15μg / ml对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌(37]。本机亚马逊的蛋白质纯化和鉴定物种表现出抗真菌活性(38]。在目前的研究中,蛋白质分离,纯化,干细胞的特征d .曼陀罗表现出对杀灭幼虫的活性一个。stephensi。纯化蛋白显示90%的死亡率在40μ克/毫升。一群30 kDa的sds - page凝胶。高效液相色谱单峰值结果表明蛋白质在一个同质的阶段。的纯化蛋白受到胰蛋白酶消化和被质/女士。身份和同源性的蛋白质被吉祥物检查搜索引擎。纯化蛋白不显示相同的d .曼陀罗蛋白质。蛋白质的同源性与植物的蛋白质磷酸酶拟南芥。因此,这部小说肽被干的d .曼陀罗。LC₅₀和信用证_90年的纯化蛋白值分别为0.025和0.04毫克/毫升。植物蛋白磷酸酶催化活性的去磷酸化的磷蛋白质39]。在激活磷酸基是重要的蛋白质,蛋白质可以执行特定的功能细胞。植物蛋白磷酸酶的作用压力信号,对病原的防御机制,但是完整的研究他们的机制仍然未知的40]。杀灭幼虫分离出蛋白质的活动可能是因为蚊子脱磷酸化的酶代谢活动,负责免疫力,生存等。

5。结论

在先前的研究中,d .曼陀罗植物提取物有蚊子,杀灭幼虫和抵抗性活动一个。stephensi,埃及伊蚊,和这种致倦库蚊在低浓度的致命剂量。这是第一个研究报告d .曼陀罗蛋白质对幼虫的使用一个。stephensi。目前的研究表明,纯化蛋白磷酸酶d .曼陀罗能够杀死蚊子幼虫的一个。stephensi。磷酸酶的活性蛋白质的机制可能涉及的蚊子酶脱磷酸作用杀死幼虫。纯化蛋白有90%的死亡率低剂量的信用证₅₀25μg / ml和LC_90年40μ克/毫升。本研究还发现了一个新杀灭幼虫30 kDa的蛋白质d .曼陀罗阀杆。这种蛋白质可用于制定安全,自然,植物性灭蚊的蚊媒疾病的控制没有生态系统失去平衡。进一步的研究也需要检查这个孤立的蛋白质的酶的活动。

数据可用性

上可用的数据将被有效的请求到相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

可收集数据并写了初稿,NS和SPS审查和编辑的手稿。

确认

这项研究是由大学研究奖学金提供给Manisha Kirar。