文摘

登革热是世界上的一个主要公共健康问题。因为所有流行的四种血清型正积极在墨西哥,有必要开发一个有效的诊断系统提高病人的病例管理。存在一些研究评估使用NS3蛋白保护性抗原对登革病毒(DENV)。在本文中,我们展示重组NS3蛋白的表达各血清型的登革热病毒(GST-DVNS3-1-4)和报告一个可靠的“内部检测系统”的诊断登革热感染是一个小村庄进行实地测试,(Tezonapa)在韦拉克鲁斯州,墨西哥。融合蛋白免疫原性,诱导抗体能够识别抗原1:3200稀释。纯化蛋白质被用来开发一个内部检测系统(ELISA)和进一步测试小组的239份血清样本。内部的结果是在良好的协议与商业套件(95% CI = 0.808 - -1.061)IgM (95% CI = 0.779 - -0.965)和免疫球蛋白,分别。之间的协议NS1兑rNS3 ELISA抗原检测,(95% CI = 0.708 - -0.966),很好。因此,这些结果表明,重组NS3蛋白有可能在登革热感染的早期诊断。

1。介绍

登革病毒感染(DENV)在美国,在世界其他地方,大幅增加。目前,墨西哥可以被视为一个登革热流行地区,因为蚊子埃及伊蚊存在于85%以上的国家(1]。感染可能导致登革热(DF)、自限性的发热性疾病。更严重的症状是登革出血热/登革休克综合征(DHF / DSS)与致命的后果。登革热由四个,但抗原上密切相关,不同的病毒血清型(DENV1-4) [2]。能够很好的证明,主要感染的一个特定血清型四种血清型带来持久的免疫力。然而,二次感染的不同血清型与风险增加有关发展中登革出血热锁定增强(正面)感染与登革出血热的病理生理机制(3,4]。

病毒基因组包含一个开放阅读框,编码3391个氨基酸的多蛋白,蛋白质加工成10个人。三种蛋白质结构(膜(M)、衣壳(C)、和信封(E))和7的非结构化(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5) (5- - - - - -7]。这个多蛋白的乳沟,病毒复制,代表一个重要的一步是由主机酶和NS3病毒蛋白酶。登革热非结构性3 (NS3)是一种多功能蛋白大约69 kDa,参与多元蛋白质加工、RNA限制,和RNA复制。它包含一个丝氨酸蛋白酶域,位于n端部分,解旋酶(8]。登革热感染引发不同的免疫反应的病毒蛋白质。表面抗体生成主要针对病毒E蛋白和分泌NS1蛋白(9- - - - - -11),而t细胞抗原表位的大部分都集中在NS3蛋白,CD4的主要目标⁺和CD8⁺t细胞反应(11- - - - - -13]。E蛋白也可能诱发non-neutralizing抗体参与锁定的现象增强DENV感染的(正面),这可以联系到的发生继发感染登革出血热的数量增加(3,14]。另外,一些报道称使用非结构性蛋白质登革热疫苗克服这样的问题(15- - - - - -17]。NS1也是高度免疫原性(18];然而NS1也和人类的交叉反应的抗体蛋白质,可以联系到一些病理影响的登革热感染19- - - - - -21]。相比之下,只有一些研究评估使用NS3蛋白对DENV保护性抗原。

据估计,有超过36亿人感染登革热的风险与3600万例登革热,超过200万例严重的登革热,每年有超过21000人死亡发生(22]。

因为所有四种血清型循环在墨西哥,有必要开发一个有效的诊断系统提高病人的病例管理。直到现在,登革热感染的发病率被低估了,因为大多数情况下不正确的诊断,尤其是在小城镇或农村,私人或国家实验室诊断缺乏23]。根据这一点,在急性感染早期诊断至关重要临床管理严重疾病,及时识别潜在的爆发。登革热感染诊断可以通过等化验rt - pcr (24),病毒隔离(25],NS1抗原检测(19,26]。然而,酶联免疫试验(ELISA),由于其易用性,登革热感染血清学证实的常规诊断系统(27,28]。不同的包是商用,如Panbio登革热IgM和免疫球蛋白快速盒测试套件和商业Platelia登革热NS1抗原捕获酶联免疫试剂盒。显然,登革热感染的检测系统的可用性是一个公共卫生的优先级。因此,在这项研究中,我们显示重组NS3蛋白的表达从所有四种血清型的登革热病毒,我们报告一个可靠的“内部检测系统”的登革热感染诊断的一个小村庄进行实地测试,(Tezonapa)在韦拉克鲁斯州,墨西哥。

2。材料和方法

2.1。细胞和病毒

白纹伊蚊细胞(写明ATCC C6/36: crl - 1660)是生长在杜尔贝科修改鹰与heat-inactivated 10%胎牛血清的培养基补充的边后卫(dmem - 10%), 0.29毫克/毫升谷酰胺,200 U /毫升青霉素和链霉素0.2毫克/毫升。DENV-1(夏威夷),DENV-2新几内亚(C), DENV-3 (H87)和DENV-4 (H241)获得国家公共卫生实验室在韦拉克鲁斯州,墨西哥。股票是由感染病毒C6/36细胞单层75厘米²组织培养瓶在75% -85%的融合。DENV吸附2 h后,20毫升的最低基本培养基(MEM)补充添加了10%的边后卫,烧瓶孵化在28°C,直到细胞病变效应明显。细胞和上层清液被温柔的移液,然后收获由离心澄清(1200 g×20分钟)整除,储存在−直到需要80°C。

2.2。制备NS3表达结构

病毒rna提取得到的2毫升的澄清文化媒体1毫升的试剂盒LS试剂(英杰公司)根据制造商的指示和作为模板合成的cDNA。反应是由逆转录酶标二世(表达载体),底漆DENV1-4 NS3向前(DEN1 5-GGGGGCGGAGGTAGTGGTGGAGGCGGGTCAGGAGTGCTATGGGACAC-3;DEN2 5-GGGGGCGGAGGTAGTGGTGGAGGCGGGGCCGGAGTATTGTGGGATGT-3;DEN3 5-GGGGGCGGAGGTAGTGGTGGAGGCGGGTCCGGCGTTTTATGGGACG-3;DEN4 5-GGGGGCGGAGGTAGTGGTGGAGGCGGGTCAGGAGCCCTGTGGGAC-3)和DEN1-4 NS3反向(DEN1 5-ATCGATGATCATTACCTAAACACCTCGTCCTCAATC-3; DEN2 5-TAATGGATCCTTACTTTCGAAAGATGTCATCTTCA-3;DEN3, 5-GGCGGATCCTTATGCATTTGTTTGCGCTATTCC-3;DEN4, 5-GGCGGATCCTTACTTTCGAAAAATGTCCTCATCC-3;限制性内切酶网站强调,DEN1基类库我,DEN2-4Bam嗨)[29日]。样品受到如下:变性1分钟(94°C),引物退火(NS3-DEN1在58°C, NS3-DEN2在48°C, NS3-DEN3 60°C,和NS3-DEN4 55°C 2分钟),和底漆扩展(2分钟72°C)紧随其后30周期的扩展步骤7分钟在72°C。不同的放大产品(500 - 600年英国石油公司)在1.8%琼脂糖凝胶电泳,凝胶萃取设备恢复QIAEX II(试剂盒,德国)。四质粒基于pCR 2.1威尼斯平底渔船向量(Invitrogen-Life技术)构造编码NS3pro185序列(域蛋白酶)。重组向量受到限制生态国际扶轮,碎片被结扎在坐标系到pGEX-5X-1向量(法玛西亚)之前用同样的酶消化。

2.3。GST-DVNS3-1表达式、增溶和净化,GST-DVNS3-2 GST-DVNS3-3, GST-DVNS3-4

主管大肠杆菌应变DH5 -α细胞转化与父母的向量(pGEX-5X-1)重组表达载体(pGEX-DVNS3-1、2、3、4),接种到磅媒体含有100 mg / L氨苄青霉素(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),和孵化37°C过夜。新鲜磅媒体孵化在37°C与隔夜文化OD (1: 100)_600年= 0.5,和蛋白质产量增加引起的异丙基-β-D-thiogalactoside (IPTG)最后一个0.1毫米的浓度。2 h孵化后,细胞表达蛋白质的收获和净化了本质上所描述的Lopez-Monteon et al . 200330.与以下修改)。然后,丸治疗溶解包涵体;短暂,球洗两次50毫升的PBS(137毫米氯化钠,氯化钾2.7毫米,4.3毫米Na₂HPO₄h·7₂O, KH和1.4毫米₂阿宝₄孵化pH值7.4),37°C下不断搅拌20分钟和离心机,享年3046岁g在4°C 10分钟。之后,颗粒通过涡流PBS停牌1 x pH值7.4包含2 M尿素,样本被大力搅拌2分钟,在37°C的环境下不断搅拌30分钟,随后,离心机在3046 g×10分钟。得到的上层清液的溶解包涵体是透析去除尿素。这些上层清液透析对PBS 1 x pH值7.4一夜之间在4°C不断搅拌。上层清液包含可溶性融合蛋白(GST-NS3DEN1 2、3和4)混合glutathione-agarose珠子(硫键;σ)。吸附后30分钟,珠被离心收集和清洗。销售税或GST-DVNS3-1, 2, 3, 4 (rNS3)筛选了与自由竞争的谷胱甘肽(15毫米谷胱甘肽在50毫米Tris-HCl pH值8.0)然后acetone-precipitated。

2.4。与GST-DVNS3-1免疫小鼠,2、3、4

雌性BALB / c小鼠(6 - 8周岁)被腹腔内接种的路线。所有的老鼠都保持根据我们的机构的动物保健和使用委员会的建议。100年的老鼠注射了一剂μ50 g的抗原和两个μg。第一次与抗原免疫接种进行乳化完全弗氏佐剂(CFA)和re-immunizations每隔一周进行不完全弗氏佐剂(美国纽约Gibco-BRL,大岛)。对照组使用相同的时间表,只收到了销售税+辅助。的免疫方案,动物流血而获得免疫血清。

2.5。sds - page及免疫印迹

蛋白质决定10% sds - page (31日)和可视化与考马斯亮蓝染色或在硝化纤维纸electrophoretically转移免疫印迹(32,33]。汇集每一组的血清免疫小鼠作为主要抗体在连续稀释(1:100 - 1:3200)TBS-T(渐变20 150毫米氯化钠,0.05%,2%的脱脂牛奶,和10毫米Tris-HCl pH值7.4)。结合抗体被发现使用碱性phosphatase-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白(美国皮尔斯,罗克福德,IL)稀释1:5000,那么发达国家电视台和BCIP(σ)。

2.6。研究区和样本收集

Tezonapa的研究在城市科尔多瓦的卫生管辖,在韦拉克鲁斯州中部,位于北纬18°36′,东经96°41′西方。总共有10个农村地区包括:Caxapa, El Mirador El Suspiro Las josefina,紧张,La Luna既La Reforma报导,牧场新,拉亚卡拉科尔,圣奥古斯汀•德尔手掌。这些村庄海拔80 - 700米,位于韦拉克鲁斯州的沿海平原和山脉东部的Trans-Mexican火山带的西部。在每一个村庄,登革病毒研究人员提供一般信息和项目在开家庭会议组织在农村医疗单位通过IMSS-Opportunities社会项目。感兴趣的参与者给预约家庭医疗单位的血液了。约会那天,书面知情同意是来自每个志愿者,和研究人员收集血液样本在真空采血管管。血清是由离心分离1200 g×10分钟和样本存储在−70°C到使用。

2.7。登革热诊断

短问卷对疾病知识和一般临床症状也应用于参与者血液采集标本时,带着问题,包括他们是否遭受热高于37.5°C,头痛,retro-orbital和腹痛、呕吐、皮疹、鼻子或任何其他类型的出血。总共有239份血清样本收集和分析登革热病毒感染使用四个不同的测试,包括Panbio登革热IgM和免疫球蛋白捕获ELISA (Panbio诊断,布里斯班,澳大利亚),Platelia登革热NS1抗原捕获ELISA (Bio-Rad)检测和内部系统(anti-rNS3)和rt - pcr检测特定片段的登革病毒的蛋白E。

2.8。登革热由内部系统诊断

测试所有的血清样本,进行间接ELISA方法如下:96 - 100孔板被涂上一层μL(碳酸盐缓冲(pH值9.6)包含抗原浓度2μ克/毫升(四重组NS3蛋白rNS3池)。隔夜4°C孵化后,盘子都洗五次PBS-T在磷酸盐缓冲溶液(0.05% Tween-20), 5分钟洗,阻止了5%的脱脂牛奶在室温下在PBS为45分钟。血清样本连续稀释;生成一个OD值高出三倍的稀释比负样本是彻底的其他研究中使用。所有血清样本稀释1:50和100μL(每一个被添加到个别井一式三份和孵化了两个小时在37°C。进一步洗涤步骤进行,peroxidase-labeled山羊反人类免疫球蛋白抗体(美国皮尔斯,罗克福德,IL)添加在1:8000稀释PBS渐变20 / 0.05%,在室温下培养1小时。在100年8洗μL (2, 2, -azino-bis (3-ethylbenzthiazoline) 6-sulphonic酸(酶、南旧金山、钙、美国)被允许添加底物和反应在室温下进行了20分钟。和2%硫酸反应停止,吸光度与ELISA酶标阅读器阅读415海里(断层女士;Labsystems,万塔、芬兰)。截止(0.21)的测定(稀释1:100)建立了使用平均获得的样本25看似健康的人类血清+两个标准差(SDs)。阳性样本定义为样品吸光度大于上方两SDs的均值-控制。

2.9。病毒RNA提取

研究的分子类型DENV,试图孤立RNA的血清样本以及从四个不同的DENV血清型菌株进行,作为积极的控制。使用TRIzol-SL根据制造商的协议隔离病毒RNA。

2.10。rt - pcr血清学分型登革病毒

在一个管,都转换为一个DNA病毒RNA复制酶DNA扩增前(互补)通过使用逆转录酶(RT)和下游DENV共识底漆D2-5′-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3′同源的基因组RNA四种血清型。互补脱氧核糖核酸合成使用上标二世工具包(表达载体)20μL反应混合物4毫米核苷酸(应用生物系统公司),4毫米MgCl₂(应用生物系统公司),1 U /μL核糖核酸酶抑制剂,2.5 U /μL逆转录酶(表达载体),1μg RNA。反应混合物是孵化为30分钟42°C,然后转录酶灭活在70°C的5分钟。5μL获得cDNA被作为模板在25μ包含1.5毫米MgCl L反应混合物₂2.5毫米核苷酸1 x PCR缓冲二世和2.5 U AmpliTaq黄金20 pmol登革热病毒DNA聚合酶与共识引物(D1: 5′-TCAATATGCTAAAACGCGCGAGAAACCG-3′和D2: 5′-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3′)。PCR(511个基点)下进行下列条件:28 94°C的周期30年代,55°C, 1分钟,2分钟72°C,然后在72°C扩展步骤7分钟。

DENV血清型是由第二轮扩增(嵌套PCR)发起1μL稀释材料在无菌蒸馏水(1:40)从最初的放大反应。总25μ使用1 L反应混合物的制备μL稀释第一次PCR产品,1.5毫米MgCl₂核苷酸,2.5毫米,0.5 U的Taq DNA聚合酶,和20 pmol底漆D1和20 pmol登革热病毒特定类型的引物(壹空间:5′-CGTCTCAGTGATCCGGGGG-3′, Ts2: 5′-CGCCACAAGGGCCATGAACAG-3′, Ts3: 5′-TAACATCATCATGAGACAGAGC-3′, Ts4: 5′-TGTTGTCTTAAACAAGAGAGGTC-3′),(早些时候报道34]。样品受到初始变性(3分钟95°C)紧随其后20周期的变性30年代(95°C),引物退火1分钟(55°C),和底漆扩展(2分钟72°C)以及最终扩展7分钟(72°C)。PCR产物进行了分析通过运行1.8%琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色。片段的大小是DENV-1(482个基点),新一轮登革2型(119个基点),DENV-3(290个基点),和DENV-4(392个基点)。

2.11。数据分析

所有比例数据给出了95%的置信区间(CIs)。使用确切概率测试我们比较比例数据,和k指数计算时适用。年龄和seroprevalence率之间的关系通过卡方检验和回归分析评估。所有村庄都是地理空间数据库的血清学的结果创建在ArcView 3.2(环境系统研究所、雷德兰兹、钙、美国)生产seroprevalence地图。

3所示。结果

3.1。表达、纯化和免疫原性的重组GST-DVNS3-1, GST-DVNS3-2, GST-DVNS3-3, GST-DVNS3-4蛋白质

互补脱氧核糖核酸编码的四个DNA片段得到NS3蛋白酶域(NS3pro185序列)各血清型的DENVs PCR(图1(一))。所有片段(NS3-DEN1/597 bp NS3-DEN2/596 bp NS3-DEN3/590 bp NS3-DEN4/598 bp)(图1 (b))被克隆到pCR2.1TOPO向量和subcloned再次与定向到正确的开放阅读框pGEX-5X-1表达载体(图1(一))。重组蛋白的表达pGEX-NS3DEN1、pGEX-NS3DEN2 pGEX-NS3DEN-3, pGEX-NS3DEN4, pGEX-5X-1(肠外质粒)评估大肠杆菌DH5α细胞在与IPTG诱导37°C。从包涵体蛋白质的纯化。GST-fusion蛋白质的量存在于分数与收益率之间1.8和5 mg / L文化根据重组蛋白;GST-NS3DEN3蛋白表达是最低(1.8 mg / L)。图1 (c)显示2小时后获得的融合蛋白的诱导和溶解包涵体纯化后的2 M尿素。亲和色谱法净化后,通过sds - page分析,结果显示一个新颖的蛋白质的表达~ 49 kDa(图1 (c)巷1 - 4)和表达的销售税27-kDa蛋白质(图1 (c),巷5)。他们被使用对销售税蛋白多克隆抗体,免疫印迹和所有人都预计的重量。

为了建立这些净化销售税登革热蛋白可以诱导体液免疫反应,5组BALB / c小鼠接种重组蛋白。血清样本分析的免疫接种计划。融合蛋白的免疫原性,诱导抗体能够识别抗原1:3200稀释(数据未显示)。

3.2。血清学和rt - pcr DENV血清学分型

总共239份血清样本收集从一个地区Tezonapa,韦拉克鲁斯(图2),主要是女人(,69.4%)。参与者的年龄范围从3到65年。所有239个样本检测登革热IgM抗体和免疫球蛋白,NS1抗原检测和anti-NS3抗体(图3(一个))。共有13个样本为IgM阳性,获得seroprevalence 5.43% (95% CI = 4.23 -6.63%)。在分析免疫球蛋白的存在时,共有28个样本阳性,获得seroprevalence 11.7% (95% CI = 10.26 -13.16%)(图3 (b))。十七个样本阳性NS1捕捉观察7.11% (95% CI = 5.59 -8.73%)(图3 (c))。在分析anti-DENV抗体的流行使用的重组NS3蛋白(rNS3),共有26个样本观察积极和seroprevalence 10.87% (95% CI = 9.42 -12.32%)(图3 (c))。相同的样本,积极为DENV NS1抗原证实PCR阳性样本血清型1(1对应于既la Reforma报导和16个样本血清型2圣奥古斯汀•德尔手掌)观察一个总体感染率为7.11% (95% CI = 5.59 -8.73%)(图3 (d))。

3.3。内部登革热系统评估

八个样本阳性5测试;7四个测试样本阳性。三个之间的一致性ELISA评价很好。IgM Panbio ELISA和rNS3 ELISA,(95% CI = 0.808−1.061)。蛋白质作为一个可能的诊断测试的价值评估,观察到的协议免疫球蛋白Panbio ELISA和rNS3 ELISA,(95% CI = 0.779 - -0.965),很好(观察同等数量的积极的在两个测试样本;Fisher精确检验),灵敏度为0.9231 (95% CI = 0.7488 - -0.9905),特异性为0.9812 (95% CI = 0.9526 - -0.9949)、阳性预测值为0.8571 (95% CI = 0.6730 - -0.9597),和负面预测值为0.9905 (95% CI -0.9989 = 0.9661)。患病率与年龄没有显著相关(;二阶多项式回归)(数据没有显示)。之间的协议NS1抗原检测与rNS3 ELISA,(95% CI 0.708 - -0.966),很好,灵敏度为1.000 (95% CI = 0.7708 - -0.9946),特异性为0.9595 (95% CI = 0.9219 - -0.9801)、阳性预测值为0.6538 (95% CI = 0.4436 - -0.8206),和负面预测值为1.000 (95% CI -0.9996 = 0.9779)。

4所示。讨论

登革热感染是一个日益严重的公共卫生问题在世界各地流行地区。Hyperendemic地理区域被定义为那些连续出现多个病毒血清型和主管向量,和人口众多的易感宿主,因为它似乎是墨西哥的情况(1]。尽管DENVs的重要性随着新兴病原体,诊断测试保持充分有效和准确识别DENV感染。墨西哥,目前,网络公共卫生实验室由30个实验室执行确认诊断登革热通过使用免疫测定技术检测病毒抗原NS1, IgM抗体或免疫球蛋白,根据疾病的时间演化,当病人寻求医疗。我们认识到,有一个高水平的漏报的登革热病例甚至地区有足够的监测系统。预计的漏报水平差的分散的农村地区和获取医疗服务的更高(35]。我们的研究集中在诊断登革热病毒感染以及抗体的存在在韦拉克鲁斯州中部的农村地区。

当前登革热诊断方法有许多严重的局限性。的黄金标准的诊断急性DENV感染病毒隔离,但过程是昂贵的(39.10美元),耗费时间,在技术上难以执行。逆转录酶聚合酶链反应(rt - PCR)已经被广泛采用替代诊断急性感染的病毒隔离,但PCR技术密集型和昂贵的(136.67美元),及其灵敏度从基于底漆集90%到80不等。IgM抗体捕获酶联免疫吸附试验(MAC-ELISA)是有用的主要诊断登革热感染急性或早期康复的后期阶段的疾病但early-acute-phase感染(通常是不敏感36]。之间的区别主要和次要感染目前评估登革热通过测量IgM和免疫球蛋白反应抗原在配对血清样本取自发热病人在疾病的急性期和恢复期(37]。为了建立一个快速、可靠的诊断,在墨西哥的一些实验室使用Panbio登革热IgM和免疫球蛋白快速盒测试套件或ELISA登革热IgM捕获工具。然而,有时很难获得这些工具由于股票市场短缺,问题引入外国产品,当然,成本太高。因此有必要寻找替代品的诊断DENV在疾病的急性期,因为诊断测试保持充分有效和准确识别DENV感染。这项工作的目的是研究重组NS3蛋白的表达从所有四种血清型的登革热病毒和报告一个可靠的“内部检测系统”的诊断登革热感染和商用工具相比(Panbio登革热IgM和免疫球蛋白快速盒测试套件和商业Platelia登革热NS1抗原捕获酶联免疫试剂盒)。使用重组NS3蛋白作为识别主要和次要感染的诊断方法提供了很好的结果,获得良好的之间的一致性测试IgM和免疫球蛋白(Panbio IgM /免疫球蛋白g测试与rNS3 ELISA),当我们执行一个诊断测试的预测能力的研究中,观察到一个良好的特异性和敏感性与ELISA rNS3。同样的,是很好的协议时比较NS1和rNS3 ELISA抗原检测。非结构蛋白1 (NS1) DENV之前已被证明是有用的作为急性登革热感染的诊断工具。NS1 DENV-infected患者的血清中发现了最早的第一天症状和18天38]。我们的结果表明,所有样品抗原检测阳性NS1也阳性重组NS3蛋白抗体的存在。这些结果表明,使用ELISA与重组NS3蛋白可能是另一种方法在急性期对登革热病毒的血清学分析。NS3蛋白在疾病的发病机制中起着主导作用,连同它的角色在处理病毒多蛋白的前体蛋白质是一个有趣的评估主机响应。一些作者报道重大NS3抗体反应在初级和二级感染(39- - - - - -41]。然而,巴尔德斯et al ., 200040),显示出重要的抗体反应在次要的情况下感染血清型DEN2时。在这种情况下,内部检测系统使用了反IgG抗体作为第二抗体,可以表明抗体出现在患者的血清免疫球蛋白g而不是IgM抗体。这是符合巴尔德斯的结果等。40),作为二次反应我们发现免疫球蛋白抗体和病毒血清型DEN2结果表明,主要感染血清型。结论使用ELISA与重组NS3蛋白可能是一种替代方法的登革病毒血清学分析急性期事实的结果有很好的一致性当比较NS1和rNS3 ELISA抗原检测。

据报道,登革热传播在农村地区,目前已成为城市自然条件。此外,人口迁移支持永久dengue-endemic地区传播的风险。

“理想”登革热诊断测试的特征取决于目的的测试将使用;早期诊断登革热的测试应该区分登革热和临床方面类似的其他疾病(如疟疾、钩端螺旋体病、伤寒),高度敏感的急性感染阶段期间,提供快速的结果,便宜,易于使用,并稳定在温度大于30°C用于农村地区,如果必要的42]。此外,诊断测试的预测能力的研究观察内部登革热系统具有良好的特异性和敏感性,并提供快速结果(3小时);而且它比商业更便宜的市场测试可用。血清学测试有一个中间价格相比,分子测试。事实上,当引用一个新的测试,实验室表明它应该考虑增加4-7-fold与试剂的价格。从这个意义上讲,“内部”的成本评估ELISA和商业ELISA试剂盒表明“内部”ELISA被证明是比商业的更便宜的设备,成本为8.20美元,而其他包有更高的成本,因为它是显示下一个:NS1抗原检测(18.80美元),IgM(22.62美元),免疫球蛋白捕获ELISA(24.04美元)。这一比例反映了每个测试方法的实际成本根据试剂的实际成本,实验室用品、文具、人员,以及间接成本电力、水、设备折旧等等。

最后,循环不止一个血清型的鉴定的直辖市Tezonapa (DEN1和DEN2)是一个警告信号,因为它可能倾向于增加严重的登革热的临床形式由于继发感染的存在不同的血清型,提升锁定感染增加的现象。我们建议使用重组NS3蛋白作为检测系统可行的选择在墨西哥,当商业工具不可用,至少第一次筛选。即使这个系统需要改进通过增加样本的数量,例如,专门从无症状的个体在墨西哥流行地区,增加其登革病毒的诊断准确性,重要的是要继续努力开发可靠的诊断工具,以便在登革热流行地区建立一个有效的监测系统。

资金

l . m . Alvarez-Rodriguez从CONACyT获得博士学位的奖学金,墨西哥(215334)。这项工作是支持格兰特从DGI rediv - 2007,大学Veracruzana a . Lopez-Monteon。

确认

作者要感谢QFB。亚迪莫兰Utrera技术援助和温迪del Rosio埃尔南德斯马丁内斯论文修改。作者宣称没有利益冲突的存在。