殖民地的建立Phlebotomus argentipes在实验室条件下，野生捕获和实验室饲养的种群之间的形态变化

摘要

对沙蝇的实地研究不足以揭示通过减少媒介种群来控制利什曼病所需的信息。因此，建立和维持沙蝇实验群是利什曼病研究的重要步骤。在目前的研究中P、 银根据已发表文献中的标准程序从野外捕获的沙蝇中建立。对实验室饲养和野生捕获的个体沙蝇的形态学测量进行了比较，以评估两组之间的差异。在有限的实验室条件下，该菌落成功地建立起来。形态参数的比较表明，实验室饲养的沙蝇明显大于从野外捕获的沙蝇，这表明在良好的环境条件下，沙蝇的适应度可能会增加，从而导致该疾病的较高患病率。目前的研究报告了在实验室条件下对沙蝇进行殖民的首次成功尝试。然而，群体数据表明，从已发表的文献中提取的条件需要进行优化，以适应当地的设置，以便在可用的资源数量内实现最大的种群大小。

1.简介

白蛉白蛉是其负责利什曼原虫的传输[医学上重要的昆虫1]还有其他一些病毒感染[2]。利什曼病是斯里兰卡新发现的一种疾病，每年有1000多名患者。这可以被认为是全岛重要的健康考虑。尽管在斯里兰卡总共记录了20个物种，但唯一确认的疾病传播媒介是Phlebotomus argentipes，几乎所有该疾病的流行地区都有报告[3-9]。许多研究报道，该物种是内脏利什曼病(VL)的主要媒介杜氏利什曼原虫在印度次大陆[10-12]。

在白蛉基于实验室的研究对揭示疾病控制所需要的信息是至关重要的。虽然场为基础的研究可以揭示白蛉一些有价值的信息，有些信息如矢量寄生虫相互作用，矢量能力，和主机，因此无法通过实地观察评估。因此，密闭在实验室条件下传病媒介的饲养是在调查上述方面是必不可少的。

对技术发布信息沙饲养足量苍蝇在不同的设置和地区可用[13，14]。这些报告显示了不同种类的白蛉的饲养条件。然而，没有公开信息的报告白蛉在斯里兰卡实验室建立了成功的殖民化。

白蛉白蛉的形态，包括P、 银已被多项研究报告[15-17]。虽然这些报告提供了有价值的信息，以确定沙蝇生命周期的每个阶段，但每一龄的沙蝇幼虫的鉴定仍然不清楚。野生捕获的同种果蝇和实验室饲养的同种果蝇之间的形态参数的变化在以前的文献中已有记载[18，19的研究报告，两种人群之间没有显著差异。然而，在此之前，还没有人尝试比较野生捕获和实验室饲养的沙蝇个体之间的形态变化。

为了使用的技术，如SIT，IIT和paratransgenic方法，实验室饲养的人应该有适当的生理和生物学特性。长寿，竞争力和繁殖能力必须更高。因此，目前的研究主要集中在初步建立沙蝇饲养设施的。此外，沙幼期的形态和形态特征与实验室饲养和野生捕捞个体也包括与所选参数的形态评价以及苍蝇。

2.方法

2.1。野外采集的沙蝇

在Kurunegala区的三个地点（Galgamuwa、Maho和Polpithigama），使用三种标准的昆虫学技术，即牛诱饵网捕器（CBNT）、光捕器（LT）和室外手捕器（HC），使用电池驱动的吸气器，收集沙蝇。收集到的沙蝇被安置在昆虫笼中，直到被运送到斯里兰卡拉格马市基拉尼亚大学医学院寄生虫学系的昆虫设施。

2.2条。成人住房和喂养程序

共有200只沙蝇（1 ： 1雌雄比例）被安置在养虫笼（15 × 15 × 15 cm）中，由相同尺寸的钢框架（图1)。本实验采用野外捕获的未喂食的雌性个体。成人维持在标准实验室条件下(26±1℃;相对湿度(RH) 75-80%;光周期为12:12小时(长:D))，并提供10%的蔗糖溶液随意。雌性动物则被喂食血餐(见上)采用人工金属板膜饲养方法饲养牛只的研究，由Gunathilaka等人描述。[20.]. 在这项研究中，使用了一种表面粗糙的方形金属板（9 cm × 9 cm：宽 × 长）。金属板的粗糙表面覆盖着一层拉伸的旁膜-M膜，保持一侧打开。将3.0 ml的血液（牛）注入板和膜之间的空间。副膜的开口侧被小心地密封起来。用微波炉将装满米粒的小枕头（10 cm × 10 cm：宽 × 长）加热到40°C，放在金属板上，同时保持充满血液的表面朝下，以便在整个供血过程中保持温度。

2.3。沙蝇产卵

用血液喂养的雌性个体被转移到装有巴黎花盆（400 ml）的石膏中进行幼虫饲养（图1)。将盆用之前介绍充盈的女性蘸水。柱保持在矩形塑料容器与紧身盖和湿度是通过每日喷水和湿海绵放在塑料容器内保持。的雌性设置有10％的糖和维生素B溶液随意在产卵期间使用饱和的棉絮垫。

2.4。沙蝇的种类鉴定

用细油漆刷或/和细镊子将死去的雌性从产卵杯中取出，放入1.5 ml的微量离心管中。将标本分别置于70%乙醇、90%乙醇、无水乙醇中5 分钟，最后置于二甲苯中脱水。将脱水后的标本放置在乳糖酚溶液中过夜，用几滴Hoyer培养基放在载玻片上，取下头部、一侧翅膀和腹部后段（最后3-4段）进行解剖。使用可用的形态学鉴定键对苍蝇进行物种级鉴定，以确认所有标本P、 银(21-23]。

2.5。鸡蛋收获和治疗

将蛋壶倾斜到布滤器上，通过喷洒蒸馏水将蛋从产卵杯中的糊状基质中取出。转移的卵子接受卵子处理程序。将装有鸡蛋的过滤器放在1%漂白剂中2-3分钟，然后用70%乙醇放置2-3分钟，以防止对鸡蛋的gregarine寄生虫感染。卵用蒸馏水冲洗3次，分装在育雏盆中。在蛋上加入少量温水，一直保存到蛋孵化出来。

2.6。幼虫食物准备

兔粪便和兔子的食物的等量（1加仑）的放入塑料筐并彻底混合。热水加仑引入篮，同时混合。将混合物保持15-20分钟，并在幼虫食物堆肥均等地分配到4个托盘。底部最托盘填充用热水和含有该混合物与托盘用手提喷雾器温水，直到介质变得有光泽（没有常设水）喷雾。食品堆肥的盖被关闭，并保持以保持有氧条件下开了两个通风口。这种设置下保持1周，并将该混合物在该周结束时推翻并保持一个星期之后是一个星期进行干燥。

2.7。幼虫和蛹饲养

卵处理后，将卵放置于幼体饲养杯中。当幼虫开始孵化时，在它们身上撒上一层薄薄的食物。每天将仔鱼饲养容器混合，以提供良好的通气条件。带蛹的容器干扰最小。新生的成年沙蝇被转移到单独的笼子2-3天之前的血液喂养。未成熟阶段维持在26±1℃、95-100% RH和12:12 (L: D)光周期。补充资料中包括完整的沙蝇饲养指南1。

2.8。养殖条件及安全措施

世界卫生组织所指定的所有实验室安全程序[22]严格执行，防止职业风险和向外部环境逃逸。

2.9。幼虫期的持续时间

每天对每个饲养容器进行观察。记录了从卵开始，幼虫、蛹和成虫各龄的生命周期。根据各幼虫期的蜕皮情况，观察到可用于区分各幼虫期的形态学特征。

2.10。产卵率，孵化率和出苗率

每日观察产卵率、孵化率和羽化率。产卵率计算为每只雌性的产卵数，孵化率计算为孵出的卵数占总产卵数的百分比。羽化率定义为羽化成虫数占孵出总卵数的百分比。

2.11条。形态测量

所有测量均根据目标结构在×4、×10、×40放大倍数下进行。形态测量参数是根据世界卫生组织手册和Lawyer等人选择的。[17，22]. 为了比较不同生命周期阶段的大小变化，随机选择了25个生命周期阶段的样本（卵、幼虫阶段、蛹，用插入光学显微镜（Olympus，CHT 4D0213）两个10倍目镜中的一个的预校准测微计测量在实验室条件下饲养的沙蝇成虫（雄性和雌性）。根据Lawyer等人的研究，总长度作为标准尺寸测量值。[17]. 为了比较野生和实验室饲养种群的大小变化，成年沙蝇选择结构的形态计量学参数，即头长、头宽、阴唇、阴唇、三趾长^{理查德·道金斯}触角段（A3长度）、触须长度、后股骨长度、后胫骨长度、翅膀长度、翅膀宽度和全身长度（图2)，这些是两性的共同特征。上述参数是通过从野外捕获和实验室饲养的种群中随机选择50个性别比例为1:1的成年人(每个性别各25人)进行测量的。

2.12。数据分析

野生捕捞和实验室饲养的种群之间的形态参数的单变量统计分析，在IBM SPSS 25统计软件包进行。使用独立样本两个群体之间测量的字符的平均差异显着性进行评价t以95%的置信区间进行测试。采用主成分分析（PCA）进行多元统计分析。计算PCA得分，利用原始数据的向量积生成PCA散点图。PCA是在R统计3.6.2程序。比较各组学生的PC1和PC2得分t以及。

3.结果

3.1。生命阶段的持续时间和发展特点

一群Phlebotomus argentipes在受限条件下成功建立。成年雌性沙蝇在血粉后6天开始产卵，持续8天。产卵后3-5天开始孵化。沙蝇幼期的寿命为31-33天。幼虫期18-24天，蛹期8-9天。成年后的平均寿命男性为7-8天，女性为9-11天。从产蛋到成虫的整个发育期从36天到50天不等（表1)。女性个体供血率为100%。然而，在本实验的100只雌鸟中，雌鸟的产卵率为10.03只/雌鸟，孵化率为76.57% (n = 768). Pupation success in the present trial was 46.10% (n = 354），均顺利进入成年期。

3.2。在实验室饲养的不同生命周期阶段的形态测量和形态学P、 银

的P、 银鸡蛋呈椭圆形，呈棕黑色（图3(一个))。卵长约0.33-0.36毫米(见表)1). 幼虫形似毛虫，白色。在所有四个龄期，身体都含有侧毛。头囊各龄均为黑色（图3)。1^圣龄幼虫could be identified separately by very small body size ranged from 0.64 to 0.91  mm and having only one pair of caudal filaments (Figure3（b）)，因为所有其它龄期都有两对尾丝。

第二龄幼虫（图3（c）)明显大于1龄，1.12～1.55 mm（表1)和三龄幼虫(图3（d）)长度范围为2.11至2.44 mm（表1)。第四个龄期(图3（e））was even larger and ranged from 3.06 to 4.08  mm in length (Table1)。在四龄幼虫倒数第二节的背侧有一具具特征性的深色硬化区域，有助于将其与其他阶段区分开来。然而，只有第三和第四阶段是肉眼可见的。蛹化蛹的第一天，蛹的颜色为亮白色，之后转为淡黄色(图)3（华氏度）). 大约在羽化前1-2天，蛹变暗。通过蛹壳可以清楚地看到成人的身体部位，如翅膀、头部和腹部（图3（克）)。

3.3。野生捕获和实验室饲养之间的形态变化P、 银

单变量(补充2）和多变量分析表明在野外捕获和实验室饲养的种群间形态测量一个显著差异P、 银。的11个测量形态性状的主成分分析表明，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）中的两个群体占74.66％，总方差的6.69％P、 银. 这些因素综合起来占总方差的81.35%（表2)。

实验饲养种群与野生捕获种群的PC1分差异显著(t= 7.84, df = 94， )。虽然用PC2解释的方差要低得多，但两个群体之间的差异是显著的(t = 7.54，df = 97， )。原变量与成分得分呈显著正相关，说明实验室饲养的沙蝇大于野生饲养的沙蝇。

第一轴（PC1）除与阴唇长度呈负相关外，其余各形态因子均呈正相关。第二轴（PC2）与阴唇长度高度正相关（表3和图4)。

PCA散点图证实了基于形态参数的两个种群(野生捕获和实验室饲养)的差异(图2)4)。

4。讨论

目前的研究报告称，在斯里兰卡的实验室条件下，沙蝇物种首次成功定殖。野生捕捉的沙蝇逐渐适应实验室条件是通过有效的血液喂养，使用人工血液喂养技术和细致的维护实践。通过主成分分析和后续分析的形态测量参数的分析t-试验表明，实验室饲养的沙蝇比野外捕获的沙蝇大得多。

在建立细胞集落，野捕雌性使用牛血人工膜法喂养。在一般情况下，产蛋持续时间主要是受这取决于物种采取血液消化的时间，[24]。此外，一些外在因素如温度、湿度[25]，血粉来源在确定产蛋时间时也很重要[26，27]。在本研究中，产卵开始于血粉摄食后6天，这与先前的报告一致[17，26]. 一些物种如p . duboscqi（8-10天），P. tobbi(7 - 11天)P、 哈尔普斯据报道，它的促性腺生长周期比P、 银币，而其他物种如长须罗蛉Lutzomyia和p . papatasi促性腺循环的持续时间是否与P、 银(26]. 然而，物种特异性因素可能是卵快速产生和早期刺激产卵的主要原因。

一个物种在血粉后的短时间内产卵的能力并不是沙蝇成功定植的唯一因素。产卵率（每雌产卵数）也应该更高，以便更好地定植[26]。一般而言，雌鱼产卵的数目在30至70只之间，视乎品种及幼体及成鱼饲养期间的营养情况而定[26]。目前的研究中观察到这种较低的产卵率可能是由于恶劣的生活条件，包括在自然栖息地的营养被剥夺的土壤。血粉的源和血液供给方法的效率也可能影响产卵率。当血液供给的成功P、 银而言，它已被证明是一个非常贫穷的纸盒时，使用麻醉哺乳动物[28]。在本研究中，采用Gunathilaka等人所述的金属板膜喂养法，100%的血供率。[20.]。因此，可以确定吸血方式并不是排卵率较低的原因。因此，可以通过优化血源和喂养方式来提高产卵率，一旦群体建立，就应该这样做。

在大规模饲养中，幼虫的饲料质量和饲养条件对成虫的成虫性状有着直接而不可逆的影响[29-32个]尤其是在实验室饲养的成虫的大小和其他与营养有关的生理功能上。因此，在实验室饲养的第二代群体中观察到较高的体尺可能是由于在幼虫饲养期间提供的条件和营养饮食得到改善。此外，饲养设施中不受捕食者的干扰，其他致病因子也可能促进生长和存活，这可能是它们在自然环境中生长的抑制因素。

除了其他病媒传播的感染外，沙蝇传播的疾病正在成为热带国家的主要公共卫生问题，自然气候正在发生变化。这项工作是在建立野外捕获的实验室群体进行的P、 银，其特征是理解通过改变环境对疾病传播的载体实施的变化非常重要。这项工作可能代表了对斯里兰卡的虫媒传染病研究的背景下难得的成就。然而，开展对矢量病媒传播疾病的生物学研究，建立实验室菌落是前提，这样的菌落成立于大多数的研究机构进行矢量病原关系的研究。因此，有史以来第一次逼近斯里兰卡殖民统治白蛉将是有益的催化剂，以提升研发活动走向现代化的评估矢量控制方法中，载体的寄生虫还没有在斯里兰卡充分调查的相互作用。

其中在建立白蛉殖民地的主要问题是在幼虫阶段[死亡率高13]. 本研究也遇到了同样的问题，在实验室条件下，最初只有46.10%的孵化幼虫达到成年。这可能是由于真菌在培养基中的生长、不适当的饮食、水分和温度条件抑制了幼虫的发育[13]。为了找到补救办法，从产卵盆收集的卵进行了卵处理，作为预防真菌和石榴感染的预防措施。此外，每天都要用细漆刷小心地冲泡饲养幼虫的容器，以防止真菌丝的生长，特别是在沙蝇幼虫成虫的第一阶段。然而，在Goulart等人之后，非蒸压处理的幼虫食物被用于仔鱼饲养。[33个，因为他们的发现表明Phlebotomus喜欢nonautoclaved食物。饮食和饲养条件基于先前公布的信息来确定。这个初始定植数据表明，有必要优化幼虫程序和养殖条件以最小的幼虫死亡率。

在第4龄结束时，幼虫停止进食，开始发育成蛹，形成prepupa。虽然有些温带品种在四龄时自然地有滞育的倾向，但这些热带沙蝇却没有这种行为。但由于病原菌的存在及其他不利条件的存在，可能导致四龄幼虫滞育。虽然四龄幼虫的滞育期略高于其他阶段，但在目前条件下并没有观察到四龄幼虫滞育。

沙蝇的出现有两种模式:一种是同步出现，所有成虫在2 - 3天内全部出现，另一种是半同步出现，出现周期为数周至数月[17]。目前的研究表明，该物种P、 银在实验室条件下呈现同步羽化模式。

尽管一些研究试图在描述沙蝇幼虫的幼虫形态，多数研究并未在每个龄幼虫提供精确的形态特征和测量。目前的研究提供了描述性信息，这些信息对于分级幼虫到龄有价值。不同虫态中选择形态的大小分别为内范围在以前的出版物指示的17]。研究人员已做了一些尝试，以便通过地理、时间或人为的屏障来评估孤立种群之间的形态差异[18，34个-37个]。目前的研究表明，实验室饲养的P、 银在95%的显著时间间隔内显著大于野生捕获的个体。

第一主成分（PC1），这解释了总体方差的74.66％，在很大程度上是由A3长度，触须长度，后腿段的长度，头的参数，和阴唇的影响。的系数值阳性除了盂唇的长度的所有参数，指示用于唇的在捕获的野生种群的长度的更高的值。相反的是用于其它形态参数，其中所述尺寸在实验室饲养种群更高真。方差解释由PC2相比PC1时显着地降低，但不同的是相当高的由所指示的t以及。PC2只受唇的长度的影响，表明系数值为正。这进一步证实了野生捕获种群的唇形明显变大。然而，总的来说，结果表明实验室饲养的沙蝇比野外捕获的沙蝇大得多。

实验室饲养和野外捕获的沙蝇在形态特征方面的比较以前没有报道。然而，一些研究试图评估四个种群的形态学特征p . papatasi生活在不同海拔高度[35岁]。本研究报道态度上分离群体之间的显著变化，这已经由另一研究进行使用被提倡P、 阿里亚斯(38个]。幼虫发育所需的土壤营养成分在不同海拔高度可能有所不同，这在观察到的幼虫形态差异中可能也起到了关键作用[17]。这也可能是本研究中观察到的显著差异的原因。形态差异为今后的研究提供了有价值的信息。例如，沙蝇的宿主皮肤穿透能力和穿透深度取决于口部的长度[39个]。这可能是其中一个原因l . donovani主要原因为斯里兰卡的皮肤松弛症及南亚其他国家的内脏表现，因为本地沙蝇病媒可能无法到达皮肤较深的地方，因而局限在皮肤上[39个]。虽然在斯里兰卡和其他东南亚地区发现的两种寄生虫之间存在遗传变异，但在临床表现上的这种差异的确切机制和原因仍不清楚。此外，这种疾病以前在斯里兰卡干旱地区流行，现在正蔓延到环境条件更好的潮湿地区[40个]。因此，如果环境条件较好影响了感染的性质，则由于形态的变化，通过提高寄生虫的接种能力，湿区疾病可能更严重。因此，强烈建议开展与媒介相关的研究，以确定沙蝇形态计量学对增强媒介能力、昆虫接种率和疾病传播的任何影响。

在实验室里，必须采取极端的预防措施，以防止任何沙蝇特别是妊娠雌蝇的逃逸。当沙蝇从笼子里逃出来时，立即采取行动，用手持式吸气器抓住它们，或用苍蝇拍杀死它们。

实验室内放置了一个光阱，以防止沙蝇逃往实验室外。每天对实验室的角落和垂直表面进行检查，以确定是否有任何沙蝇逃逸。

总体而言，从野外捕获的个体建立沙蝇昆虫群体是一项困难、耗时、不确定且具有挑战性的任务，因为这些物种的发育参数仍然未知。因此，需要非常小心和适当的容器，以确保沙蝇的生存，直到产卵。另一个主要问题是，遗传瓶颈出现在实验室种群中，导致群体在几代之后就崩溃了[17]。这使得很难维持一个封闭的群体，没有进一步的野生输入。此外，包括真菌、细菌、绿藻和一些螨虫在内的感染也可能成为一个主要问题，并可能导致菌落的崩溃[26，41个]。因此，本研究建立的菌落在适当的质量控制程序下得到最大限度的保护。此外，研究还将优化与幼体食物、产卵基质、成虫食糖浓度、交配笼最佳性别比和容器承载能力相关的饲养条件，以便在现有设施的基础上实现最大的生产力。

5.结论

的殖民化P、 银在斯里兰卡的实验室条件下，通过适当的维护实践和极度小心是可行的。此外，实验室还培养了P、 银均大于野生带菌者，说明在良好的环境条件下，带菌者的适应度有提高的潜力，可增加疾病的传播。

缩写

人:	世界卫生组织
CBNT公司：	牛饵网
LT：	光陷阱
本币：	手抓
主成分分析：	主成分分析。

数据可用性

所有的数据都可以与作者，并会在合理的要求提供。

信息披露

这项研究工作的早期版本已经提交作为一个抽象的，在健康科学2018的国际会议，斯里兰卡Jayewardenepura，斯里兰卡的大学。

利益冲突

作者声明他们对该手稿的内容没有利益冲突。

作者的贡献

TW和NG进行了实验。TW和NG编辑了手稿。所有作者在提交前都审查并批准了手稿的最终版本。

致谢

国家研究委员会资助的NRC 16-142项目提供的财政支持得到认可

补充材料

附则一：草蛉饲养简介。补充2：野生捕获和实验室饲养之间形态计量变量的单变量分析Phlebotomus argentipes人群。（补充材料）

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