评价的遗传多态性利什曼虫braziliensis (v)隔离来自同一个病人之前和之后的治疗失败或活化皮肤病变

文摘

本研究的目的是研究遗传多态性利什曼虫braziliensis人口之前输入通过同工酶电泳,孤立从同一病人在两个不同的时刻:(A)的开始治疗前和治疗失败后(B)葡甲胺antimoniate或成功的初始治疗后重新激活。15双隔离进行评估后,使用多态分子标记LSSP-PCR和表现型分类法的分析。的基因资料30样本分为四个集群。只有两个病人A和B总标识隔离。大多数隔离了相似性系数从0.63到0.91不等。这组患者的遗传多态性可能是观察表明低相似性对隔离。结果显示遗传多态性的存在之间的孤立样本前处理和后重新激活或治疗失败,暗示可能分化的原始寄生虫种群的结构可参与抵抗治疗的机制或继发病变的ATL。这种现象是很重要的,尽管其他因素也可能涉及到在这种背景下,本文中讨论。

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在巴西,美国外皮的利什曼病(ATL)是普遍的特性,提出了区域,如发生严重的形式和抵抗治疗(1,2]。很少有药物用于ATL治疗。五价锑的药物仍然是首选的形式五价锑的(3),在巴西,它是用作葡甲胺antimoniate-Glucantime [4]。

应对ATL的治疗通常是有利的,但治疗失败或临床病例复活在一些流行地区已报告。定义的治疗失败是缺乏治疗后病变上皮形成;否则,重新激活的特点是丘疹的再现ATL周围皮肤的疤痕或可能发生后几个月或几年最初的临床治疗4,5]。耐药性的出现成为了一个重大的挑战在利什曼病(6,7]。这些挑战增强与艾滋病毒合并感染的发生,增加移民、环境的变化,难以控制疫情,引进新物种,或出现的亚种群8,9]。

针对检测基因多态性在寄生虫病人治疗失败或活化皮肤病变,低技术严格single-specific primer-polymerase连锁反应(LSSP-PCR)是用于15双隔离利什曼虫braziliensis分开在两个组:样品A-isolates获得初始损伤用五价锑(治疗前)和样品B-isolated相同病变的患者治疗失败后五价锑或重新激活成功初始治疗。

病人研究来自IPEC / FIOCRUZ和这项研究是研究伦理委员会批准下0016.0.009-02数量。的利什曼虫隔离和表征,茎酶电泳(MLEE)以下协议之前定义的(10]。

从样本中提取DNA是根据协议之前描述(11,12]。DNA是放大使用一对引物(BI: 5′-GGGGTTGGTGTAATATAGTGG-3′和B2: 5′-CTAATTGTGCACGGGGAGG-3′),针对变量地区kDNA minicircles(线粒体DNA)利什曼虫braziliensis复杂的物种(Viannia亚属)。

片段kDNA的750个基点利什曼虫braziliensis通过PCR是净化后使用向导PCR预备系统(Promega)制造商的指示。

LSSP-PCR反应进行了从750个基点的扩增片段single-specific底漆使用序列5′-GGGGTTGGTGTAATATAGTGG-3′。放大了像之前描述的12]。分析了放大产品1.8% 2%琼脂糖凝胶或琼脂糖凝胶(σ)可视化在紫外光照射下与溴化乙锭。LSSP-PCR方法的再现性评估与保留三个相同的条件下重复后观察到的配置文件。

LSSP-PCR乐队不同的从200年到750年英国石油公司使用比较简单的匹配相似度来确定比例系数对分离株之间的不匹配的乐队。相似矩阵转化为一个使用UPGMA系统树图的算法。与NTSYS-pc表现型分类法的分析程序(软件2.02版本,埃克塞特,Setauket,纽约,美国)。

所有的病人提出ATL皮肤表中的形式和细节1。所有隔离(样品A和B)分类学的分类利什曼虫braziliensisMLEE。分析的样品LSSP-PCR提出遗传多态性展示资料和不同程度的复杂性。

分子生物学技术都是有用的工具的物种鉴定和遗传多样性分析利什曼虫寄生虫。据我们所知,这是第一个工作报告LSSP-PCR分析成对隔离来自同一病变患者的ATL收购的开始治疗前和治疗失败或复活后的皮肤损伤。LSSP-PCR,发现基因多态性在样本ATL的典型和非典型临床表现的患者,包括寄生虫从损伤后复活13),证明LSSP-PCR是一个敏感的技术调查intrapopulation遗传变异性。我们的研究小组使用LSSP-PCR还证实intrapopulation遗传变异性,区分两个隔离来自同一病人之前和之后复活(13]。

共有12个乐队的分析后,本研究的样本分为四个集群。隔离13共享100%字符与参考株利什曼虫braziliensis。Intrapair遗传相似度(A和B) 100%双隔离2和3。其他人的相似范围从0,63为0,91。对分离株基因更多的差异化是5,6,12日和14日,A和B的隔离在不同的集群(图分组1)。

众所周知,损伤激活可以发生在16%的病例在治疗利什曼病(14)和血液寄生虫的持久性和ATL的伤疤也已经证明(2,15,16]。以前的或不规则治疗利什曼病的历史,存在三个或三个以上病变,疾病的长时间的进化,也存在相关的并发症可能治疗失败(17]。然而,其他因素可以参与相同的治疗失败病例没有这些条件的存在。最近类似和不同基因图谱被LSSP-PCR检测原虫艾滋病毒感染和non-HIV-infected病人隔绝,证明免疫系统中也扮演了重要的角色在寄生虫人口从损伤中恢复过来(18]。

在这项研究中,所有患者皮肤利什曼病的临床表现。只有两例皮肤损伤和传播他们的隔离(15 - 9)在集群分组2和3,分别。所有陪同患者获得临床治愈后再处理。最后五个病人经历了临床治愈后再处理第二药物(两性霉素B或喷他脒)的三个患者接受初步治疗intralesion注射。重复的其他患者治愈第一治疗计划。治疗使用低剂量或锑的替代计划已经成功了,尤其是并发症患者,儿童或老年人,高剂量可能会更多的有毒(14]。

本研究中使用的分子标记被用于调查intrapopulation遗传变异的一个重要工具来演示polyclonality和取向寄生虫种群(13- - - - - -19]。

在当前研究中13.33%(4/30)的样品显示相似指数等于1,其中包括双隔离病人2和3 (A和B)。这种对隔离从患者获得治疗失败后7个月(3)病人和14个月(病人2)。两个四个病人治疗失败的展示分为集群1和其他集群3。第一和第二分解动作之间的时间范围从18到21个月,建议临床开发的不同阶段的运行时间可能影响的基因图谱检测。在另一个样品或多或少intrapair相似性可以用更大的遗传多样性检测观察到隔离4、5、6、12和14。

在巴西,锑的治疗反应是有利的在利什曼病病例最多,与变量愈合率。然而,治疗失败在内脏和外皮的利什曼病是一个关心的问题在许多流行地区(2,17,20.]。从1998年到2010年,复活和治疗失败的患者诊断为ATL的Evandro恰加斯病临床研究Institute-Oswaldo克鲁兹基金会(IPEC-Fiocruz /里约热内卢)在15%的病人被告知。穷人应对所涉及的机制在利什曼病疗法迄今仍不清楚和监测这些案件可能有助于理解与耐药相关的因素(21]。不同的寄生虫种群可能参与传输周期和更强的抵抗力的人群的出现或能够引起非典型临床表现应该发现在这样的试图控制最终的情况下(22]。研究中的四个集群评估分组隔离从激活成功后患者的初始治疗。

分化的原始寄生虫种群的结构可以参与治疗耐药机制或病变LTA复活,而且内生代新多态性的现象,特别是在动基体DNA minicircles,被认为是进化更快比核DNA (23,24]。小寄生虫的出现亚种群的选择在活的有机体内或传播在体外很难确定在自然感染或感染复发,不能排除9]。使用八酶位点没有观察到isoenzymatic变异确凿的事实,LSSP-PCR分子标记,高度多态。进一步增加分子的研究在体外灵敏度表型五价锑和宿主的免疫机制可能是有用的工具来更好的理解这些人间病例的ATL的初始治疗失败或临床复发。

利益冲突

没有利益冲突声明。

确认

这项工作是由西班牙巴西友善(IKB),慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq)和Fundacao卡洛斯恰加斯德Apoio尽管带动做里约热内卢(FAPERJ)。c·巴普蒂斯塔得益于资金由Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量优越,斗篷(Coordenacao de Aperfeicoamento Pessoal教学)。a . o . Schubach和r·s·帕切科调查员CNPq Faperj,巴西。作者感谢Laboratorio de Vigilancia em Leishmanioses (VigiLeish-IPEC / FIOCRUZ)提供ATL患者的活检。

引用

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