检测杜氏利什曼虫DNA在Field-Caught Phlebotomine白蛉(双翅目:毛蠓科)在库鲁内格勒区三个皮肤利什曼病流行焦点,斯里兰卡

文摘

利什曼病是一种寄生虫感染通过女性phlebotomine沙蝇的叮咬传播。显微镜是黄金标准检测寄生虫在白蛉和向量连累。然而,分子检测已成为如今的识别更受欢迎利什曼虫寄生虫,因为它同时提供了探测和物种识别不需要费力的过程。昆虫的调查进行每月的5月至10月2017使用标准的昆虫学技术。Field-caught白蛉被确定物种水平DNA提取紧随其后。聚合酶链反应(PCR)进行使用特异性引物检测杜氏利什曼虫寄生虫。总共有1662白蛉从昆虫的调查,遇到和他们中的大多数Phlebotomus argentipes(n= 1517;91.27%),而其他的Sergentomyia punjabiensis(n= 140;8.72%)。杜氏利什曼虫只寄生虫DNA检测p . argentipes(2.3%;n= 2)。的检测利什曼虫DNA在p . argentipes表明这个物种的可能作用在斯里兰卡作为利什曼病的一个向量。

1。介绍

利什曼病是一种媒介传播疾病,这是由原生动物寄生虫属的利什曼虫家庭锥虫科的咬和传播感染的成年女性白蛉(双翅目:毛蠓科)。它被认为是世界上被忽视的热带病之一,影响发展中国家的人们大多在低经济层(1]。它预计,在全球范围内,有超过3.5亿人感染利什曼病的风险,和每年大约有二百万新病例的账户2]。

利什曼病有三个主要类型的临床表现,即皮肤利什曼病(CL),黏膜与皮肤的利什曼病(制程)和内脏利什曼病(重要)。在斯里兰卡,第一个土著leishmaniais于1992年确定的情况下,这是皮肤的起源的3]。Mucocutaenous(制程)和内脏(重要的)形式已确定在2005年和2007年,分别为(4,5]。目前,斯里兰卡是作为皮肤利什曼病流行的国家之一。六世和制程已报告形式经常低于皮肤类型。根据可用的数据,9个土著六世和两例粘膜利什曼病病例相同的疟原虫已报告(6]。目前,CL是主要的临床表现在该国每年有超过3000例(7]。据报道,斯里兰卡在印度次大陆的最新焦点利什曼病,病在哪里造成的最致命visceralizing物种,杜氏利什曼虫(8,9]。斯里兰卡的应变确定只有一个glucose-6-phosphate脱氢酶基因的核苷酸替换l . donovaniMON-2,应变最常见孤立从印度重要的情况下8,9]。潜在的内在化的皮肤的变体l . donovani在斯里兰卡直到最近不知道(9]。然而,一些最近的研究表明,visceralizing MON-37应变识别潜在的缺席从斯里兰卡10]。此外,研究森林型和国内水库在斯里兰卡,虽然不是完全确凿,表明这种病毒更容易比人畜共患anthroponotic [11,12]。

斯里兰卡沙蝇动物群包括共有22个物种从两个属:Phlebotomus和Sergentomyia(13]。的存在Phlebotomus(Euphlebotomus)argentipes的物种已知向量l . donovani已经被报道,从1900年年初以来斯里兰卡的14]。然而,在1992年第一次确认土著CL例报告[3]。确认确切的向量的物种是一个基本要求等病媒传播疾病控制工作的利什曼病(2]。内的寄生虫的检测白蛉的标准来控告利什曼病向量(2,15]。直到最近,发布信息矢量白蛉的潜力是有限的。2013年只有两个尝试(16)和2015年(17)已经确认寄生虫的存在领域的白蛉,为确认(严重不足15]。

目前,没有适当的控制程序在斯里兰卡行动利什曼病(18]。的检测利什曼虫寄生虫在新鲜白蛉等传统方法通过微观检测、文化,接种到另一个动物检测砂飞中肠内寄生虫需要高水平的专业知识和较长时间(19,20.]。此外,一些这些方法非常费力的20.,21]。因此,分子更可靠的和用户友好的检测方法利什曼虫寄生虫在野生白蛉[22]。因此,本研究进行了检测杜氏利什曼虫寄生虫DNA野生白蛉使用聚合酶链反应(PCR)检测,也可以用于现场例行监测和控制程序。

2。方法

2.1。研究区域

库鲁内格勒两市是最高的地区之一,皮肤利什曼病流行在斯里兰卡有不断增加的趋势在过去的几年里(23]。目前,该地区表示最多的病人从该国的流行率为0.37%23]。它位于北西部省份斯里兰卡占地4816公里²人口1610299 (24]。该地区每年接收平均降雨量2095毫米。温度和湿度平均31.7°C和69.6%,分别。三个健康医疗官(卫生部)地区库鲁内格勒区,即Polpithigama Maho, Galgamuwa(图1),它被认为是为利什曼病高危地区2009 - 2016年期间,被选为本研究样本集合。

2.2。昆虫的监测

昆虫的调查进行每月从5月到2017年10月在卫生医疗官(卫生部)三个方面。三种不同的技术,即粘陷阱(ST),牛饵净陷阱集合(CBNT)和手收集(HC)(选择室内(卧室、客房、卫生间)/户外(啮齿动物的洞穴和墙壁裂缝)网站)进行收集白蛉选择从三个研究地点每月。CBNT集合和HC进行使用手持电动吸引器。所有陷阱都安装在日落和收集在夜间(午夜8.00点:12.00),并在接近日出(5.00 - -6.00)。

2.3。处理样品和物种的鉴定

收集沙蝇标本在1%的洗涤剂清洗一次两次无菌蒸馏水紧随其后。每个标本解剖在一滴新鲜无菌生理盐水通过切断头部和腹部榄仁树属与消毒钳和一次性针头。身体的其他部位是存储在无菌1.5毫升微型离心机管和保持在−20°C冷冻直到用于DNA提取。安装在玻片标本使用霍耶的媒介25)和标识使用识别键对于物种在几个亚类(25- - - - - -27]。

2.4。基因组DNA的提取

DNA的DNA提取使用MightyPrep试剂(豆类生物公司,日本)根据制造商的指导与一些修改如下:200卷μL从MightlyPrep试剂添加到每个微型离心机管和个人白蛉使用无菌200了μL吸管小费。新的吸管建议每次使用,防止样品污染。样品受到硬涡10秒之后,孵化20分钟的95°C。样品被允许冷却到室温和涡10秒钟。最后,样本在12000转离心10分钟,储存在−20°C到用于PCR。

2.5。DNA扩增

寡核苷酸引物(F: AAATCGGCTCCGAGGCGGGAAAC;R: GGTACACTCTATCAGTAGCAC]针对动基体minicircle序列(591个基点)l . donovani如先前的研究被用于放大所述28]。本研究表明1成品的检测极限。使用20进行了放大μ包含1 L的解决方案μL产品DNA作为模板,2μL CoralLoad缓冲区(试剂盒)MgCl 15毫米₂和加载染料,1.6μL从每个核苷酸,核苷酸混合物的0.2毫米0.06μL的0.3μ正向和反向引物,0.41μL为2.5 U MightyAmp DNA聚合酶(豆类、日本)和15.18μL PCR的水。热循环仪(SimpliAmp放大了^TM应用生物系统公司)编程为94°C的初始变性步骤5分钟的变性和40周期为30秒94°C,退火在50°C 60秒,和扩展24秒的72°C。Nuclease-free PCR-grade水作为负控制和DNA分离l . donovani作为积极的控制。

2.6。琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖粉(琼脂糖S)被用于制备1 X TAE的凝胶。2%的琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色(0.5μg / ml)准备。一个卷4μL放大PCR产品满载着100个基点Promegaλ标记,在100 V和凝胶电泳进行了25分钟得到一个好的放大产品分离。DNA凝胶电泳后,迁移后的可视化和紫外光照下拍摄。

2.7。物种的DNA测序和确认

PCR扩增子使用QIAquick纯化PCR净化设备(试剂盒)和净化产品被送到Macrogen,韩国(254 Beotkkot-ro Macrogen Inc .) 1001年,Geumcheon-gu,首尔,韩国)桑格测序的方法。测序结果分析了BioEdit v7.0.9序列比对编辑软件。同源序列的数据库搜索执行提交动基体minicircle序列基本局部比对搜索工具核苷酸(BLASTn)服务器的国家生物技术信息中心(NCBI,美国)。

2.8。数据分析

数据进入Microsoft Excel表。昆虫的监测数据和分子分析百分比在Microsoft Excel数据计算。沙子飞男女比例计算如下:

疾病流行的空间变化是由单向方差分析评估(方差分析)Minitab 17统计软件包(美国宾夕法尼亚州一款统计软件公司)。

3所示。结果

3.1。多样性和丰富的白蛉

总共有1662白蛉收集来自所有技术在三个卫生部领域在研究期间。Maho卫生部区域记录最高的收集(51.81%;n= 861)其次是Polpithigama (40.85%;n= 679)和Galgamuwa (7.34%;n= 122)。根据形态学确认,两个物种,即Phlebotomus argentipes(n= 1517),Sergentomyia punjabiensis(n= 140),记录。的男女比例p . argentipes是2.88和1.55的美国punjabiensis。

CBNT技术导致了91.28% (n= 1517)的收集跟着圣(8.42%;n= 140)和HC (0.3%;n= 5)。所有个人CBNTs由唯一的p . argentipes。所有收集的白蛉STs放在房子用美国punjabiensis只有。物种组成和相对丰富的表1。

3.2。分子检测寄生虫DNA

PCR产品的可视化在琼脂糖凝胶紫外线照射下显示的存在l . donovani寄生虫只从p . argentipes在591个基点(图表示一个乐队的大小2)。

3.3。物种水平的验证

PCR测序地区的产品显示,99%相似(图3斯里兰卡利什曼虫sp隔绝。E值= 0)患者样本在斯里兰卡(加入号码DQ205334.1),后来的特点杜氏利什曼虫zymodeme MON 37 (9]。

3.4。的存在利什曼虫DNA在白蛉,利什曼病的发病率

根据单向方差分析测试中,疾病的流行率在过去的四年中,在95%的置信水平没有显著差异(F= 2.72; )。然而,报告病例数的平均值最高期间在Polpithigama卫生部区域(表2),只白蛉l . donovaniDNA在当前的研究中被报道。

4所示。讨论

在利什曼病的流行病学调查和白蛉生物生态学重要因素疾病管理和控制项目计划(29日,30.]。然而,在利什曼病流行地区丰富的白蛉仅仅是不足以描述向量负责传输利什曼病。的一个重要标准确切的连累利什曼虫向量按照指导方针是谁的检测存在的证据利什曼虫DNA在白蛉[2,31日]。消化道的解剖砂飞被认为是金标准检测自然感染性率。然而,这是费力和困难在处理大量样品32]。此外,感染需要证实了体外寄生虫的文化或接种到实验动物,因为其他nonidentified鞭毛虫也是常见的昆虫中肠(33]。PCR等分子技术允许甚至单个DNA检测利什曼虫寄生虫(34]。

在目前的研究中,我们使用一个PCR试验检测l . donovani与种特异的引物检测寄生虫DNA场白蛉。这些引物设计放大minicircle动基体疟原虫的DNA。此外,我们比较三卫生部白蛉区域的空间分布;即Polpithigama、Maho Galgamuwa库鲁内格勒两地区。两个物种,即p . argentipes和美国punjabiensis从实地调查,都遇到了。他们,p . argentipes,证明向量的传播l . donovani在其他国家和主要怀疑向量在斯里兰卡,是主要的16,17]。有趣的是p . argentipes收集只从牛饵净指示zoophilic自然物种的陷阱。然而,在属白蛉的确切作用Sergentomyia向量的利什曼病仍然是不确定的和觅食行为(被认为是主要的原因35]。属的物种Sergentomyia主要以冷血动物,特别是小型爬行动物如壁虎36,37]。然而,最近的研究已经证实,一些物种捕食各种哺乳动物,包括人类,驯养动物,野生啮齿动物(35]。因此,揭示美国punjabiensis只从粘性陷阱放在房子可能表明他们endophilic休息和觅食行为偏好小型爬行动物(壁虎),家养动物,啮齿动物,或者可能是人类。这个物种的血的决心将提供更好的答案,为什么他们喜欢人类的住处。

目前使用的引物的检出限测定低至1 fg,相当于0.1寄生虫报道的先前的研究[28]。根据文学出版所需的灵敏度检测寄生虫DNA白蛉被记录为0.1 - 1 (38]。因此,在这项研究中使用的引物是适合的检测l . donovani从field-caught白蛉和结果在当前的研究中也提倡。目前的研究发现l . donovaniDNA从野生的2.3%p . argentipes。有趣的是,没有寄生虫DNA检测美国punjabiensis表明这个物种不可能成为疾病传播的向量表示在先前的研究在东南亚地区(30.- - - - - -32]。然而,更广泛的研究是必需的因为苍蝇的物种数量目前的研究期间收集的很低。

分子聚合酶链反应检测目标不同的保守区域确认物种鉴定。在Hambanthota区进行的一项研究中,斯里兰卡南部省份有针对性的核糖体DNA利什曼虫寄生虫和0.31%的报道l . donovaniDNA在野生白蛉[17]。一项研究在巴西使用ITS1地区作为目标序列表明1.1%积极性39]。

更高比例的白蛉的观察l . donovaniDNA在野生白蛉从本研究可能表明高循环率的寄生虫在宿主和向量在这些领域。这表明采取直接行动的重要性进行更广泛的研究与规划有效的控制程序。此外,曾经的巨噬细胞利什曼虫无鞭毛体是由白蛉摄取和血粉,沙蝇肠道条件触发的变化形态转换promastigotes (40,41]。phosphoglycans promastigote表面上必须与受体结合中肠为了进入沙蝇的身体。如果promastigote phosphoglycans不兼容与受体在沙子里飞中肠,promastigotes将通过飞的排泄物。在这种情况下,白蛉不传播疾病(41]。因此,本研究并不一定确认p . argentipes参与的传播利什曼虫寄生虫。这只提供证据的实现一个向量连累标准p . argentipes的循环吗l . donovani寄生虫在沙蝇人口(2,15,42]。尽管潜在的向量知识是有限的几年前(18),最近的研究报告p . argentipes吸引和叮咬人类和潜在的宿主,43]。进一步说,这个物种也是显示强烈的生态关联的利什曼病发病率在这个区域(44,45]。因此,所有现有的数据表明p . argentipes可能是主管向量的传播吗l . donovani。接下来的步骤应该确认繁茂生长的沙子飞stomdeal阀内的寄生虫在中肠和实验通过媒介传播在实验室条件下(42,46]。使用回顾性数据生成数学modeling-based证明这个物种被寄生传输周期的维护必不可少的有或没有其它向量的参与也是必需的。此外,机器学习方法使用计划的结果控制程序可以用来支持,发病率显著降低的咬密度沙蝇种类(15]。

基于证据的zoophilic性质主要怀疑向量,zooprophylaxis可能被视为一种有效的方法来减少感染人口(47- - - - - -49),另外,考虑的zoophilic性质p . argentipes先前的研究表明(17,50)和目前的研究,认为这种疾病可能会传播通过投机取巧喂食。

如上所述,白蛉的识别与自然感染利什曼虫在不止一个场合的一个主要矢量连累标准(2,15]。在这项研究中,只有21%(95/448)的field-caught女性被随机选中的分子检测寄生虫。这是证明,2.1%的代表样本呈阳性利什曼虫寄生虫,尽管样本容量很低。寄生虫的出现在这样一个小的白蛉可能表明寄生虫主机之间的流通率高,在这些领域向量。通常的字段集合白蛉监测活动不能屏幕所有收集的寄生虫的存在。在可行性方面,成本效益,适用性,最好评估具有代表性。因此,我们打算评估可行性和成功的尝试具有代表性的字段设置为实地调查提供一个用户友好的应用程序和证据表明,可能是有用的控制程序。

5。结论

沙蝇物种p . argentipes是最常见的物种在该地区发现的白蛉,和它是唯一物种发现港口吗利什曼虫寄生虫。因此,可以推测,这个物种中扮演一个重要的角色在斯里兰卡利什曼病的传播。此外,优化PCR在当前的研究中可以作为一种有效的检测方法利什曼虫由于它的用户友好性寄生虫驻留沙蝇中肠。

缩写

方差分析:	方差分析
CBNT:	牛饵净陷阱
肤色线:	皮肤利什曼病
HC:	手收集
ITS1:	内部转录间隔区1
kDNA:	动基体DNA
制程:	黏膜与皮肤的利什曼病
聚合酶链反应:	聚合酶链反应
圣:	粘性的陷阱
TAE:	Tris-acetate-EDTA
六世:	内脏利什曼病。

数据可用性

期间的所有数据生成的研究可从相应的作者在合理的请求。

伦理批准

伦理批准了这项研究伦理审查委员会的医学院,大学Kelaniya (P / 204/12/2016)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

TW进行实地白蛉的集合。TW、YF和NG进行实验室调查。TW和NG编译的手稿。NG、DG和公斤了,关键的修正。所有作者阅读和批准了最终版本的手稿。

确认

斯里兰卡国家研究委员会(NRC 16 - 142)被公认为金融援助提供现场调查和实验室研究。这项研究是由美国国家研究委员会,斯里兰卡(批准号NRC 16 - 142)。

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