移动生物安全实验室的现场部署揭示了登革热病毒1血清型和2血清型的共循环，塞内加尔卢加市，2017年

抽象的

登革病毒(DENV)是全球最流行的虫媒病毒威胁。本病毒属于属黄病毒，Flaviviridae.家庭，负责广泛的临床表现，从无症状或轻度发热疾病（登革热）到危及生命的感染（严重登革热）。自1970年以来，塞内加尔发生了许多零星案件和爆发。然而，本文介绍了2017年9月5日至2017年9月5日至2017年12月17日在2017年9月5日至2017年12月17日之间进行了实地调查，通过部署移动生物安全实验室（MBS-Lab）。总体而言，通过实时RT-PCR在该领域中收集和测试960人血清，并通过实时RT-PCR在该病毒RNA中进行测试。血清型，完整的排序E还进行基因和系统发育分析。在960例疑似病例中，131例确认登革热病例。大多数确诊案件来自Louga社区。血清型明显揭示了两种血清型，登革热1（100/104; 96,15％）和登革热2（04/104; 3,84％）。获得的结果指示的序列的系统发育分析，所述登革热1菌株密切相关的在2013年（KX380803.1）爆发分离，分别在新加坡（亚洲）的菌株，并将其与来自布基纳法索密切相关的菌株登革2应变cocirculated2016年登革热爆发（KY62776.1）。我们的结果表明，在短时间内，在一次爆发期间，两种登革热病毒血清型的协同循环。这种协同循环突出了改善监测的需要，以防止未来的潜在严重的登革修病例通过抗体依赖性增强（ADE）。有趣的是，它还证明了MBS-LAB的可靠性和有用性，以便在需要的需求下进行有利疫情反应，这允许提前案件管理。

1.介绍

登革热病毒（DENV）是一种蚊子传播的病毒，是全世界热带和亚热带地区最重要的虫媒病毒病原体，全球近三分之一的人口面临感染风险[1]．自1950年以来，丹佛全球出现，每年感染约4亿人[2]．该病毒具有阳性单链RNA，属于属黄病毒，Flaviviridae.家庭(3.]．

登革热包括多种临床综合征，从流感样症状到严重疾病[4]，病死率为1-5% [5]．

描述了两种不同的病毒传播循环:一种是森林循环，涉及树上的蚊子和非人类灵长类动物;另一种是流行循环，涉及人类和家养/圈养的蚊子[6]．AEDES.蚊子，主要是蚊子埃及伊蚊，是全世界登革热爆发的主要矢量[7]该病毒存在于四种抗原不同的血清型中，共有约65%的基因组相似性，可细分为不同的系统发育基因型。亚洲地区占所有报告病例的70%[2]．有趣的是，所有登革热血清型都是在马来西亚等亚洲国家报告的，这些国家经常爆发登革热。

非洲对登革热的流行病学了解不多，该病毒被认为是罕见的[8]．这种低估主要是由于缺乏监测，他人存在普遍的发热疾病作为疟疾，缺乏诊断工具[9]．然而，研究表明，早在1926年，登革热就在非洲大陆存在[10]．在桑给巴尔、布基纳法索、南非和塞内加尔报道了许多流行病。事实上，从1960年到2010年，20个实验室证实了非洲大陆15个不同国家爆发了登革热[8]．最近，许多非洲国家经历了疫情，如2013年的安哥拉、2016年的布基纳法索和2017年的Côte d ' ivory [11，12]许多因素，包括无计划的城市化和气候变化，都可能通过有利于病媒侵扰而影响世界范围的出现[13]．

在塞内加尔，登革热首先在班迪亚区域分离在1970年[14]．之后，几项研究专注于登革热的流行病学。自20世纪80年代以来，据报道，少数人造成的丹佛血清型2和4造成的病例[14，15]特别令人感兴趣的是DENV-2在该国东南部地区的地方性传播。病毒学和昆虫学监测数据显示出流行性疾病和很少的人类病例。DENV-2在森林地区表现出一个涉及灵长类动物和该属野生蚊子的分支传播循环AEDES.（Ae。luteocephalus，Ae。Taylori.，及Ae。furcifer） [16]．1981年、1990年和1999年，该地区DENV-2的流行期与8 ~ 9年的沉默期交替[16]．1999年首次分离到DENV-2埃及伊蚊［17]，主要已知的Denv-2的载体Ae。furcifer和Ae。luteocephalus．丹佛2的孤立埃及伊蚊表示该地区登革热流行病的风险。Denv-2的Sylvatic循环也被检测到在其他西非国家：Côtedoire，布基纳法索，几内亚和尼日利亚[15，16，18]．在塞内加尔，Sylvatic循环仅针对Denv-2观察到，而在其他国家，特别是在亚洲，血清型Denv-1和Denv-4也涉及[19]．

登革热在塞内加尔重新出现在塞内加尔2009年的丹佛3流行病，这是在塞内加尔或西非以前从未检测过的血清型。2010年进行的一项研究表明，在塞内加尔患者中发现了Denv-3，其患有出血性登革热的迹象，返回意大利[20.]．DENV-3也在其他非洲国家出现，包括2009年在佛得角发现的，在那里它导致了该地区有记录的首次登革热流行[4]．血清型1，可能的话，是循环;在1979年，当两个菌株分别从两个病例和血清学研究表明分离在班迪亚，塞内加尔的西部抗DENV-1抗体的21.5％的患病率。DENV-1抗体的高患病率也在1981年和1982年之间在图巴，考拉克和Mekhe基孔肯雅病毒（CHIKV）和黄热病病毒（YFV）流行时的报道。血清型4塞内加尔只报在仍有待澄清的情况下[21]．

2017年9月，在塞内加尔西北部的洛加市发生了不明原因的发热病例暴发。已将样本运往达喀尔巴斯德研究所(IPD)的世卫组织虫媒病毒参考合作中心(WHOCC)进行实验室诊断，检测结果显示DENV在传播。在确认之后，在2017年9月5日至12月17日期间部署了一个移动生物安全实验室(MBS-Lab)，对疫情进行流行病学和病毒学现场调查。

本文介绍了利用卡车实验室对疑似DENV病例进行现场分子调查的暴发调查和结果，以及分离菌株的血清型和系统发育特征。

2。材料和方法

2.1.疫情通知和移动生物安全实验室（MBS实验室）部署

在塞内加尔通报大量发热病例作为持续的综合征哨点监测网络(4S网络)的一部分之后[22在塞内加尔西北部的Louga市(15°39′n, 16°21′w)采集了53份疟疾阴性血液样本，并通过快速诊断试剂盒(RDTs)进行了检测(图)1)2017年9月5日至2017年10月10日期间。样本被送往达喀尔巴斯德研究所（IPD）的世界卫生组织虫媒病毒和出血热病毒检测中心，以调查可能的虫媒病毒病因。从血清中提取RNA并检测5种虫媒病毒，包括登革热病毒（DENV）、基孔肯亚病毒（CHIKV）黄热病病毒（YFV）、裂谷热病毒（RVFV）和寨卡病毒（ZIKV）[23只有DENV给出了肯定的结果。

为了遏制越来越多的发热病例，这是日常检测和早期报告登革热案件，移动卡车实验室于10月24日部署到该领域，从位于IPD之后的IPD的群道病毒和血液腐败热病毒实验室塞内加尔卫生部（莫赫）。

事实上，这次登革热爆发是一次测试可靠性和评估基于卡车的MBS实验室使用情况的机会[24]用于在疑似患者中对登革热病毒进行分子检测，直接在现场进行，而不需要将收集的样本运往参考实验室。MBS-Lab由Praesens基金会在比利时建立[24]并于9月份带到IPD，达喀尔，塞内加尔。

mbs -实验室设有一个负压生物安全隔离器，因此为处理不同种类的病原体提供了一个安全的环境，从而消除了对高封闭实验室设施所需的个人防护设备的需要[24]此外，在MBS实验室集成的Smartcycler设备（美国加利福尼亚州森尼维尔造父变星）上，按照特定的工作流程，执行DENV检测和血清分型的实时PCR检测系统（图1）2）.

2.2。患者选择

根据对病例定义的标准WHO指南[4]，临床怀疑非严重登革热(有或无警告迹象)的定义是急性发热(>38.5°C)和以下至少两种症状:严重头痛、眶后痛、恶心、呕吐、肌肉和关节痛、皮疹或白细胞减少，而严重登革热(severe dengue, SD)定义为NSD合并出血、血浆渗漏和器官衰竭[25].与洛加市医疗中心的医生合作，所有因发热疾病或持续2至7天的发热史寻求医疗护理且符合病例定义的患者均被纳入研究，共5名 将ml静脉血样本收集到干管中。为每位患者填写一份标准化的访谈表，包括临床表现和人口统计学数据。任何符合病例定义且经DENV qRT PCR检测呈阳性的受试者均被定义为确诊病例。

２.３.RNA提取

来自符合条件的患者(疑似病例;符合临床标准的任何受试者)。从140个样本中提取病毒RNAμ.人血清的升根据制造商的说明书，使用QIAmp病毒RNA试剂盒（Qiagen，德国希尔登）。RNA是在60洗脱 μ.l洗脱缓冲液。

２.４.RT-qPCR检测

为确定疑似病例是否感染登革热，确定血清型，直接在现场对提取的RNA样本进行实时RT-qPCR。分别使用[26]和TibMolBiol模块化DX登革热分型试剂盒（目录号40-0700-24）都使用搭载了MBS-实验室的SmartCycler®II（Cepheid公司-USA）的广达toughMix。Briefly, dengue virus detection was performed using the following temperature profile: reverse transcription (RT) at 50°C for 10 min, activation at 95°C for 5 min, and 40 cycles of 2-step PCR at 95°C for 15 sec and 60°C for 30 sec. This optimised protocol allows for the detection of positive cases in less than one hour. All samples with a cycle threshold (Ct) value within the defined cut-off (Ct < 35) were considered as positive.

2.5.测序和系统发育分析

预定义血清型样本的随机选择用于Sanger测序。用于cDNA合成，10 μ.L的病毒RNA与1混合 μ.l of the random hexamer primer (2 pmol) and the mixture was heated at 95°C for 2 min. Reverse transcription was performed in a 20 μ.L含有2.5%混合物的反应混合物 U RNasin（美国麦迪逊Promega），1 μ.L脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)(每个dNTP 10 mM)， 5 U AMV逆转录酶(Promega, Madison, USA)， 42°C孵育60 min。PCR产物由[27，28它允许放大重叠的完整片段EDENV-1和DENV-2基因。5微升的cDNA与10μ.l 10×缓冲液，3 μ.每种底漆的l，5 μ.1 . dNTPs10 mMμ.l的MgCl2和0.5μ.L GOTAQ聚合酶（Promega，Madison，USA）。使用Qiaquick Spin PCR纯化试剂盒（QIAGEN）纯化所获得的扩增子，并在使用相同的PCR引物使用ABI 377自动定序器（Applied Biosystems），提交用于双向测序的双向测序。使用压花合并软件合并获得的序列，并使用基本的局部对准工具分析最终结果（BLAST，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).核苷酸序列比对是使用Mega版本6中实施的ClustalW算法生成的[29]．

代表性Denv-1和Denv-2从Genbank下载并使用Mega软件中实现的Clustalw算法与所获得的序列对齐。使用IQ-tree推断每个血清型的最大可能性（ml）树[30.]．

2.6。道德的考虑

塞内加尔卫生部全国伦理委员会批准了监测方案，认为这是一项风险低于最低水平的研究，不需要书面同意表格。根据卫生部塞内加尔国家道德委员会的要求，所有患者或本研究中包括的未成年人的父母/监护人均口头同意参与。在整个研究过程中，该数据库与塞内加尔卫生和预防部流行病学司共享，以便采取适当的公共卫生行动。

2.7.统计分析

使用统计学方法分析研究人群在登革热疑似病例和确诊病例之间的人口学和临床特征χ²-测试或者Fisher的测试。采用Kruskal-Wallis检验对登革热疑似病例和确诊病例进行平均年龄和平均抽样延迟比较。一个值<0.05认为有统计学意义。计算每种模式的DENV患病率。

结果

3.1.人口特征和流行病学

从05年9月至2017年12月17日，共有960个血清样品在整个卢加市8个地点从谁被怀疑有感染登革病毒患者采集。爆发开始在流行病学周39和47周结束;确诊病例DENV最高的44号周期间记录（图3.)。大多数样本是从包括DS Louga在内的Louga市的各个地区（DS）采集的(n= 485)、大柔霉病(n= 197)， DS Dahra (n= 125)。DENV总感染率为13.64%(131/960)。报告疑似病例1例以上的8个地区中，Kebemer县、Linguere县和Sakal县未发现确诊病例。确诊病例为80.15% (n = 105/131) was from Louga district and 9.16% (n = 12/131），而Koki记录的病例最少，只有两例确诊（1.52%）（表1）1）.在疑似登革热病例中，447名（46.52％）是男性（米)女性513例（53.43%） : 阳性病例的F性别比为1.14（70名男性，61名女性）。根据性别，DENV-1阳性率没有显著差异( ；Pearson的χ²以及)(表1）.表格1显示按年龄组重新划分的病例总数。确诊病例以10- 20岁年龄组(47.6%)居多，其次为20-30岁年龄组(27.8%)，40-50岁年龄组登革热病毒阳性率最低(3.2%)。不同年龄组的登革热确诊率差异显著( ；Pearson的χ²以及)。

3.2.临床表现

在DENV感染暴发期间，所有疑似病例的临床表现为发热，其次是头痛(90%)。其他常见的临床特征为关节痛(61.66%)和肌痛(44.89%)1）.

３．３．传播登革热病毒血清型

为了定义循环血清型，使用实时RT-QPCR对104个登革热阳性样品进行血清型（表2）.我们发现Denv-1（100/104; 96.2％）作为这种爆发期间的显性血清型，其次是Denv-2（04/104; 3.8％）。没有发现Denv-3或DenV-4的病例。

3.4。系统发育推断

完整的系统发育分析E在疫情期间检测到的登革热血清型1和2的一个子集的基因表明，登革热2型分离物与布基纳法索2016年疫情的菌株（KY627777）聚集在一起，属于世界性基因型。另一方面，登革热1型血清型与新加坡分离的菌株（KX380803）聚集在一起2013年属于基因型V（图4）.

4。讨论

全世界每年估计有5000万人感染登革热病毒，使其成为世界上最常见的蚊媒病毒[4]．的情况下，约8％至100％导致症状的感染[31.]．这种虫媒病毒感染的致死率约为1% [32.]通过早期诊断指导适当的管理可以大大减少[33.]。关于登革热在塞内加尔人群中的影响以及登革热爆发的机制，目前几乎没有可用的信息。目前的研究报告了登革热1型和2型在塞内加尔的流行，这是在上一次报告的登革热流行8年后由3型登革热引起的[34.]．对这一流行病进行了16周的监测，有960例疑似病例，其中131例确诊。10 ~ 20岁人群以登革热感染病例为主(47.6%);然而，男性和女性的感染率相同( ；Pearson的χ²以及)。Günther及其同事在南美洲观察到了类似的趋势[35.]在张和他的同事在台湾进行的一项研究中[36.].在柬埔寨、斯里兰卡、新加坡和菲律宾进行的几项研究[37.- - - - - -39.]的报告指出，男性似乎较女性更容易感染DENV，这可能是由于男性较多的户外工作习惯，增加了他们被蚊子叮咬的机会[40].需要进行大样本研究，并结合分子和血清学调查，以确认感染率中可能存在的性别差异。

观察到的最常见症状是发热、头痛、关节痛和肌痛。在马来西亚进行的一项研究也发现了相同的临床表现趋势[41.]．否则，发烧是导致病人就医的最常见症状[42.]．实际上，急性发育集发作是由各种细菌，寄生和病毒病原体引起的，并且对这些药剂的感染导致患有登革热样症状的患者[43.]．由于在资源匮乏的环境中缺乏准确、快速和负担得起的诊断技术，对发热病因的鉴别诊断受到了阻碍[44.，45.]．缺乏认识和有效监测表明，登革热在非洲可能被认识不足和报告不足[8]．从非洲返回欧洲的旅客是发现国外发生的未报告疫情的有效岗哨[46.]2009年10月，意大利都灵记录了一例DENV-3病例，患者从卢加市返回[34.，47.]。为了克服这一鉴别诊断的差距，迫切需要能力，这是评估非洲登革热发病率的关键步骤。最近一项基于重组酶聚合酶扩增（RPA）的流动实验室对非疟疾发热性疾病的病因进行的研究，允许在达喀尔郊区对三例散发性DENV-1病例进行分子检测[23]．此外，在塞内加尔2009年DENV-3城市流行期间进行的一项研究表明，Louga地区有高密度的登革热病毒埃及伊蚊蚊子[34.]，是热带和亚热带地区DENV的主要传播媒介[48.]．这一事实与人口增长和无计划的城市化相结合，对该地区登革热爆发发生的危险因素。

这次实地调查也是一个有趣的机会，以测试MBS-Lab在距参考实验室约200公里的地区及时开展疫情调查反应方面的作用。对于以前的大多数疫情调查，获得结果的周转时间可能需要数天。Louga地区距离达喀尔巴斯德研究所世界卫生组织(世卫组织)虫媒病毒和出血热病毒参考中心222,8公里;运送样本大约需要5小时，每天都需要这样做，以便及时诊断新的登革热疑似病例，并在至少24小时内获得结果。在本研究中，MBS-Lab的安装是为了在1小时内接收Louga市附近采集的样品，以便立即处理，并在收到样品后2小时内发送结果。

我们的分子设置允许的登革热病例的检测1小时（不考虑样品前处理和提取步骤）内，并给当地医务人员对早期病例管理，这是众所周知的改善预后结果的直接报告。

在该领域进行的血清型显示Denv-1（100/104）和Denv-2的优势在很少的情况下（04/104），患者没有学习的患者中没有共感染。具有多种血清型的共同感染可能会在给定人群中共血液循环时高得多49.]这就有可能出现具有不同特性的重组病毒株[50.]．

加蓬的研究[51.]和印度[49.，52.[揭示了观察到多于一种血清型同时循环的区域更容易发生严重的DENV感染。鉴于上述风险，通过分子监测循环血清型的早期检测对于对照和准备至关重要。

系统发育分析表明，分离株分别属于DENV-1基因型V和DENV-2世界性基因型。这些菌株与2013年在新加坡发现的分离株密切相关[53.]在布基纳法索爆发DENV-2疫情期间[54.]桥本先生及其同事[55.]报告了与布基纳法索至日本有关的输入性DENV-2病例，并强调了布基纳法索毒株已蔓延至世界其他地区[56.]．

我们的研究还突出了非洲内部布基纳法索菌群的蔓延。这一发现表明，在同样的爆发过程中，两种Denv血清型的共同循环，并提出了塞内加尔的增加的城市Denv活性，如Faye和同事所建议的[34.]，即使在此次暴发期间没有报告DENV-1/DENV-2合并感染。在卢加报告病例后，需要采取监测和控制措施，以防止DENV在邻近地区传播。

4．1.本研究的局限性

总体而言，在卢加市这个登革病毒疫情调查过程中，我们评估了在塞内加尔首次基于卡车移动实验室应对流行病的目的。这构成了在需要的点上早期病例管理和诊断积极影响的重要和相关的公共卫生工具。尽管MBS-实验室的可靠性，可以举出与研究需要相关的一些限制。首先，在研究过程中，我们只专注于疑似病例中的分子检测登革病毒RNA，但没有NS1抗原检测和非IgM抗体进行了评估对疑似病例。已知的是提供了登革病毒感染的诊断一宽的窗口，NS1抗原检测是急性疾病的一个很好的标志物。在这种情况下，负登革病毒PCR并不意味着不存在感染，并可能导致流行期间的实际数量登革热病例可能低估。有趣的是，NS1检测和IgM检测的组合被示出为具有胜过PCR诊断的潜力。其次，疫情调查过程中，只有登革病毒是有针对性的，但大量的发热情况是不是由于登革病毒（960分之829; 86.35％）表示可能的其它病原体和呼叫协流通系统的区分诊断或病征处理，以避免由具有类似临床症状的病毒引起的暴发神秘。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

作者真诚地感谢达喀尔巴斯德研究所病毒学部门团队和塞内加尔卫生部支持这项研究。PMAZ得到了巴西国家科学技术发展委员会(CNPq)(拨款441105/2016-5)和São保罗研究基金会(FAPESP)(拨款2017/23281-6)的支持。PMAZ, AAS和OF也得到了Fiocruz/Pasteur/USP(314502)的支持。我们感谢西非感染病原体细胞生物学中心(WACCBIP)的Osbourne Quaye博士的审查和建议。

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