评价皮肤刺激和急性、亚急性口服毒性薰衣草兔和小鼠的精油

摘要

薰衣草在埃塞俄比亚中北部Ankober地区的传统和民间医药中，用于治疗几种牲畜和人类疾病。本毒性研究旨在调查L.沙枣精油对小鼠口腔毒性和家兔皮肤刺激性。L.沙枣气相色谱-质谱法分析挥发油中桉油精(52.36%)、樟脑(11.91%)、-萜烯(8.775%)和龙脑(7.585%)的优势。使用2000 mg/kg剂量的极限试验L.沙枣精油急性毒性试验，发现LD₅₀值高于2000 mg/kg。亚急性毒性研究:每只小鼠口服2000mg/kg，持续21天。结果显示，小鼠体重、生化指标、大体异常、饮水和摄食量均无显著变化(p > 0.05)。肾脏和肝脏的组织病理学分析未见肉眼改变。用于皮肤刺激试验，用10%的软膏配方处理兔皮肤。的药膏L.沙枣油对小鼠皮肤没有影响。一般来说，这个毒性研究表明L.沙枣精油是无毒的。

1.介绍

在所有商业使用的精油中，薰衣草(薰衣草)石油似乎是最受欢迎的一种。L.沙枣它是唇形科的一种耐寒芳香植物，有许多漂亮的品种、习性和花色。它广泛分布在地中海地区。虽然有不同的因素影响L.沙枣EO组成，几个植物化学的研究显示，里哪醇，乙酸里哪酯，樟脑，endoborneol，1,8-桉树脑是主要成分〔1，2]。薰衣草EO具有许多药用价值[3]。最早的治疗用途L.沙枣可以追溯到罗马和希腊时代。4]。在几个实验研究L.沙枣证明它有催眠作用[五),抗痉挛(6]，抗惊厥（山田等.， 1994)，麻醉剂(Ghelardini等，1999)，利尿剂[7，抗抑郁和抗焦虑药[8),血脂异常(9],护心[10，止痛消炎[11、伤口愈合[12),杀虫(13，抗增殖、抗菌和抗氧化剂[14)活动。

该L.沙枣在埃塞俄比亚中北部Ankober地区的传统和民间医药中用于治疗几种牲畜和人类疾病。在包括埃塞俄比亚在内的一些国家，草药的功效声称很多时候都没有充分的临床前和动物毒性数据支持。毒理学研究有助于决定是否采用一种新物质作临床使用[15]。在化妆品工业和外用药物中，必须评估任何制剂/化学品对人体皮肤的潜在刺激性[16]。

为保护公众健康考虑，因为接触化学品可能是危险的和结果对人类的不利影响时，一个物质的毒性评价是至关重要的。在实践中，评价通常包括急性，亚急性，亚急性，慢性，致癌性和生殖效应[17]。虽然L.沙枣埃塞俄比亚人广泛使用它治疗几种疾病，但尚未对其毒性作用进行系统评价。本毒性研究的主要目的是评估L.沙枣小鼠灌胃连续21天。

2.方法

2.1。植物采集与鉴定

新鲜的叶子和花L.沙枣收集自埃塞俄比亚阿姆哈拉州北Shoa区Ankober项目苗圃。这些植物材料由埃塞俄比亚亚的斯亚贝巴大学的国家植物标本室鉴定。

2.2。提取L.沙枣精油

样品在室温下阴干十天空气。干L.沙枣叶和花用水蒸气蒸馏法提取3小时。干叶和头状花序的产量百分比分别为体积比0.45%和0.24%。在毒性研究中，采用了叶中提取的EO。

2.3。分析和化合物鉴定L.沙枣精油

L.沙枣EO分析采用气相色谱/质谱系统(GC-MS)进行。采用Agilent 5977A (Agilent Technologies, Germany)进行GC-MS分析。气相色谱采用内径为0.25 mm、内径为0.25的30 m HP-5毛细管柱μ膜厚度。氦载气的输送速率为1 ml/min。注入器温度保持在250℃，检测器温度保持在250℃。注入体积为1μ分割比例是40:1。温度程序如下:初始温度举行50°C 6分钟,然后增加到76°C 4°C /分钟的速度为5分钟,然后增加190°C的速度4°C / min,然后增加到270°C的速度30°C /分钟和7分钟。相比,选民被确定的与NIST质谱14 &狡猾的gc - ms系统库数据。用归一化法从峰面积计算各化合物的组成百分比。

2.4。香膏配方

10%软膏L.沙枣100g凡士林中加入10g EO，用于皮肤刺激评估。使用Bora等人所述的方法检测了软膏的物理性能，包括粘度、可涂抹性、可挤压性、均匀性和物理外观。[18]和Nair等人。[19]。

2.5。实验动物饲养

使用亚的斯亚贝巴大学药学院10-12周龄的雌雄小鼠(瑞士白化病小鼠)和埃塞俄比亚公共卫生研究所体重1.4-2.3 kg的雌兔(新西兰)。标准笼饲养，室温25±2℃，通风室，明暗循环12小时。在实验之前，动物至少要适应5天的实验室条件，并喂食标准的食物丸和水广告libtum。德勃雷-·伯翰大学伦理委员会批准了这项研究和实验动物的照顾了ILAR以下[20.]指南。

2.6。皮肤刺激试验

根据经济合作与发展组织的指导方针进行皮肤耐受性试验[21]与狭缝的修改。实验前二十四小时，从所有兔子的背部皮毛被夹在不同的位点（图2)。半克10%L.沙枣EO软膏配方均匀和温和地应用于试验点，而未处理的皮肤区域作为对照。在去除试验材料后1小时，以及在24小时、48小时、72小时、第7天和第15天使用Draize评分标准对试验点进行严格检查[21，22]。

2.7。急性毒性研究

在实验开始前，所有动物被剥夺食物8小时。剂量为2000毫克/公斤体重L.沙枣研究人员给一只雌鼠口服行政主任(EO) [23]。两天后，给4只雌性小鼠口服相同剂量的药物，将治疗动物的数量增加到5只。第二组5只雌性小鼠，阴性对照组，给予等量生理盐水。对每只小鼠在头4小时进行严格观察，在头24小时定期观察，14天内每天观察一次。在此期间，对与运动肌肉协调和中枢自主神经系统有关的活动进行了分析。

2.8。21天重复剂量毒性试验

复剂量毒性试验L.沙枣行政主任是根据OECD 407指引进行的[24]。将20只雄鼠和10只雌鼠随机分为雄鼠和雌鼠各5只的两组。剂量为2000毫克/公斤L.沙枣EO和生理盐水，每日一次，21天分别给予治疗组和对照组。体重每笼的所有小鼠和饲料消耗的每周记录，并在21天的实验期间也进行日常观察死亡率，行为变化，和人道终点的可能的症状。

2.8.1。病理组织学检查和生化指标

治疗组和未治疗组均在第22天从颈动脉中采集血样进行生化分析。分离血清，测定血清肌酐、碱性磷酸酶(ALP)、血清谷草乙酸转氨酶(SGOT-A)、血清谷草丙酮转氨酶(SGPT-L)含量。对每只小鼠实施安乐死，对主要内脏进行大体病理检查。所有动物的肾脏和肝脏在测量体重后保存在10%的福尔马林进行组织病理学检查。5例中切除组织μ米的厚度和通过苏木精和伊红染色。组织切片光显微镜下观察，在显微照片×4和40×[取25]。

2.9。统计分析

结果报告为平均值±平均值（SEM）的标准误差。独立样本t检验用于两组间的比较。差异在P <0.05时，认为显著。

3.结果

3.1。化学成分的L.沙枣精油

的产量L.沙枣叶EO为0.45％V /瓦。的四大组件L.沙枣EO是桉油醇（52.362％），樟脑（11.915％），γ-萜品烯（8.775％）和endoborneol（7.585％）（图1)。气相色谱-质谱分析结果显示，油脂中共鉴定出63种成分，占总成分的98.401%(表)1)。

3.2。L.沙枣精油软膏特性

的物理化学特性L.沙枣EO软膏配方见表2。L.沙枣EO软膏质地均匀，光滑，无砂质，呈白色，具有EO特有的气味。L.沙枣EO软膏表现出一些良好的性能，如容易涂抹，容易移动，容易挤压，和可接受的粘度。

3.3。皮肤过敏评估

表格3皮肤耐受性试验结果。用10%的软膏治疗后，兔无刺激症状和皮肤水肿L.沙枣EO。处理后的皮肤完整;与未治疗部位相比，无炎症和红斑(图)2)。每只家兔在摘除试验材料后观察的任何时间的水肿和红斑评分均为“0”。这表明皮肤原发性刺激指数评分为0分。

3.4。急性毒性研究

结果表明，单剂量治疗与L.沙枣EO通过口服途径以2000 mg / kg剂量没有引起死亡的雌性小鼠在研究期间。无治疗相关性毒性症状指出。此外，EO产于皮肤，眼睛，腹泻，流涎，和小鼠的行为模式没有变化。因此，致死剂量（L ）口腔路线L.沙枣估计EO高于2000毫克/公斤。

3.5。重复剂量口服毒性评估

3.5.1。一般观察，体重和食物消耗

2000毫克/ kg，每天口服给药剂量L.沙枣在21天的实验中，小鼠均未出现任何治疗相关的毒性症状、行为改变和死亡。体重测量显示，雌性小鼠(22.5±10.6%)的体重增长受到抑制，而雄性小鼠(87±14.4%)和对照组(见表)4)。然而，差异在统计学上不显著。同样的，雌性小鼠的食物消耗量低于雄性小鼠和未治疗组。然而，这种差异在统计学上并不显著。

3.5.2。Organ-Body重量比

经治疗组和对照组的男女EO尸检均未见异常。治疗组和对照组肝脏和肾脏相对脏器重量的记录差异无统计学意义(表)五)。然而，女性治疗的小鼠的相对器官重量比未处理组略高。相反地​​，雄性处理的小鼠的相对器官重量略低于控制。但是，在血清生化和组织病理学检查，观察相关的肝脏和肾脏毒性的参数没有区别。因此，上述变化考虑没有毒理学显著

3.5.3。肝肾功能指标

生化分析（表6）没有表现出显著差异（P > 0.05结果显示，在口服EO 21天后，对照组和实验组的雌性和雄性小鼠都能得到相同的结果。尽管如此，与未处理组相比，除CREAT-A组外，雌性处理组小鼠的ALPL、SGPT-L和SGOT-A的含量稍高。除ALPL外，处理后的雄性小鼠的所有生化指标均低于对照组。然而，这种差异在统计学上并不显著。

3.6。组织病理学检查

数据3和4显示肾处理和未经处理组的肝组织病理学特征。没有组织病理学变化在处理和未处理组指出两者。结果显示正常门静脉周围，正常的肝细胞形态，无炎症和坏死的证据。相应地，从肾脏的所有部分表现出正常的肾小球和不起眼典型肾小管间质薄壁组织，没有透明变化或血管坏死。

4.讨论

L.沙枣是强的香味特性，这表明有富芳族化合物。该油通常由倍半萜烯的单萜的复杂混合物，biogenetically相关的酚，和（Yazdani的等人，2013年）。在这项研究中获得的EO富含单萜和酚。GC-MS分析表明，桉叶油素，樟脑，γ-萜品烯，endoborneol，和β-蒎烯是主要成分，这表明这些化合物可以以生物活性起主要作用。在与这家工厂以前的植物化学研究表明，在同一主要部件的存在L.沙枣EO，然而，在不同浓度的[1，26]。个EO的化学组合物可表现出由于地理来源，地理条件，气候，季节，植物部分中使用的，植物，提取阶段，和检测方法[变型1，27]。

几篇科学论文报道了大量的治疗用途L.沙枣作为治疗多种疾病的替代药物[28，29]。因此，这家工厂的安全性的调查来指导其应用程序的管理和使用的草药制剂。在合适的动物模型毒性研究常用的方法来评估人类潜在的健康风险[30.]。在本毒性研究中，对雌性小鼠进行急性口服治疗L.沙枣EO在2000毫克/千克对死亡率没有影响，检验临床症状，或整体观察。因此，近似的半数致死剂量口服确定为大于2000毫克/千克更高。根据全球统一分类制度的化学物质和急性全身毒性的混合物中，L.沙枣EO被列为第5类(2000 mg/kg21]。这种毒性评估的结论是在与席尔瓦等人进行的研究的协议。[11报告说LD₅₀值为3.55 g / kg。

对皮肤致敏潜力的了解是危险和风险评估的明确需要。适当的单个化学品的皮肤致敏数据是必要的，特别是当打算与皮肤接触时[31]。皮肤刺激试验L.沙枣EO配方是一种重要的毒性筛选，它提供了皮肤潜在危险的基本特征。准备的软膏评估其皮肤刺激效果，没有红斑或水肿观察PII等于0表明准备的草药配方外用是安全的。这一发现与Opdyke所做的研究一致，[32他们报告说，未稀释的薰衣草油涂在无毛老鼠或猪的背部没有刺激性，但在完整或磨损的兔子皮肤上，在咬合24小时后有轻微刺激性。

虽然急性毒性有助于确定物质的毒性性质，但亚急性口服毒性概况的评估很重要，因为它有助于评估反复给药后器官的形态和生理变化[33，34]。在口服毒性评估中，体重变化是敏感的和毒性标志的指示性标志[35]。给药21天后，与未给药组相比，给药组小鼠体重无明显变化L.沙枣EO。然而，体重增加和食物摄入量略有迟缓被发现在雌性小鼠，但没有效果是很明显的从病理组织学和临床化学。作为最佳补品的摄入是对动物的生理福利重要，但同样重要的毒理学研究中确定的水和食物摄入[34，36]。在这个毒性研究中，水和食物的摄入量不受影响的管理L.沙枣EO表示在碳水化合物，蛋白质的代谢不中断，和脂肪[34]。器官重量的变化是被测物质造成损害的明确指示[25]。无毛的异常是在机关尸检发现并没有产生器官肿胀，萎缩或肥大。

生化分析结果表明L.沙枣EO不产生毒性作用。血清生化物ALP、SGPT、SGOT等仍是评价肝损伤的金标准，数十年来一直是首选的生物标志物[37，38]。血清的生化参数的检查显示与对照相比，EO治疗组没有显著变化（表6)，表示对肝脏没有任何有害影响。通常通过测定血液中的尿素和肌酐水平来评估肾功能[39]。在肾毒性中，这两个参数通常明显高于正常值。在本毒性研究中，治疗组和未治疗组肌酐水平无显著差异(p>0.05)L.沙枣EO对肾脏没有毒性作用。这些发现通过对图中所示器官的组织学研究得到了进一步的证实3和4。组织学检查是评价器官和组织治疗相关病变的黄金标准。肾组织病理学检查显示肾小管和肾小球正常，提示治疗组和未治疗组肾功能正常。治疗组和未治疗组肝脏组织病理学检查显示肝细胞、中央静脉、门静脉三联形态正常，肝功能正常。从宏观和微观上评估治疗动物器官的病理改变，是安全评估的基础[40]。其中被证明是与生化分析一致的这种毒性研究的任何组织病理学改变的情况下确认了使用的安全性L.沙枣连续给药21天。

5.结论

目前的结果表明，无急性和亚急性毒性L.沙枣EO为2000毫克/公斤。兔的皮肤耐受性评估L.沙枣EO软膏是不是有刺激性。在亚急性毒性研究中，在所有测量参数无毒性显著的变化。总之，据我们所知，这毒性研究可以代表演示缺席21天的重复剂量毒性研究首次L.沙枣小鼠体内的EO为2000 mg/kg。

数据可用性

在当前研究中产生和/或分析的数据集可在合理要求下从通讯作者处获得。

的利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在任何利益冲突。

致谢

报告作者感谢Debre Berhan大学的资助、Ankober村社区和亚的斯亚贝巴大学卫生科学学院的实验室技术人员。这组作者还想感谢埃塞俄比亚科技部为实地工作和实验室提供了部分资助。这项研究是由埃塞俄比亚Debre Berhan大学的Ankober草药制剂和植物生物多样性保护项目资助的。

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