曙红的协同作用的研究组合与氯喹B,青蒿素,周效磺胺恶性疟原虫体外和鼠体内

文摘

背景和目标。抗疟药物青蒿素是受欢迎,但它必须与其他药物作为单一疗法结合使用造成阻力。曙红B的有效性,实验室染色,作为主管抗疟代理早些时候确认。这是测试结合等不同抗疟药青蒿琥酯(青蒿素的衍生物)或氯喹或周效磺胺在体外在恶性疟原虫和在活的有机体内在鼠体内使用彼得的抑制试验。方法。药物评估进行了单独或组合恶性疟原虫体外使用蜡烛罐法三种抑制浓度。活细胞的百分比寄生虫血症是通过显微计数。彼得的抑制试验进行了小鼠感染鼠体内3管理后的药物单独和组合,和寄生虫被显微镜数为10天。结果。协同作用也体现在isobolograms曙红B结合青蒿琥酯和周效磺胺减少10倍以上的药物体外。好的组合指数与青蒿琥酯获得50% inibitory浓度为3.4 nM曙红B和1.7 nM青蒿琥酯与124 nM曙红B和7.6 nM青蒿琥酯单独。在活的有机体内研究也显示相当降低的曙红B的有效剂量30毫克/公斤:青蒿琥酯3毫克/公斤和200毫克/公斤曙红B和60毫克/公斤分别青蒿琥酯。周效磺胺似乎最大的协同效应综合指数为0.007,但这可能是由于组成的三种药物的组合。曙红B的组合指数与氯喹是公正的,和在活的有机体内测试也没有显示尽可能多的能力另两种药物。结论和解释。它可以得出结论,曙红B可以结合使用抗疟药物有利的结果。

1。介绍

根除疟疾的主要障碍是耐药寄生虫的发展1,2]。首次报道电阻标准抗疟药氯喹在东南亚国家和南美洲自1950年代以来,已经达到了舞台,不再推荐任何非洲国家(3- - - - - -5]。

高水平的抗氯喹的研究取得了一些国家转而一线药物周效磺胺(SP),但不幸的是,这种寄生虫还开发了抵抗这种药物结合治疗失败被报告在非洲,亚洲和南美洲。一个受尊敬的药物青蒿素及其类似物对氯喹耐药性恶性疟原虫感染的世卫组织促进全球作为标准治疗相结合。这是因为它的单一疗法导致电阻在世界的一些地区像湄公河地区6,7]。治疗剂量的基本原则是,它有效地杀死了寄生虫,其余的大部分是完全消除伴侣的高浓度药物(8]。快速行动,消除周期短(不到一个小时)的青蒿素的作用防止变异寄生虫的选择,和同伴的长半衰期药物可以确保所有的寄生虫的破坏。

新药需要作为标准药物治疗结合。实验室染料抗疟药物的使用可以追溯到一个多世纪,亚甲蓝作为抗疟1891年格特曼埃利希(9]。有许多成功的临床试验在体外和在活的有机体内对人类在非洲的亚甲蓝结合氯喹。这种组合正在认真考虑作为一种新的药物由于其成本效益(10,11]。

曙红B,另一个污点,已被确定为一个潜在的antiprotozoan药物分子对接(12]。它已经经过测试在体外在刚地弓形虫和不同的菌株恶性疟原虫包括氯喹耐药性菌株的IC50小于123纳米。报告显示,其作用机理与其它抗疟药物没有交叉反应,它针对的是一种双功能二氢叶酸reductase-thymidylate一般网站。其安全性也被建立在我们的早期作品,和美国食品和药物管理局已批准使用的药物和化妆品,因为它不是老鼠致癌当口服高达2% (13]。它已经有效地测试在活的有机体内作为抗疟剂在各种各样的老鼠不同路线的管理导致保护(14]。

显示所有三个的抗疟药的耐药性是现在越来越普遍,进行了一项调查研究结合曙红B的影响与氯喹或周效磺胺青蒿琥酯恶性疟原虫体外和鼠体内小鼠应变,在活的有机体内。

2。材料和方法

2.1。化学物质

青蒿琥酯钠盐的青蒿素(艺术)是忒弥斯获得医疗保险有限公司(印度古吉拉特邦)和磷酸氯喹(CQ) J.B.化工和制药有限公司(Vatva,艾哈迈达巴德,印度)。Sulphadoxine (S)和乙嘧啶(P)是从Sigma-Aldrich获得的。SP是用于相同的比率Fansidar(20: 1),因此测试作为一种药物。所有其他的化学物质是来自默克公司(德国)。

2.2。在体外文化

恶性疟原虫3 d7 EC没有。PF3D7_0513300克隆Walliker博士提供的迟到,热带医学学院,伦敦。7毫升的寄生虫是培养完整的RPMI 1640中包括5%血清,10%比容、0.01毫米次黄嘌呤,50 mg / L庆大霉素(完全培养基)在75毫升玻璃瓶所使用的方法载体和詹森。每48小时中被改变,烧瓶在36.5°C,孵化有限公司5%₂,5%的人啊₂,90% N₂(15]。

2.2.1。在体外抑制化验

3药物和伊红B被稀释的RPMI媒介。第一个实验是检测每个药物的抑制浓度,从200年开始到0.01 nM恶性疟原虫发现了,他们的IC50值作为EO 123海里,SP 6.1: 0.3 nM, CQ 6.8 nM,艺术7.6 nM(图1)。第二个是获得相同的药物组合。起始浓度、剂量的一半的IC50值使用的每个药物:EO:艺术(62 nM: 3.8海里),EO: SP(62海里(3.05:0.1525海里)),和EO: CQ (62 nM: 3.4海里)和连续稀释在96 -平底的微量滴定板完全培养基。的parasite-infected红细胞(100年是0.5%μl)在1.5%的比容和同步环阶段添加一井。感染红细胞RPMI的培养也用作控制。板被放置在一个密封的蜡烛罐和孵化37°C。48小时后,从每个病人身上采集的血液涂片,染色和染色测定寄生虫血症(%)通过计算红细胞表面寄生在5000年总红细胞表面的数量。IC 30、50和70人在GraphPad棱镜使用单向方差分析计算软件 被认为是重要的。每个实验重复三次。

2.3。动物

健康NMRI白化小鼠(在18到22岁的g)是来自伊朗的巴斯德研究所的动物屋。老鼠一直在标准条件下根据赫尔辛基协议。他们提供商业颗粒饮食和水随意条件22 + / - 1温度和湿度50% - -60%。他们被允许适应前七天的实验室条件实验。所有动物伦理委员会批准的工作和研究委员会的巴斯德研究所的伊朗。动物被当作/赫尔辛基动物权利的协议。

2.3.1。寄生虫接种

p .鼠(ANKA株)EC 2.7.11.22数量请提供的公共卫生学院的德黑兰大学,德黑兰,伊朗。寄生虫被储存在爱思唯尔−70°C的解决方案(2.33%葡萄糖,氯化钠0.525%,1%柠檬酸钠在去离子水)和甘油(9:1 V / V)。他们生长在NMRI老鼠2×10的初始接种体⁷p .鼠来华的红细胞/毫升,然后顺序使感染和未感染老鼠每周。老鼠被感染(20 - 30%)寄生虫血症作为捐赠者。血液通过心脏穿刺收集在麻醉下包含0.5%柠檬酸三钠的管子。收集的血液与生理盐水稀释1毫升包含2×10⁷p .鼠来华的红血球,0.5毫升每个鼠腹腔内注入(ip)。

2.3.2。分组和给药的动物

对于每种药物,感染小鼠被分为六组,每五个老鼠。一组标准药物注射,另一个由曙红一样积极的控制和一个负控制药物载体。其他三组有三个剂量的伊红(低、中、高剂量)结合固定剂量的药物有关。

曙红B是200毫克/毫升的积极控制和三个剂量的10毫克/毫升,5毫克/毫升,2.5毫克/毫升每个药物结合。艺术管理的阳性对照为60毫克/公斤和1.5毫克/公斤结合曙红的剂量。CQ在5毫克/公斤的积极控制和组合与伊红0.5毫克/公斤。SP是注入25毫克/公斤:1.25毫克/公斤(Fansidar比例的)积极控制,结合伊红为1.5:0.075毫克/公斤。这些剂量抵达后初步实验(数据未发表)在我们的实验室。

2.4。修改后的彼得的为期4天抑制试验

治疗药物进行了2 h后感染0.5毫升的ip管理2×10⁷p .鼠在0天寄生红细胞。老鼠用单一药物治疗和组合与伊红3天每24 h。Giemsa-stained尾巴血液幻灯片被从第三天开始每天直到第十天,和寄生虫血症的还原率计算如下。

寄生虫血症比例处理和未经处理的动物之间的差异进行了分析通过单向方差分析使用SPSS和差异被认为是重要的如果 。此外,对照组的平均值之间的差异(为100%)和实验组的百分比是表示为减少活动使用下列方程(16]:

添加剂的效果的方法计算Chou-Talalay [17]。使用IC30 Isobolograms被画在Microsoft Excel, 50岁,和70年的值治疗EO, CQ、艺术和SP及其组合的在体外化验。EO IC30、50和70个值和每种药物都在x和y轴,分别代表累加效应是画一条线之间的抑制浓度(IC)。每个治疗的组合指数(CI)是根据经典isobologram方程计算的总和减少指数两种药物的D是原始剂量的药物和Dx减少剂量:

如前所述。

CI = 1是累加效应,CI < 1显示了协同作用,和CI > 1展览对抗。值接近于零显示更好的协同作用。这是描绘在图的右边区域IC添加剂的拮抗效应和左边代表协同效应。

3所示。统计分析

意义是计算 通过方差分析GraphPad棱镜软件。

4所示。结果

4.1。抑制寄生虫血症的在体外测试

抑制浓度的药物组合恶性疟原虫体外IC30, 50和70的每种药物单独对伊红B是124海里,为青蒿琥酯7.6 nM, 6.1: 0.1525 nM周效磺胺,氯喹(图6.8海里1)。结合药物、IC30 IC50, IC70描绘在图2。比单一药物,结合青蒿琥酯的IC50:伊红显示减少4倍和36倍的剂量比积极的控制。IC50剂量氯喹:伊红B组合也下降到5.4次,36次。的剂量与周效磺胺:IC50曙红减少超过75倍比单一药物。

图3显示了曙红和周效磺胺药物的组合索引。如前所述,IC30 IC50, IC70值单一药物伊红B和周效磺胺的家常便饭x和y他们和他们的组合之间的界限轴与添加剂剂量显著图中区域。如果结合剂的抑制浓度降至添加剂协同作用和左边的右边,它显示对抗,而值接近零展示更好的协同作用。图中的所有三个剂量的点3非常接近于零,因此表现出很好的协同作用。

图4显示了氯喹和曙红的组合指数b两种药物显示协同作用只在IC50添加剂线(左)但在IC30表现出轻微的对抗和IC70剂量值下降的位置观察到右边的添加剂。结合指数IC50剂量氯喹也不接近于零。图5是isobologram描绘了曙红B:青蒿琥酯表现出很好的协同作用,剂量。IC50剂量和IC30剂量的伊红B:青蒿琥酯非常接近于零,IC70展品的协同作用。IC30非常接近于零,它不能被看到的图。

4.2。抑制寄生虫血症的在活的有机体内测试

彼得的抑制试验进行结合药物保持标准的药物剂量不变,减少在三个剂量伊红B:低,中,高。寄生虫血症百分比计算了10天,中剂量给最好的结果。曙红B: sulphadoxine乙嘧啶组合,减少10倍的药物给最好的抑制,曙红B: sulphadoxine乙嘧啶含量减少到20:1.5:0.075毫克/公斤,而伊红B 200毫克/公斤,SP 12.5: 1.25毫克/公斤,分别计算6。曙红的功效百分比B:周效磺胺组合如图7。曙红B:氯喹的组合在活的有机体内还展示了最好的结果与5:0.5毫克/公斤标准药物相比,伊红B 200毫克/公斤,氯喹5毫克/公斤,展示的40倍和10倍降低药物的数量,图8。百分比的功效相结合的曙红B和氯喹如图9。青蒿琥酯和伊红B组合如图10图中所示,其效果11表明中等剂量有最好的效果,这是降至6.6倍,比单一药物的剂量小20倍与伊红B:青蒿琥酯30:3毫克/公斤比伊红B 200毫克/公斤,青蒿琥酯单独60毫克/公斤。

5。讨论

曙红B是一个实验室的染料,但其安全性已经得到FDA的批准。没有毒性的曙红B已经证明当老鼠多达2%的在他们的饮食。单剂量甚至间歇剂量的伊红B不会干扰在小鼠胚胎囊胚发育,和剂量150海里海拉细胞无毒在体外(13]。曙红B最近gametocidal影响恶性疟原虫体外(18]。

我们测试了曙红B结合标准的抗疟药在体外在恶性疟原虫和在活的有机体内对小鼠感染鼠体内。一个很好的协同效应与周效磺胺观察。周效磺胺的作用机制是抑制两种酶的作用是重要的寄生虫的叶酸生物合成途径,二氢叶酸还原酶(DHFR)和dihydropteroate合成酶(井下供电)。点突变电阻呈现的DHFR和井下供电基因乙嘧啶和sulphadoxine分别在体外的敏感性降低恶性疟原虫有关每个基因的突变数量(3,19]。

周效磺胺被用来治疗疟疾西亚自2004年以来的各种反应。在阿富汗,甚至10年的使用后,有报道称,周效磺胺维持其功效。然而,2010年在伊朗有账户的突变三年后使用周效磺胺药物组合虽然周效磺胺尚未作为单一疗法,但一直利用结合氯喹两年之后sulphadoxine-pyrimethamine-artemisinin所取代。大量的突变DHFR被检测到,但这并不与临床未能sulphadoxine:乙嘧啶,它可能是与之前接触伯氨喹有关。然而,单一疗法周效磺胺是紧随其后的是临床失败在其他地区;因此,联合疗法被世卫组织建议,特别是药物与不同的代谢途径,以克服阻力20.,21]。

周效磺胺结合伊红在体外显示一个高度减少剂量在所有三个抑制浓度(数字2和3)。在活的有机体内测试还降低了10倍的有效剂量低于单独药物的剂量,这是由于这种组合包括三个药物(数字6和7),但随着周效磺胺Fansidar药物的比例和测试这两个一直保持不变的比率,它可以被视为一个单一药物及其isobologram显示出非常重要的抑制浓度降低了50%。中等剂量的组合被认为是最有效的体内。值得注意的是乙嘧啶抑制DHFR的活动,磺胺类药和砜类(如磺胺多辛)抑制dihydropteroate合成酶的活性(井下供电)。曙红B对叶酸通路也有影响,但通过双官能团的二氢叶酸reductase-thymidylate合成酶(DHFR-TS)酶是独一无二的,没有出现在哺乳动物的途径。曙红也作用于谷胱甘肽还原酶和硫氧还蛋白还原酶,这可能是其相加作用的原因之一(13]。周效磺胺曙红B的组合似乎是有前途的,但仍需进行更多的研究工作在sulphadoxine-pyrimethamine-resistant恶性疟原虫菌株在任何公司的结论。

氯喹耐药性在东南亚和南美洲在1950年代末。自那时以来,它已经遍布非洲和大部分热带国家。这种药物已经停止在许多领域多年,但有趣的是,在马拉维在停止用药10多年了,有一个完整的失踪的耐药菌株22]。持久的好处氯喹与部分疟疾免疫强调个人需要更换廉价而有效的药物。的高成本新抗疟药氯喹作为一线药物在患者简单的疟疾的症状,即使阻力普遍存在。另一个实验室研究染料亚甲蓝在临床试验结合氯喹治疗失败比证明当单独使用氯喹(23]。

花了很多年氯喹抗性发展在特定的焦点,因为它被认为是由于多个8点突变基因产物的PfCRT参与药物通量pH值和/或监管。这是与抗乙嘧啶迅速出现在许多独立场合由于二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的突变(24]。

曙红B展示了氯喹耐药性菌株的抗疟药活动恶性疟原虫(13]。它作用于一个不同的机制其他比氯喹,尽管有一个协同的IC50演示了一个30时间降低的曙红和氯喹的5倍,有温和的对抗在IC70 IC30(图4)。的在活的有机体内测试还显示,没有结合剂可以抑制比单一药物(数字8和9);然而,进一步的工作将会做澄清这些结果。

青蒿素是治疗疟疾的药物选择的组合形式,但在东南亚由于阻力上升,研究在结合青蒿素与其他草药提取姜黄素等,从辣椒胡椒碱,大蒜(大蒜)这些新组合,希望可以防止耐药性的出现(25,26]。发现青蒿素是一种抑制剂的SE石棺/内质网钙^{2 +}腺苷三磷酸酶(SERCA的)的疟疾寄生虫。的PfATP6是唯一SERCA-type Ca^{2 +}腺苷三磷酸酶酶发现的疟原虫疟疾寄生虫和被认为是合适的青蒿素分子的目标。寄生虫对青蒿素的耐药性可能是由于突变氨基酸263的位置PfATP6酶被认为影响酶对青蒿素的敏感性和位于青蒿素结合的口袋里27]。曙红B徒DHFR-TS系统上的谷胱甘肽还原酶,谷胱甘肽转移酶(13];因此,伊红B和青蒿素的作用机制疟原虫是非常不同的,正如所料,曙红的组合与青蒿琥酯B显示最好的协同作用在所有三个浓度非常有希望的结果。的IC50在体外测试和青蒿琥酯4.5折了曙红36倍减少剂量恶性疟原虫(图5)。测试小鼠疟疾的青蒿琥酯剂量降低了10倍,曙红B 6折(数字10和11);因此,这将是一个不错的组合作为他们行动的方式是不同的,需要很长一段时间出现的耐药性。

曙红B在这些早期测试表明有两个很好的协同作用的药物,周效磺胺和青蒿琥酯与氯喹和公平的协同作用。进一步的工作将会完成在活的有机体内证明伊红B和青蒿素的结合或伊红B和周效磺胺是有益的。可以得出结论,曙红B提供了一个有趣的一部分作为进一步研究铅药物结合青蒿素和其它抗疟药物。

6。结论

曙红B测试了抗疟药氯喹,青蒿琥酯和周效磺胺。曙红B与青蒿琥酯表现出协同特性,周效磺胺,在某种程度上与氯喹。它可能被视为一个候选人在未来结合抗疟药物,特别是青蒿素。

缩写

EO:	曙红B
艺术:	青蒿琥酯
CQ:	氯喹
SP:	周效磺胺
DV:	药物载体
置信区间:	组合索引
集成电路:	抑制浓度。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者希望感谢伊朗的巴斯德研究所资助这个项目。

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