的比较在体外邻苯二甲酸盐和替代增塑剂的内分泌活动

文摘

由于邻苯二甲酸酯的危害,法规减少了他们的使用,替代能源的需求增加。由于担心内分泌失调的邻苯二甲酸酯的性质,它被认为是必要的特别调查这些影响潜在的替代品。在这项研究中,我们比较了在体外内分泌活动的几个已经使用潜在的替代增塑剂(DEHT,掐灭,TOTM)或新的替代品(POLYSORB®异山梨醇和POLYSORB®ID 46)之一2邻苯二甲酸盐,DEHP和DINP。这些化学物质的影响3常见的内分泌干扰作用的机制,即。,interaction with estrogen receptors (ER), androgen receptors (AR), or steroidogenesis, were studied using extensively used在体外方法。在E-Screen试验,只有适度DEHP诱导MCF-7细胞增殖;没有其他的测试是雌激素或抗雌激素的物质。没有雄性或MDA-kb2 antiandrogenic活动细胞显示的任何测试邻苯二甲酸盐或替代品。另一方面,DEHP和DINP,以及DEHT掐灭,TOTM,打乱了类固醇生成H295R试验,主要是通过诱导雌二醇合成增加;没有这样的效果观察POLYSORB®异山梨醇和POLYSORB®ID 46。

1。介绍

邻苯二甲酸酯和邻苯二甲酸酯是有机合成化学物质的家庭主要用作增塑剂在高分子行业。它们尤其是用于生产聚氯乙烯(PVC),使其灵活和容易处理的。邻苯二甲酸酯是因此用于生产各种各样的文章如建筑产品、汽车产品、服装、运动器材、箱包,玩具,医疗设备(1- - - - - -4]。

邻苯二甲酸盐不绑定到PVC高分子化学,因此,他们可以从产品接触液体或脂肪或温度或pH值变化。他们因此可以释放到周围环境3,5,人类接触可以通过口服摄入发生,吸入,皮肤或肠外路线6,7]。一些邻苯二甲酸酯被描述为有内分泌失调的属性:事实上,许多研究表明,某些邻苯二甲酸酯antiandrogenic活动和诱导改变男性生殖系统开发后在子宫内或围产期暴露在雄性老鼠8- - - - - -10]。评论(4)得出结论:邻苯二甲酸酯暴露水平观察到人类男性生殖的影响,尤其是对bis (2-ethylhexyl)邻苯二甲酸酯(DEHP)和邻苯二甲酸二丁酯(菲律宾)。

因为越来越担心他们的有害影响,规定降低了邻苯二甲酸盐使用。四个邻苯二甲酸盐现在包含在附件十四的欧洲监管注册,评估,授权和限制的化学品清单非常高的物质(达到)关注需要授权使用前和被列为有毒繁殖(1 b级):邻苯二甲酸丁基基酯(BBP), DEHP,菲律宾,邻苯二甲酸二异丁基酯(DIBP)。在欧洲,一些邻苯二甲酸酯是限制使用的玩具和儿童保育的文章达到规定(附件十七):DEHP,菲律宾,BBP。在最近出版的一项修正案,附件十七(11),同样的限制将适用于DIBP 2020年7月后,这些4将限制邻苯二甲酸酯增塑的材料在一个广泛的产品(不仅仅是玩具和儿童保育的文章)。因此,DEHP,菲律宾,BBP, DIBP限制在绝缘电缆和电线的RoHS指令(有害物质限制)。一些限制使用邻苯二甲酸酯在与食品接触材料是由指令2007/19 / EC:禁止DIBP,特定的迁移限制食物DEHP,菲律宾,BBP, DIDP和DINP(连同其他物质)。此外,diisononyl邻苯二甲酸二(DINP)、酞酸二异癸酯(DIDP)和邻苯二甲酸二辛酯(DNOP)限制在玩具和儿童保育的文章可以放在嘴的孩子(达到附件十七)。关于几个类似的限制邻苯二甲酸酯是适用于美国(12]。此外,一些邻苯二甲酸盐(如菲律宾,BBP, DEHP)禁止在化妆品13]。

由于使用不同的邻苯二甲酸酯的毒性作用和限制,需要替换。许多替代增塑剂具有不同化学结构已经使用或发展。其中,1,2-cyclohexanedicarboxylic diisononyl酸酯(掐灭),偏苯三酸三tris-2-ethylhexyl (TOTM)和bis-2-ethylhexyl对苯二甲酸乙二醇酯(DEHT)已经用来替代邻苯二甲酸酯在各种各样的应用程序(14]。对苯二甲酸乙二醇酯非常类似于邻苯二甲酸盐和两个环替换占领para-positions代替邻位。DEHT, DEHP的结构异构体,是最常见的对苯二甲酸乙二醇酯和被用作商业替代等广泛应用在塑料玩具和儿童保育的文章中,电影,人行道上,剥离化合物,乙烯基产品,饮料闭包(14]。偏苯三酸三的TOTM用于高温应用,如PVC电缆显著提高提取和迁移阻力相对于其他DEHP的替代品(14]。掐灭用作替代等高卷和取代邻苯二甲酸酯增塑剂DEHP和DINP医疗器械,玩具,食品包装材料。

作为植物替代邻苯二甲酸盐,火箭公司已经开发了一个100% bio-sourced增塑剂、POLYSORB®ID 46。POLYSORB®ID 46的混合二元酸酯酯化的获得与植物性异山梨醇脂肪酸。POLYSORB®ID 46由以下成分组成:(3 r, 3 ar, 6年代,6 ar) -hexahydrofuro [3、2 b] furan-3 6-diyl dioctanoate, (3 s 3 ar 6 r, 6 ar) 6 - (octanoyloxy) hexahydrofuro [3、2 b] furan-3-yl癸酸盐,(3 r, 3, 6年代,6 ar) 6 - (octanoyloxy) hexahydrofuro [3、2 b] furan-3-yl癸酸盐,和(3 r, 3 ar, 6年代,6 ar) -hexahydrofuro [3、2 b] furan-3 6-diyl bis(癸酸盐)。这异山梨醇导数可以用来塑化聚氯乙烯。POLYSORB®异山梨醇是一种高纯度单体年级专门设计制造的许多聚合物和nonpolymeric衍生品如POLYSORB®ID 46。直接用作一个非常纯粹的单体或形式的导数(官能团单体或塑化剂),POLYSORB®异山梨醇提供有价值的解决方案性能材料市场:聚酯、聚碳酸酯、PVC、复合材料、涂料、聚氨酯、TPU等。POLYSORB®ID 46提供标准通用的主增塑剂的性能和出色的兼容性与PVC树脂加工性能。由于其效率很高,它可以被看作是一个替代的选择标准选择增塑剂。依法注册的化学防治的法律主要塑料生产领域,POLYSORB®ID 46,这已被许多毒理学研究的主题(不影响被观察到在体外和在活的有机体内基因毒性研究中,发育毒性研究中,90 - d和口头重复剂量毒性研究(15]),建议应用程序直接接触终端用户(医院地板、装饰室内表面、学校家具,等等)。

由于担心内分泌失调的邻苯二甲酸酯的性质,它被认为是必要的调查这些影响POLYSORB®ID 46和其他潜在的邻苯二甲酸盐的替代品。在这项研究中,我们旨在比较在体外内分泌活动的几个已经使用潜在的替代增塑剂(DEHT,掐灭,TOTM)或新的替代POLYSORB®ID 46之一2邻苯二甲酸盐,DEHP和DINP的电池在体外化验。我们也包括在研究单体POLYSORB®异山梨醇用于制造POLYSORB®ID 46。这些化学物质的影响3常见的内分泌干扰作用的机制,即。,interaction with estrogen receptors (ER), androgen receptors (AR), or steroidogenesis, were studied using extensively used在体外方法:MCF-7扩散试验(E-Screen试验)16),AR transactivation化验使用MDA-kb2细胞系[17),H295R类固醇生成试验(经济合作与发展组织(OECD)测试指南456号(18]。MDA-kb2分析类似于稳定转染人类雄激素受体转录激活试验检测雄激素的受体激动剂和拮抗剂活性化学物质使用AR-EcoScreen™细胞系,经合组织中描述的测试指南458号(19]。所有这些分析都包括在经济合作与发展组织的二级内分泌干扰化学物质的概念框架进行测试和评估(20.对应”在体外关于选择的内分泌机制分析提供数据(s) /通路(s)。”

2。材料和方法

2.1。化学物质

Bis (2-ethylhexyl)邻苯二甲酸酯(DEHP)来自默克,diisononyl邻苯二甲酸二(DINP), Bis (2-ethylhexyl)对苯二酸酯(DEHT)、偏苯三酸三,三羟甲基氨基甲烷(2-ethylhexyl)液(TOTM)来自Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier,法国),和1,2-cyclohexanedicarboxylic diisononyl酸酯从巴斯夫(掐灭)。所有这些化合物的纯度至少96%。POLYSORB®异山梨醇(纯度> 99.5%)和POLYSORB®ID 46(纯度> 96%(批YE008)或94.5%(批YE34))被火箭公司合成。杜尔贝科的修改鹰中(DMEM)和无酚红、胎牛血清的边后卫,贝克汉姆的l - 15中有或没有酚红,1:1的混合物杜尔贝科的修改鹰的媒介和火腿的F-12营养DMEM / F12培养基无酚红,磷酸盐(PBS)和charcoal-dextran剥夺的边后卫(CD /的边后卫)E-Screen化验来自Gibco(生活技术,佩斯利,英国)。17β雌二醇,ICI 182780 (fulvestrant)、二氢睾酮(DHT) hydroxyflutamide, forskolin,所选,CD /的边后卫MDA-kb2化验来自Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier,法国)。

邻苯二甲酸盐和替代品在DMSO可溶性或乙醇。在细胞培养基稀释实验时,溶剂浓度不超过0.1%。

2.2。E-Screen化验

MCF-7细胞增殖测定(E-Screen试验)进行描述的方法显示索托et al。16与修改()21]。

2.2.1。细胞培养

过量MCF-7细胞(总线股票)从公关。安娜索托(美国波士顿塔夫茨大学)。MCF-7细胞在DMEM培养基生长和维护补充5%的边后卫在37°C公司为5%₂和95%的湿度。

2.2.2。E-Screen化验

实验中执行24-well板块(猎鹰,康宁)细胞在培养基中被播种密度的15000细胞/好,允许附加24 h。镀附件年底期间,细胞用显微镜检查,以确保他们在良好的条件(附件、形态)剂量之前。细胞被洗PBS和暴露剂量的解决方案在一个实验中(无酚红DMEM补充5% CD /的边后卫)和孵化120小时37°C公司为5%₂和95%的湿度。对于每一个化合物,两个独立的受体激动剂和拮抗剂化验进行如下所述,可能调整范围浓度的2^nd化验。

(1)受体激动剂化验。每一个测试板包括7浓度的邻苯二甲酸盐或替代和溶剂控制(SC: DMSO溶液或0.1%乙醇)一式三份。每一次测试运行还包括积极的控制面板,在细胞暴露于5参考雌激素的浓度17β雌二醇(10⁻⁹-10年⁻¹⁰-10年⁻¹¹-10年⁻¹²-10年⁻¹³米)一式三份井。

(2)拮抗剂化验。计量解决方案在一个实验中补充固定E2浓度(1点)。每一个测试板包括5个浓度的邻苯二甲酸盐或替代品,溶剂控制(SC: DMSO溶液或0.1%乙醇),和ICI 182780(1纳米)参考抗雌激素的化合物,每一式三份。每一个测试板还包括3复制井与溶剂稀释在实验中没有E2。

(3)竞争受体激动剂试验确认。探讨ER参与DEHP-induced MCF-7细胞增殖,纯抗雌激素ICI的影响182780细胞增殖引起DEHP是检查21]。ICI 182780(最终浓度1海里)添加到媒体面前DEHP的最高浓度诱导细胞增殖。此外,E2(10点)添加了一个积极的控制。

(4)竞争对手分析确认。探讨ER参与DINP, DEHT-induced减少E2-induced MCF-7细胞增殖,提高E2浓度的影响对细胞增殖的抑制DINP, DEHT检查。细胞暴露在100和1000点E2在实验中补充了一个固定的DINP的浓度(30μ米)或DEHT (300μ米),这些浓度诱导E2-induced细胞增殖下降最大。作为比较的手段,溶剂,纯抗雌激素ICI 182780(1纳米),和挺(羰基氰化物3-chlorophenylhydrazone, 2.5μ米)作为细胞毒性的参考使用。

2.2.3。评估细胞增殖

为所有类型的化验,为期5天的曝光时间后,测定细胞密度在每一个总蛋白质是由测量内容使用sulforhodamine B (SRB)测定。计量介质被丢弃,细胞被固定用冷10% (w / v)三氯乙酸(Sigma-Aldrich) 30分钟在4°C。井被洗4次软化水和风干。染色了SRB的0.4% (w / v)的解决方案(Sigma-Aldrich) 1% (v / v)醋酸10分钟。井用1%乙酸去除游离SRB和风干。绑定SRB染料中可溶性三羟甲基氨基甲烷基础液的解决方案(10毫米,pH值10.5),和盘子被激动一盘瓶直到完全溶解染料。光密度(OD)确定使用SPECTROstar®纳米设备(BMG Labtech Champigny s /马恩,法国)在530 nm波长690 nm参考。考虑中包含的蛋白质实验中,平均od530 - 690的价值3背景井孵化与实验中没有细胞从od530 - 690减去价值的。

相对应的增殖效果,od530 - 690价值的比值获得每个化合物的浓度和溶剂的od530 - 690价值控制,计算每个化合物的浓度。每个邻苯二甲酸盐或替代浓度数据被表示为平均值±标准偏差(SD)一式三份。

2.2.4。统计分析

在受体激动剂和拮抗剂化验,统计分析使用Dunnett的测试比较每个浓度的测试项引起的细胞增殖与细胞增殖中观察到溶剂控制兴奋剂检测,和溶剂控制与E2拮抗剂化验。受体激动剂试验确认,增殖效果之间的差异观察有无ICI 182780人使用Mann-Whitney测试相比。统计软件GraphPad InStat 3.10版本是用于分析。差异被认为是重要的 。

2.3。MDA-kb2雄激素受体Transactivation化验

AR transactivation化验使用MDA-kb2细胞最初Wilson所描述。17)本质上是根据协议执行修改Ermler et al。22]。经济合作与发展组织(OECD)中描述的方法TG没有45819)是用于结果分析和解释。

2.3.1。细胞培养

MDA-kb2细胞系(写明ATCC crl - 2713)获得了来自美国文化集合类型(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。MDA-kb2细胞生长和维护莱博维茨的l - 15中补充10%胎牛血清,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素在37°C没有有限公司₂。

2.3.2。MDA-kb2化验

在电镀之前,细胞被驯化为24小时在一个实验中,由作者莱博维茨的l - 15中无酚红补充charcoal-dextran-treated 10%胎牛血清和青霉素和链霉素。细胞被镀在96 -白色光度计板的密度5×10⁴在50个细胞/好μL实验介质和允许附加24 h。细胞也相同的镀在标准96 -孔板致力于MTT细胞毒性试验。在附件的最后时期,2 x-concentrated计量解决方案直接添加一式三份的井白色和标准板。盘子简要激动在盘子里瓶,然后回到20到24 h的孵化器。对于每一个化合物,两个独立的受体激动剂和拮抗剂化验进行如下所述,可能调整范围浓度的2^nd化验。

(1)受体激动剂化验。计量解决方案在一个实验中,包含溶剂,测试化合物,或参考雄激素DHT目的最终浓度的两倍。七稀释每个邻苯二甲酸盐或替代的准备,以及7的DHT(最终浓度稀释10⁻¹²到10⁻⁶米)。

(2)拮抗剂化验。计量解决方案在一个实验中补充0.5 nM DHT (0.25 nM)预期的最终浓度的两倍,包含溶剂,测试化合物,或参考抗雄激素hydroxyflutamide在预期的最终浓度的两倍。六稀释每个邻苯二甲酸盐或替代的准备,以及从10 6稀释hydroxyflutamide(最终浓度⁻¹⁰到10⁻⁵米)。此外,增加了溶剂控制没有DHT 3井。

(3)竞争对手分析确认。以防实际对手之间的歧视效应和非特异性效应(如cytotoxicity-related效应)被认为是必要的,竞争对手分析确认与测试项进行浓度诱导的最大效应在标准拮抗剂化验和增加双氢睾酮的浓度。计量解决方案准备在实验中补充测试项目预期的两倍浓度和包含增加参考雄激素睾酮的浓度(最终浓度0 - 0.1 - 0.25 - 0.5 - 1 - 5和10海里)。此外,计量解决方案包含增加双氢睾酮的浓度也准备在实验中补充与溶剂或hydroxyflutamide(最终浓度1μ米)或挺(羰基氰化物3-chlorophenylhydrazone,最终浓度10μ米)作为antiandrogenic和细胞毒性的参考化合物。

2.3.3。评估细胞的生存能力

最后20到24 h曝光时间,细胞生存能力测量专用板使用比色MTT (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴)试验(23]。所有井都清空,MTT(0.5毫克/毫升)的溶液中无酚红的添加到每个。盘子被孵化2 - 2.5小时37°C。包含MTT然后删除中,异丙醇/盐酸1 N的混合添加到井中。风潮下的板被放置在振动板,直到完全溶解甲瓒晶体。光密度测定使用SPECTROstar设备在570 nm波长640 nm参考。

细胞生存能力表示相对于溶剂的平均响应控制井,只有浓度诱导至少80%的可行性进行了分析。

2.3.4。测量的荧光素酶活性

20 - 24 h后曝光时间,荧光素酶活性测定在白色的96孔板。盘子被清空,DMEM没有酚红和Steady-Glo®荧光素酶检测系统试剂(美国麦迪逊Promega)添加到井中。板块在500 rpm搅拌10分钟的轨道板瓶,和发光测量用光度计(Tecan无限®光民,Tecan,瑞士)。发光信号为背景(井没有细胞)和纠正表达相对光单位(RLU)。

2.3.5。分析的结果

结果的分析和解释根据经合组织(OECD)中描述的方法进行TG 45819]。相对转录活动(等)计算每个浓度的邻苯二甲酸盐和替代品。在兴奋剂检测,等相对于DHT 10 nM,设置为100%,计算由以下方程:

在对手化验,等相对于溶剂与DHT控制,设置为100%,并计算了以下方程:

对于每个浓度,等被表达为一式三份的平均数±标准差井。如果合适,诱导等相应的浓度到10%和50%的DHT (PC 10 nM的影响₁₀和电脑₅₀)测定受体激动剂化验,诱导浓度30%和50%抑制转录活动引起的溶剂与DHT (IC控制_30.和集成电路₅₀在对手化验)测定。受体激动剂测定的物质被认为是积极的,如果电脑₁₀可以计算出至少2 2或3化验;物质被认为是积极的对手分析集成电路_30.可以计算出至少2 2或3的化验。

竞争对手化验,确认相对荧光素酶活性溶剂相比控制(设置为1)计算RLU除以测量在每个平均RLU以SC井。

2.4。H295R类固醇生成分析

H295R类固醇生成试验执行根据经合组织的TG 456号(18和检验员等。24,25]。两个独立的进行了化验,潜在的调整范围浓度的2^nd化验。

2.4.1。细胞培养

人类腺癌H295R细胞系(NCI-H295R写明ATCC crl - 2128)购买的写明ATCC(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。细胞培养在1:1的混合物杜尔贝科的修改鹰的媒介和火腿的F-12营养(DMEM / F12)无酚红,补充2.5% Nu-Serum™(康宁)和1% +预混料(胰岛素,转铁蛋白,亚硒酸,牛血清白蛋白,亚油酸,康宁公司)在37°C公司为5%₂和95%的湿度。解冻后,H295R细胞种植在实验开始前5到10通道。

2.4.2。曝光

实验在24-well板细胞最初播种密度250000细胞/好,允许附加24 h。测试板包括7化学浓度和溶剂控制(SC: DMSO溶液或0.1%乙醇)一式三份。质量控制(CQ)板块被包含在每一次测试运行中,并且由2浓度的类固醇生成诱导物forskolin(1和10μM), 2抑制剂所选的浓度(0.1和1μM),一个空白(培养基)n和SC (DMSO 0.1%)一式三份,以及6井致力于细胞毒性参考,乙醇70%的末尾添加了曝光。测试和QC板块在37°C和5%孵化有限公司₂48 h。最后48 h曝光时间,媒介在每个收集和离心机之前消除粒子激素测量(3000 rpm, 10分钟)。防止细胞干燥、PBS是之前添加到每个细胞生存能力评估。

2.4.3。细胞生存能力评估

在每个细胞生存能力分析使用MTT试验如前所述。细胞生存能力表示相对于平均响应SC井,被认为是100%可行的细胞,使用下面的公式计算,与EtOH井正在考虑100%死细胞:

井与生存能力低于80%相对于溶剂的平均生存能力控制并不包括在最终的数据分析。井的可行性在80%和85%之间相对于溶剂的平均生存能力控制,激素浓度修正根据相应的可行性,以避免任何误解的潜在的激素调节。

2.4.4。激素测量

睾酮(T)、雌二醇(E2)测量进行离心上清液使用适当的ELISA试剂盒(睾酮和雌二醇参数™ELISA包、研发系统)根据制造商的指示,需要一些修改优化:T和E2标准和样品分析在细胞培养基稀释血清代替工具包中提供的稀释剂。试验开始前,干扰测试进行测试潜在的干扰测试的项目与激素测量系统。

评价激素生产的相对变化对每个邻苯二甲酸盐或替代的浓度,结果表示为褶皱变化相对于意味着溶剂控制在每一个测试板。对于每个激素,褶皱变化对每个计算如下:

每个邻苯二甲酸盐或替代浓度数据被表示为平均值±标准偏差(SD)一式三份的褶皱变化井。

2.4.5。统计分析和结果解释

分析结果根据经合组织(OECD)中描述的方法进行TG 45618]。之前进行统计分析,正常的假设是评估使用Kolmogorov-Smirnov测试。数据正态分布时,化学组和溶剂浓度控制之间的差异进行了分析使用Dunnett的测试。当数据不是正态分布,化学组和溶剂浓度控制之间的差异进行了分析使用Mann-Whitney测试。统计软件GraphPad InStat version 3.10(美国加州圣地亚哥GraphPad软件)是用于分析。差异被认为是重要的 。

一种物质被认为是积极的,如果折叠变化E2和/或T统计不同溶剂浓度控制在2相邻浓度至少2独立化验(18]。

3所示。结果

3.1。雌激素活性E-Screen测定邻苯二甲酸盐的替代品

DEHP是唯一化合物诱导显著增加MCF-7细胞增殖与溶剂控制兴奋剂E-Screen化验(图1(一))。这显著增加,然而,温和,最高5.25的增殖效应DEHP浓度为3.10⁻⁵M,对应大约30%的增殖效应引起的雌二醇。统计上显著的增加细胞增殖也观察到与DEHT(图1 (b)),但是非常弱的增殖作用(低于两次溶剂中的扩散控制和低于10%的增生性E2)引起的效应,这种效应,观察到10的浓度⁻⁴米,并不被认为是相关的。没有其他的替代品,或DINP,引起任何显著增加MCF-7细胞增殖在浓度范围从10⁻⁹M 10⁻⁴到10⁻³M(图1)。

3.2。抗雌激素的活性E-Screen测定邻苯二甲酸盐的替代品

没有显著减少E2-induced MCF-7观察细胞增殖DEHP,掐灭,TOTM, POLYSORB®异山梨醇,或POLYSORB®ID 46浓度从10⁻⁸到10⁻⁷M 10⁻⁵到10⁻⁴M。只有DINP和DEHT诱导显著降低E2-induced MCF-7细胞增殖(图3)。然而,对于这两种化合物,这只是观察到在最高浓度,即。DINP 3.10⁻⁵M和DEHT 3.10⁻⁴M,竞争分析中E2浓度增加(图的存在4),效果被认为是特异性的。事实上,观察每个E2增殖的抑制浓度和溶剂之间的DINP或DEHT与E2浓度增加,没有减少,就像这里182780。此外,抑制引起DINP 30μM是相当低。

3.3。(反)雄激素的活动邻苯二甲酸盐和替代品的AR基因记者MDA-kb2细胞试验

只诱导浓度超过80%相比可行性控制MTT试验分析了基于“增大化现实”技术的活动。所有的测试化合物诱导在体外AR兴奋剂活动MDA-kb2测定浓度范围从10⁻⁹米到10⁻⁴或10⁻³M(图5)。

显著降低DHT-induced观察荧光素酶活性只有在邻苯二甲酸酯的分析浓度最高DEHP和DINP,即。,10⁻⁴米和10⁻³分别为M(数字6(一)和6(b))。这些减少不是通过增加双氢睾酮的浓度(图逆转6(c)),因此不被认为是由特定antiandrogenic机制。没有5研究替代品引起任何DHT-induced减少荧光素酶活性浓度从10⁻⁸米到10⁻⁴或10⁻³M(图7)。

3.4。邻苯二甲酸盐和替代品的雌二醇和睾酮生产H295R类固醇生成化验

只有noncytotoxic浓度被包含在分析;诱导浓度小于80%相比可行性控制MTT试验没有激素生产分析。DEHP诱导H295R E2产量显著增加细胞相比,溶剂浓度控制在2附近,即。1和3μ米,最大效应(2倍)被观察到3μM(图8)。较弱(最大的1.3倍),但统计上显著的增加T生产也观察到在同一浓度(图9)。E2 DINP也诱导显著增产7点相邻的浓度,从0.03到30μ米,最大效应(4.7倍)观察到30μM(图8)。弱(1.3倍),但统计上显著的增加T生产也观察到从1到30μ米没有任何浓度效应关系(图9)。

DEHT诱导显著提高E2生产4相邻浓度,从10到300μ米,最大效应(2.6倍)观察到300的浓度μM(图8)。弱者(1.2倍)和零星的效果观察30 T生产中间浓度μ米是不被认为是重要的(图9)。掐灭诱导显著提高E2生产4相邻浓度从0.1到3μ米,最大效应(4倍)观察到3的浓度μM(图8)。弱但显著增加T生产也观察到1和3μM(图9),1.6倍的最大效应诱导浓度的3μm . TOTM诱导显著提高E2生产4相邻浓度,从0.3到10μ米,最大效应(2倍)被观察到10μM(图8)。弱者(1.3倍),但统计上显著的变化在T生产观察到只有一个单浓度(10μ米)并不认为是重要的(图9)。

POLYSORB®异山梨醇和POLYSORB®ID 46没有引起任何显著变化E2或T产品浓度高达1000μ米和100μ分别为M(数字8和9)。

4所示。讨论

由于限制的使用几个邻苯二甲酸盐,替代品的生产和使用正在增加。在目前的研究中,我们针对比较2邻苯二甲酸酯的影响,DEHP和DINP,邻苯二甲酸盐的替代品,在在体外化验允许检测(反)雌激素(反)雄性,或steroidogenesis-disrupting化合物。很好的描述E-Screen试验是用来检测(反)雌激素的活动(16,21]。调查(反)雄激素的活动,一个使用MDA-kb2 AR transactivation测定细胞(17),类似于458年经合组织TG分析描述(19),执行。对甾类产生的影响进行了研究与H295R类固醇生成分析描述456年经合组织TG (18]。

邻苯二甲酸盐的替代品,我们研究了DEHT、TOTM掐灭,POLYSORB®异山梨醇,和POLYSORB®ID 46。

在全球范围内,我们的研究结果对邻苯二甲酸酯DEHP和DINP表明他们都H295R细胞雌二醇产量增加;虽然统计学意义,弱者增加睾酮的生产被认为是低相关性。只有DEHP适度E-Screen测定雌激素,这些2邻苯二甲酸酯是雄性或antiandrogenic MDA-kb2化验。我们的结果对DEHP类固醇生成得到的只是部分对应的Mankidy et al。26),显示在H295R细胞不仅增加生产E2也减少睾酮生产。减少睾酮生产也在另一项研究中观察到H295R细胞和人类睾丸外植体(27];相反,Hadrup et al。28没有显示任何H295R睾酮生产细胞的变化。根据一个假想的行动模式DEHP,显著降低睾丸激素类固醇生成试验生产预计,这在我们的结果并非如此。应该注意的是,在活的有机体内DEHP是水解几个代谢物。其中,MEHP和2-ethyl-hexanal已经被证明能够影响类固醇生成MA-10老鼠睾丸间质肿瘤细胞(29日]。缺乏的代谢系统在体外经常指出的内分泌干扰作用的分析,可以认为这可以解释我们的结果。然而,Desdoits-Lethimonier et al。27)表明,在人类睾丸外植体和H295R细胞,DEHP是加工成MEHP,后者进一步加工成5 oh-mehp。

关于我们E-Screen化验结果,MCF-7 DEHP的细胞的增殖作用也观察到大久保et al。30.)和塔Das et al。31日),后者的研究也报道ER的扩散α消极的mda - mb - 231细胞,ER-dependency质疑的回应。我们的结果而建议相反,MCF-7 DEHP诱导细胞增殖抑制182780年抗雌激素的ICI。ER基因的文献中,结果记者DEHP化验也异构:DEHP没有引起任何雌激素反应MVLN transactivation记者分析(26,32]或呃α激活在她α-HeLa9903细胞(33),呃α-HEK细胞(34),或会阴细胞(35];重组体人呃DEHP是负面的α分析(33]。相反,一个ER受体激动剂α活动显示在CHO-K1 transactivation测定细胞(36]。没有对手的活动中所示αtransactivation化验(34,36但DEHP ER展出β介导的抗雌激素的活动(36]。

同样,我们的结果在MDA-kb2分析对应于在其他研究中发现的一些结果。在MDA-kb2细胞,恩格尔et al。34DEHP)没有显示任何兴奋剂活动,但它作为拮抗剂。沈et al。35]报道雄性和高浓度的DEHP (10 antiandrogenic活动⁻⁴米)在MDA-kb2细胞。在类似的在体外模型,DEHP是雄性和antiandrogenic [36- - - - - -39]。

较少的数据被发现在文献中关于邻苯二甲酸DINP。没有数据被发现有关在体外类固醇生成,但在活的有机体内Borch et al。9]显示睾丸睾酮产量下降。我们所知,掐灭以前没有研究E-Screen化验,但从其他的结果在体外求偶性分析中与我们的发现在全球协议E-Screen化验。事实上,在急诊室αtransactivation化验,DINP不作为受体激动剂(32,34,36];呃α拮抗剂活性显示在一些研究[34)而不是其他人32,36]。在在体外AR transactivation MDA-kb2细胞或其他化验,没有明显的受体激动剂或拮抗剂活动观察DINP [34,36,37]。这证实了我们的结果在MDA-kb2细胞。

关于邻苯二甲酸酯替代掐灭,恩格尔et al。40]报道H295R类固醇生成化验轻微而不是统计学意义刺激浓度雌二醇合成的10μ米和100μM和睾酮合成的100的浓度μm .在我们的结果,然而,掐灭诱导雌二醇显著增加生产H295R细胞。在另一个在体外类固醇生成模型,掐灭了两相的影响胎儿睾丸间质细胞睾酮生产在体外,增加睾丸激素生产10⁻⁶高浓度的M,并减少10⁻⁴米(41]。类似于我们的结果E-Screen化验和AR transactivation测定MDA-kb2细胞,掐灭不诱导或抑制ERα,呃β,或基于“增大化现实”技术的游戏活动基因记者化验在ERα-HEK,呃β-HEK, MDA-kb2细胞(40]。

关于2其他增塑剂DEHT TOTM,不表现出任何雌激素或抗雌激素的活动E-Screen化验或任何雄性或antiandrogenic AR基因活动记者MDA-kb2细胞试验。然而,在H295R类固醇生成试验,他们都诱导细胞明显升高雌二醇生产。

总的来说,当比较是可能的,我们的结果发表类似的电池测试数据。

我们在这项研究中还包括一个新的代替邻苯二甲酸盐,POLYSORB®ID 46,和单体用于制造、POLYSORB®异山梨醇。类似于其他测试的替代品,他们两人在E-Screen雌激素或抗雌激素的试验或雄性antiandrogenic AR基因记者MDA-kb2细胞试验。有趣的是,在与所有其他测试化合物(邻苯二甲酸盐和其他替代品),POLYSORB®异山梨醇和POLYSORB®ID 46没有引起任何显著影响H295R类固醇生成化验。

5。结论

除了DEHP E-Screen表现出温和的雌激素活性的测定,结果,没有一个测试E-Screen测定雌激素或抗雌激素的物质,或雄性antiandrogenic在MDA-kb2 AR transactivation测定细胞。在全球范围内,DEHP和DINP邻苯二甲酸盐以及DEHT掐灭,TOTM H295R类固醇生成的中断试验,主要是通过诱导雌二醇合成的增加。相比之下,没有这样的效果观察POLYSORB®异山梨醇和POLYSORB®ID 46。因此,他们代表了有趣的邻苯二甲酸酯替代候选人。当比较是可能的,我们的结果是全球类似于可用的发布数据,这意味着这组非常强劲,这些测试在体外数据相关。的电池在体外分析是为了确定是否有进行的,不信,任何警报。在我们看来,是触发警报,一个在活的有机体内下结论之前需要确认。

数据可用性

原始数据用来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的出版。

确认

这是由火箭公司工作。

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