镉暴露雄性C57BL/6小鼠胰岛素分泌减少但葡萄糖稳态不变

摘要

镉(Cd)是一种众所周知的有毒金属元素，广泛分布于环境中。镉对大多数器官都有毒性。越来越多的证据表明，乳糜泻暴露与胰岛功能障碍和糖尿病的发展有关，但相关性仍存在争议。本研究旨在评估慢性镉暴露对雄性C57BL/6小鼠糖代谢的可能影响。小鼠腹腔注射CdCl₂解决方案(1 mg.kg⁻¹)，每周两次，共24周。每周测量空腹血糖(FBG)水平和体重。24周后进行腹腔糖耐量试验(IPGTT)、腹腔胰岛素耐量试验(IPITT)和空腹血清胰岛素(FSI)水平试验。胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰腺β细胞功能指数(HOMA-β)进行计算和分析。采用实时荧光定量PCR检测小鼠肝脏胰岛素受体(IR)的表达。采集胰腺组织进行组织学检查。结果表明FBG、IPGTT、HOMA- ir和HOMA-βCD暴露和对照小鼠之间是相同的。在合同中，与对照小鼠相比，IPitt的曲线（AUC）和IR在肝脏肝脏中的瓣膜（AUC）下的面积的平均血清胰岛素水平和IR表达降低。CD给药诱导胰岛萎缩和胰岛下降。结果表明，CD曝光降低了胰岛素分泌，并在雄性C57BL / 6小鼠中维持葡萄糖稳态，应在长期暴露于CD的群体中监测胰腺功能。

1.介绍

糖尿病(DM)是全球死亡和残疾的主要因素。发展中国家和发达国家的糖尿病发病率都在迅速增长[1，2］．遗传和环境因素都通过诱导胰岛素抵抗和糖尿病的发展β-cell功能障碍[3.，4］．然而，遗传因素的改变并不能解释近几十年来糖尿病患病率的快速增长。因此，环境因素可能是了解这种流行病的关键[5，6］．

镉(Cd)是地壳中发现的一种金属元素，在环境中大量存在，特别是在工业和城市化地区。镉是一种非必需的人体代谢微量元素。然而，一般人群中存在低水平的乳糜泻[7］．个人很容易通过吸烟、受污染的食物或水以及职业接触接触到Cd [8］．据报道，接触镉会对肺、肝、睾丸、肾和骨组织造成损害[9］．最近，乳糜泻被认为是人类和啮齿动物的内分泌干扰物[10，11］．流行病学和实验研究调查了镉暴露与糖尿病发病之间的可能联系[7- - - - - -11］．这些研究表明，cd诱导胰岛功能、胰岛素分泌和胰岛素活性的变化，影响血液胰岛素水平和葡萄糖代谢[10- - - - - -12］．据报道，接触镉的冶炼工人与非接触镉的工人相比，空腹血清胰岛素水平显著降低[13］．然而，cd诱导葡萄糖稳态破坏的确切机制尚不清楚[14，15］．为了进一步研究该主题，在雄性C57BL / 6小鼠中研究了长期低剂量Cd暴露对葡萄糖稳态的影响。

2.材料和方法

2．1．动物研究

8周龄雄性C57BL/6小鼠由苏州大学动物中心提供，由当地动物伦理审查委员会推荐。所有小鼠在23±2°C条件下饲养，每组5只，光照和黑暗周期12小时。他们被提供标准的食物和自由饮水。只有在禁食时才会停止进食。

将小鼠随机分为对照组(Con小鼠)和慢性Cd暴露小鼠(Cd小鼠)。每组10只老鼠。Cd组小鼠腹腔注射CdCl 1 mg/kg，每周2次₂对照组小鼠注射生理盐水(0.9% NaCl)。

在实验期结束时，通过在一般麻醉（10％氯水合物）下，在过夜禁食后的心脏穿刺，将血液收集到普通管中，抗凝血剂。以宫颈脱位以后处死小鼠。使血液在室温下凝块10分钟，然后在4℃下以3000×g离心10分钟以获得血清。血清储存在-20℃直至胰岛素分析。除去胰腺并置于4％神经缓冲福尔马林中，用于固定。除去其他器官，加权并在-80°C中储存。

2．2.分析方法

从尾静脉采集血糖水平，使用ACCU-CHEK Performa试剂盒(Roche Diabetes Care, Mannheim, Germany)测量血糖水平。采用小鼠胰岛素酶联免疫吸附测定试剂盒(F5618-B，中国三甲)测定血清胰岛素浓度。

2．3.腹腔糖耐量试验(IPGTT)

所有小鼠在第24周的第一个晚上被禁食。次日上午行IPGTT。小鼠注射葡萄糖溶液(2 g/kg体重;分别于血糖负荷后0、15、30、60、120 min测定D-(+)-葡萄糖水平。

２.４.胰岛素耐受试验(IPITT)

第24周第6天进行IPITT治疗。小鼠禁食6小时，腹腔注射人常规胰岛素(0.75 U/kg体重)(中国万邦)。分别在注射胰岛素后0、15、30和60分钟测量血糖水平。

2．5．胰岛素抵抗指数

HOMA- ir指数(稳态模型评估胰岛素抵抗HOMA- ir)和HOMAβ-细胞指数(稳态模型评估β细胞指数、HOMA -β)，根据空腹胰岛素和葡萄糖浓度计算胰岛素抵抗和β细胞的功能(16，17］．使用的等式如下：HOMA-IR =（FSI×FBG）÷22.5;homa-β= (20×fsi) ÷ (fpg-3.5)。FSI为空腹血清胰岛素浓度(mU/L)， FBG为空腹血糖(mmol/L)。

2.6。组织学检查

胰腺组织样品固定在4％神经缓冲福尔马林中，脱水，并嵌入石蜡中。嵌入式组织在5-分开μm厚，并用苏木精伊红染色。采用光学显微镜(CKX41, OLYMPUS, Tokyo, Japan)观察组织学特征。每个胰腺切片至少观察25个不同区域，并使用Image Pro Plus 6.0对所有胰岛进行计数和测量。

2.7。实时/定量聚合酶链反应(PCR)

用Trizol试剂(Takala)提取肝脏总RNA。RNA浓度用NanoDrop 2000c, Thermo测定。用Hifair II 1 Stand cDNA Synthesis SuperMix (Yeasen)反转录成cDNA。使用SYBR Green Master Mix (Yeasen)对胰岛素受体(IR)进行实时PCR扩增。应用生物系统公司7500对样本进行了40次重复测试。cDNA扩增前，在95℃预变性5 min。PCR条件为95℃变性50 s，退火，60℃引物延伸30 s，共40个循环。测量周期阈值，比较Ct值计算IR基因的相对表达量。分别从Pubmed的基因序列中设计引物。引物序列如下:β-actin，5'-tgcgcctgcagagattcaag-3'（向前）和5'-aggtaacgccaggaattgttgcta-3'（反向）;IR，5'-TTTGTCATGGATGGGGCTA-3'（前进）和5'-CCTCATCTTGGGGGTTGAACT-3'（反向）。

2.8。统计分析

数据以平均值±SEM表示。数据录入Excel 2011，采用单向分析进行统计学意义分析T.Mann-Whitney U测试。采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。P值<0.05被认为是显著的。

结果

３．１．体重和体重增加

在本研究中，暴露于Cd对小鼠的体重或体重增加没有显著影响。12周后，所有小鼠的平均体重基本没有变化，如图所示1．

３.２．慢性镉暴露降低小鼠胰岛素分泌

所有小鼠均禁食过夜，并于第24周测定空腹血糖和胰岛素水平。慢性镉暴露对空腹血糖没有影响(图)2（a））.然而，cd暴露显著降低了治疗小鼠的空腹胰岛素水平(图)2（b））.胰岛素降低没有引起雄性C57BL/6小鼠血糖水平的变化。

3．3.慢性镉暴露没有改变小鼠的胰岛素抵抗

HOMA- ir和HOMA-无显著差异β在两组之间(图3.）.慢性镉暴露不会增加小鼠的胰岛素抵抗。两组小鼠IPGTT曲线下面积(AUC)相同4(一)和4 (b)）.与对照组相比，cd暴露小鼠IPITT的AUC明显降低(图)4 (c)和4 (d)）.

3.4。慢性Cd曝光在胰腺中诱导胰岛萎缩

组织病理学检查显示，对照组胰腺切片结构正常(图)5(一个)(一)和5(一个)（c）），虽然来自慢性CD曝光小鼠的胰腺组织显示胰岛萎缩（图5(一个)（乐队5(一个)(D))。计算了胰腺切片中胰岛的数量，两组之间没有差异(图)5 (b)）.然而，与对照组小鼠相比，Cd组的胰岛平均面积明显减少(图)5 (c)）.

3．5．慢性镉暴露降低小鼠肝脏胰岛素受体基因的表达

Real-Time-PCR显示cd暴露小鼠肝脏IR mRNA水平显著降低(p<0.01)。肝脏IR基因表达数据显示，与对照组相比，Cd暴露小鼠肝脏IR基因表达降低了约50%(图)6）.

4.讨论

糖尿病发病率在世界范围内呈上升趋势。越来越多的证据显示，环境污染物可能在这种增加[18，19］．本研究评估了慢性镉暴露对小鼠葡萄糖稳态的影响。

Cd暴露24周后，Cd暴露小鼠的FBG水平与对照组相同。Cd暴露没有改变治疗小鼠的葡萄糖稳态，IPGTT分析进一步证实了这一点。这些结果与一项人群研究一致，该研究发现，乳糜泻暴露与2型糖尿病风险增加无关[20.］．关于cd引起的高血糖有相互矛盾的数据。其他研究表明，镉暴露和葡萄糖代谢改变可能会导致类似糖尿病的高血糖[19］．一些动物研究报告称，镉暴露可导致高血糖[21，22］．然而，这些研究的实验条件与本研究不同。首先，其他研究采用大鼠作为动物模型，本研究采用小鼠作为动物模型。在葡萄糖稳态方面，小鼠可能比大鼠有更好的代偿功能。这可以解释为什么暴露在cd环境下的小鼠在胰岛素水平下降的情况下仍能保持正常的葡萄糖稳态。其次，其他研究是急性或亚慢性暴露模型。其他研究中的cd暴露时间比这项研究短得多[22，23］．据我们所知，目前的研究是持续时间最长的镉暴露研究。不同种类和时间的镉暴露可能导致了不同的结果。

与不变的FBG水平相比，CD暴露显着降低小鼠的禁食血清胰岛素水平，这与先前的研究一致[21，22］．我们的研究没有分析Cd的分布，这是我们研究的局限性。胰腺是Cd积累的主要部位之一[24，25］．因此，Cd暴露小鼠空腹胰岛素水平的降低表明Cd可能对胰腺产生直接毒性作用。组织学检查显示cd暴露小鼠胰岛的相对面积明显减少。胰岛素分泌减少和血糖稳态不变之间差异的原因尚不清楚。可能是cd剂量小鼠的FSI和胰岛萎缩的变化太小，对葡萄糖稳态没有生理影响。也可能有其他原因需要进一步调查。

更有趣的是，CD曝光在本研究中的IPITT显着降低。这可能是CD暴露小鼠的基线胰岛素水平小于对照小鼠。因此，外源性胰岛素可能对CD暴露的小鼠具有更大的效果，这意味着CD暴露并不损害组织敏感性对胰岛素的敏感性。Homa-IR和HOMA-的结果β同时确认胰岛素敏感性不变。然而，流行病学研究发现，乳糜泻暴露与胰岛素敏感性降低之间存在显著相关性[26，27］．有报道称，胰岛素不敏感的特征是胰岛素受体(IR)信号的缺陷，而IR下调是胰岛素不敏感的一个公认的因素[28，29］．然而，在本研究中，cd暴露小鼠肝脏中IR显著下调并没有导致胰岛素不敏感性。到目前为止，这个话题仍然定义不清。

本研究有两个局限性。首先，研究了一组CD暴露组，无法调查CD的剂量 - 反应关系。其次，没有确定器官的CD含量。几项研究报告说，胰腺是CD和CD暴露的靶器官之一，在胰腺中产生了时间依赖性的CD积累[16，30.，31.］．推测胰腺中胰腺中的大量CD浓度进行了推测。在这种长期CD曝光研究中，CD暴露的小鼠没有显示体重和明显毒性的任何变化。它表明，施用于目前研究中的小鼠的CD水平是对环境暴露水平的参考。

综上所述，本研究证实慢性Cd暴露降低了雄性C57BL/6小鼠胰岛素分泌，但维持了血糖稳态，补充了当前低Cd暴露与胰腺毒性关系的知识。镉暴露对胰岛素敏感性和葡萄糖稳态的影响有待进一步研究。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

李晓银、李孟阳对本文贡献相同。

致谢

国家自然科学基金(no . 81773414;81673151)。

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