的分子特征隐孢子虫种虫害在伊朗西南部的野生啮齿动物使用18 s rRNA基因Nested-PCR-RFLP和测序技术

文摘

背景。啮齿动物可以作为储层隐孢子虫种虫害特别c以及人类感染,人畜共患代理负责。由于没有相关信息隐孢子虫阿瓦士城市的啮齿动物感染,伊朗西南部,因此,这个调查的患病率和分子特征进行确定隐孢子虫在这个地区种虫害。材料和方法。一百年从阿瓦士城市的不同地区啮齿动物被困。肠内容和啮齿动物的粪便标本进行了研究使用显微镜检查确定卵囊和nested-polymerase连锁反应(PCR)技术对18 s rRNA基因检测。最终限制片段长度多态性(RFLP)方法使用SspI和VspI限制性内切酶进行了基因型的物种,然后得到结果排序。结果。的100个样本被诊断为积极的和整体的患病率隐孢子虫种虫害是3%使用光学显微镜下修改Ziehl-Neelsen染色和nested-PCR(830个基点)方法。后来,PCR-RFLP进行积极的样品和c以及模式识别。最后PCR-RFLP发现测序和存在c以及再次确认。结论。我们的研究显示,啮齿动物可能是潜在的储层c以及。所以一个集成的程序控制和与他们应采用并继续执行。

1。介绍

隐孢子虫种虫害随处可见胞内原生动物寄生虫影响广泛的脊椎动物像人类和牲畜(1]。卵囊感染阶段的生命周期通过发布大量粪便从受感染的主机环境。他们对各种环境变化和在长时期内保持感染性在适当的条件像水和潮湿土壤表面;因此,它们负责动物和人类疾病的传播(2,3]。隐孢子虫作为一种机会性代理的消化道感染主机和有广泛的临床症状在免疫活性的人类从自我和无症状的个体对免疫功能受损者严重,危及生命(2,4,5]。第一次人类隐孢子虫病在个人被诊断出有严重的腹泻在1970年代(6]。

在过去的几十年里,大量的证据已经证实,小型哺乳动物如啮齿动物被认为是作为承运人或储层数传染性病原体。他们可以直接或间接地传播病原体。啮齿动物的角色在转移寄生虫和原生动物感染是显而易见的(7- - - - - -10]。调查不同地区的伊朗表明各种啮齿动物物种的存在如家鼠(亩骶),黑鼠(家鼠),褐鼠(鼠形)和喜马拉雅鼠(鼠属心绞痛)在国家8,10,11]。基于我们之前在阿瓦士区调查,伊朗西南部,啮齿动物可以被视为的潜在来源刚地弓形虫感染的主机(9]。

最近,几个分子的研究已经进行了确定隐孢子虫基因型。小subunit-rRNA(四18 s rRNA)基因被用于识别隐孢子虫全球广泛种虫害。根据SSU-rRNA基因测序,至少20隐孢子虫物种已确定,超过60岁隐孢子虫基因型未测定的状态直到现在。约八隐孢子虫物种/基因型包括c以及,c . hominis,c .猫属,c . meleagridis,c . ubiquitum,c . viatorum,c .犬属,c .地道负责人类感染是主要的物种,虽然c . hominis和c以及占全世界90%的人类隐孢子虫病(1,2]。

大量流行病学调查执行了整个世界和流行隐孢子虫啮齿动物感染非常多样的来自英国的63% (12),32.8%在美利坚合众国(美国)13),24.3%在意大利14在马里兰州[],7.6%15在中国[],11.5%16在菲律宾[],25.8%17在澳大利亚北部[],8.2%18在伊朗东北部),0%(城市马什哈德)[19),27.3%在北伊朗(德黑兰城市)20.]。由于缺乏有关隐孢子虫伊朗西南部的啮齿动物感染直到现在,本研究的目的是确定的患病率和分子特性隐孢子虫仕达屋优先计划。在这个地区。

2。材料和方法

2.1。研究区域

库泽斯坦省的首都阿瓦士城,位于伊朗西南部(31°50 11′′N和49°E),排名第七届全国最大城市和基于最新的人口普查,人口估计1395184年有352128家庭。全年的天气温度是高度可变的,这样在夏天温度超过50°C,而在冬天它落在5°C。年平均降水量约230毫米。有高密度的啮齿动物物种和rat-man-domestic动物邻接的阿瓦士市(9,11]。啮齿动物是额外的水库隐孢子虫仕达屋优先计划。猫和狗,主要捕食,,因此,可以通过其他动物传播寄生虫感染(8]。

2.2。啮齿动物集合

阿瓦士城市最初分为五个地理位置(北,西,南、东、中心)。在每个位置谢尔曼住陷阱被户外的入口处啮齿动物群落和饵块最喜欢吃的食物(包括黄瓜片、西红柿和烤杏仁)。谢尔曼住陷阱是安装在日落和日出前聚集。总的来说,100年啮齿动物收集从三个不同的物种(6m .骶,73年r形,21R。鼠属)。最终困啮齿动物聚集和转移到阿瓦士医学寄生虫学部门JundishapurUniversity医学科学。困啮齿动物的麻醉通过将生活在一个厚的透明的聚乙烯袋,然后一个棉签浸泡在乙醚和放在自己的鼻子。后来,麻醉啮齿动物解剖,从收集的粪便样品直肠或大型肠部分。头骨和牙齿结构被用于物种鉴定。艾特马的伊朗啮齿动物的关键是执行识别啮齿动物(21]。

2.3。检测隐孢子虫spp。卵囊

样本来自肠内容和啮齿动物的粪便标本。糖后浮选(SG 1.266;蔗糖128克和100蒸馏水)(22)和修改Ziehl-Neelsen染色,样品检查发现隐孢子虫仕达屋优先计划。卵囊使用光学显微镜下×1000放大。卵囊的诊断是基于形态学特征喜欢红色球形形状。最后的样品重铬酸钾(K维持在2.5%₂Cr₂O₇)[23),保存在冰箱(1 - 2周),直到DNA提取。

2.4。DNA提取和Nested-PCR

DNA提取过程进行使用QIAamp®DNA凳子迷你包(QIAamp DNA凳子迷你工具,美国)基于制造商的指导方针。提取的DNA保存在−20°C下测试。nested-PCR方法中,我们使用两个特定引物检测18 s rRNA的基因片段产生的长度是1325个基点和830个基点。这种双重阶段技术运行中小学阶段使用不同的引物,引物如下:[4,20.,23,24]。

第一阶段引物转发(F1): 5′-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3′反向(R1): 5′-CCCATTTCCTTCGAAACAGGA-3′

第二阶段引物转发(F2): 5′-GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG-3′反向(R2): 5′-CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA-3′最后PCR产品装载在1.5%琼脂糖凝胶电泳后1.5小时与溴化乙锭染色然后可视化紫外线照射下使用凝胶Doc设备(Uvidoc凝胶文档系统,剑桥,英国)(25]。

2.5。基因分型隐孢子虫spp。使用18 s rRNA PCR-RFLP和测序

RFLP分析是为了确定隐孢子虫spp。,使用二次PCR产品的消化。为了这个目的,SspI和VspI核酸内切酶酶被用于物种识别和基因分型,分别基于制造商的协议描述(早些时候20.]。然后混合孵化大约8小时37°C。最终消化产品的可视化进行了在紫外线透照器在1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色(20.,26]。nested-PCR阳性样本纯化使用Bioneer装备公司(韩国)和被同一公司测序。序列比对是由CLUSTAL W软件(http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/clustalwe.html)。核苷酸序列数据在本文报告可用在基因库中加入数字AB986579,AB986580,AB986581。

3所示。结果

的100个样本被检测为阳性隐孢子虫种虫害使用光学显微镜下修改Ziehl-Neelsen染色。此外,nested-PCR完成和显示830个基点乐队只有3样品确认隐孢子虫仕达屋优先计划。(图1)。所以,总体患病率隐孢子虫阿瓦士城感染啮齿类动物使用这两种方法计算为3%。所有属于阳性样本r形(3/73)和m .骶(0/6),r .鼠属(0/21)没有观察到阳性病例。为了确定基因型,PCR-RFLP技术使用SspI和VspI限制性内切酶是利用。与SspI限制性内切酶,三个岩屑被认为在108年的位置,258年和421年英国石油公司在琼脂糖凝胶电泳可见。也在使用VspI酶,三个岩屑发生在104的位置,106年和600年英国石油公司(图2)和指示c以及模式。放大18 s rRNA PCR-RFLP产品三个基因c以及测序。后将结果提交给DDBJ /基因库加入数字AB986579,AB986580,AB986581,核苷酸序列与核苷酸序列c以及认证与加入基因库AB986578数量(图3)。基于调查结果,c以及被认为是阿瓦士啮齿动物的传染病。

4所示。讨论

隐孢子虫种虫害属于Apicomplexa门与世界性的分布(1]。周边地区啮齿动物病原体的传播循环起到关键作用在人类和牲畜的发病率和死亡率尤其是在人口密集的地区(7]。

诊断的常规方法隐孢子虫仕达屋优先计划。是基于直接使用光学显微镜观察粪便样本的卵囊。因为这种方法灵敏度较低,需要专业知识,也无法区分不同种类的寄生虫;因此,PCR等分子技术最近被使用和发展。pcr技术具有灵敏度高、特异性和迅速的特性能够区分不同标本物种和基因型中,也就是说,水,凳子,和动物或人体组织,尽管他们是昂贵的。以前,基因分型的隐孢子虫仕达屋优先计划。被嵌套PCR-RFLP成功方法根据SSU-rRNA (18 s rRNA)基因(4,18,20.,24,26,27]。

根据以前的流行病学报道,患病率和感染隐孢子虫仕达屋优先计划。在啮齿动物范围从0%到63%,成为全球高度变量(12,19]。现在调查是第一个报告集中在患病率和分子检测隐孢子虫仕达屋优先计划。西南野生啮齿动物的阿瓦士城,伊朗。我们发现3%(3/100)患病率与Ziehl-Neelsen直接显微镜观察染色和nested-PCR(830个基点),同时,在巴拉米等。20.]调查城市在德黑兰(伊朗首都)使用这些方法,报道了患病率分别为13%和27.3%。也都积极的样品确认c以及通过PCR-RFLP使用SspI和VspI限制性内切酶和经测序,与我们的研究一致。德黑兰和阿瓦士的研究结果之间的差异可能是合理的样本量,取样的位置,城市人口,卫生条件,污水系统,等等。值得一提的是,伊朗德黑兰作为资本是最拥挤的城市人口密度最高的国家,比阿瓦士多折的。在城市马什哈德(伊朗东北部),流行的隐孢子虫仕达屋优先计划。有0% (19)是低于我们的研究(3%),而美国报告的高患病率32.8% (13),中国(11.5%16)、澳大利亚(8.2%18)、菲律宾(25.8%17以北,德黑兰城市(伊朗)27.3%20.]。

根据目前的研究中,18 s rRNA的基因c以及发现只有在r形(3/73)和r .鼠属和m .骶没有孤立的阳性样本。应该提到它r形是最丰富的伊朗西南部的啮齿动物(73/100)和感染的患病率和率最高(4.1%,3/73)分配给这个物种对应之前的调查(9,11]。结果放大18 s rRNA基因测序后提交给DDBJ /基因库加入数字AB986579,AB986580,AB986581然后与AB986578控制。图3介绍了几个核苷酸替换。

Lv和他的同事们(16]研究了野生,实验室,和宠物啮齿动物(完全723种啮齿动物从18岁)在中国和流行隐孢子虫种虫害和报道在11.5%c以及,c·缪里斯,c . andersoni和c . wrairi被确定。患病率在野外,实验室,和宠物啮齿动物为6.8%,1.9%,和21.8%,分别。在另一个调查显示,Ng-Hublin et al。17)194年野生鼠类等5种亚洲鼠(r . tanezumi)、稻田鼠(r . argentiventer)、太平洋鼠(r . exulans),r形,m .骶在菲律宾,报道总体患病率为25.8%。此外,基于测序和系统发育分析18 s rRNA基因和肌动蛋白位点,c·缪里斯,c以及,c . scrofarum,c是例如基因型,和老鼠的基因型I-IV是公认的。在当前的研究中,c以及被发现使用18 s rRNA基因测序。在世界各地c以及被孤立的从众多的动物如牛或牛24),一些反刍动物(山羊和绵羊)28)、马(29日)、猪(30.,羊驼31日),一些食肉动物(灰色的狼和狗)32,33),爬行动物27),和啮齿动物(大鼠、仓鼠、老鼠、海狸鼠、花栗鼠、松鼠,和水豚)(13,16,17,20.,34- - - - - -37]。除了主要隐孢子虫物种在伊朗c以及经常被验证,例如,73.3%在人类和动物38在德黑兰(人类样本)[],83.3%39在德黑兰啮齿动物),100% (20.在牛Ilam [], 100%24阿瓦士),68.8%(在免疫功能低下的患者和儿童)(4]。Rafiei等人调查伊朗西南部在免疫功能低下的患者和儿童(肾移植受者,与血液恶性肿瘤的人,HIV阳性的病人,和孩子小于5岁),390份粪便标本收集和检查。普遍存在的隐孢子虫仕达屋优先计划。为4.1% (16/390)。此外,三种不同的物种被确定使用基于18 s rRNA PCR-RFLP基因包括11c以及4c . hominis,1c . meleagridis(4在与我们的结果一致。根据Rafiei et al。4调查和我们的研究中,c以及被确认为最常见的物种在啮齿动物和人在阿瓦士的城市。在过去的研究c以及从啮齿动物传染给人类的反复报道(17,40]。

5。限制

目前的调查是基于采样有限的啮齿动物物种在有限的地区。在未来,为了更好的理解的负担隐孢子虫仕达屋优先计划。和遗传多样性,研究应该设计在广泛的野生和宠物啮齿动物(大鼠、仓鼠、老鼠、兔子、等等)在库泽斯坦省等广大地区。

6。结论

本文是第一个报告,关注的患病率和分子特性隐孢子虫仕达屋优先计划。西南野生啮齿动物的阿瓦士城,伊朗;显示感染r形值得关注。同时,啮齿动物可能是潜在的储层c以及。结果可以帮助公共卫生保健追求新策略(环境卫生、提高卫生条件、提高卫生条件,等等)。在未来,采用合适的控制策略和与啮齿动物,以减少人间病例是必要的,应该继续。

伦理批准

所有适用的国际、国家和/或机构动物保健和使用指南。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Jasem日本米酒的贡献对概念、设计和定义的知识内容;Reza Asadpouri收集样品,进行实验;Masoud Foroutan-Rad导致了文献检索和手稿准备;Jasem日本米酒和马苏德Foroutan-Rad编辑对稿件。

确认

这个研究和财务支持的阿瓦士Jundishapur大学医学科学,批准号cmrc - 91。作者感谢的支持原生动物学实验室的员工Jundishapur大学医学科学。他们要感谢Nezam先生萨利希对他帮忙收集样品。

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