氟与链脲佐菌素诱导的糖尿病暴露加重小鼠睾丸损伤和精子参数

抽象的

糖尿病是世界上最常见的慢性疾病，会引起许多并发症，包括男性不育。糖尿病患病率为4.51亿人，预计到2045年将增加到6.93亿人。由于饮用水受到无机氟化物的污染而引起的氟中毒是世界许多地区的公共卫生问题。先前的研究表明，氟暴露会损害男性的生殖功能。本研究旨在评价氟亚慢性暴露对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠精子功能的影响。通过测量血糖水平确认糖尿病后，雄性小鼠接受了45.2 ppm的添加氟化物或去离子水。我们评估了暴露于氟的糖尿病小鼠的几个参数:标准质量分析，线粒体跨膜电位(ψm），在精子，尿氟化物排泄和睾丸中的组织学评价中的胱天蛋白酶活性。氟化物暴露60天后，糖尿病小鼠显着降低了精子质量（运动，活力和浓度）。来自糖尿病小鼠的氟化物暴露的精子呈现出显着的减少ψM和caspase 3/7活性显著增加。暴露于氟的糖尿病小鼠尿氟排泄减少。stz诱导的糖尿病小鼠亚慢性氟暴露加重了睾丸损伤和精子功能。

1.介绍

氟化物是一种丰富的环境污染物，广泛存在于岩石、土壤、水、食物等中[1］．虽然水中的氟化物浓度取决于每个地理位置，但人体中的主要氟化物源是含有牙科产品和氟化水的氟化物。全球研究揭示了非洲，美国，阿根廷，保加利亚，中国，埃塞俄比亚，伊朗，韩国和墨西哥的各个地区具有高氟浓度，导致饮用水的严重污染[2］．最近，美国PHS推荐表示，饮用水中氟化物的最佳浓度应在0.7-1.2ppm的范围内[3.］．氟中毒，由体内氟化物沉积引起的疾病影响骨骼组织和牙齿[4]但也是软组织，如肝脏[5]，肾脏[6]， 大脑 [7，8和睾丸组织[9］．在精子发生过程中产生的精子是高度专业化的细胞，其在运输和将男性遗传信息中运作到后代，精子的完整性，是生殖成功的梯度，包括卵母细胞和胚胎发育的施肥[10］．几项调查表明，在睾丸中，氟化物暴露对不同水平产生负面的繁殖对不同水平影响，导致该器官的几种改变影响组织结构，细胞凋亡，细胞周期和Leydig细胞的结构，改变精子发生过程[9，11- - - - - -15］．此外，若干研究表明，氟化物对精子作用产生负面影响;包括形态学，运动，成熟，副反应，高素质反应，高血压和趋化性;因此，减少生育率[14，16- - - - - -22.］．

2017年，全球成人糖尿病(DM)患病率达到4.51亿人，预计到2045年将增加到6.93亿人[23.］．糖尿病是一种众所周知的慢性代谢性疾病，其特征是由于胰岛素分泌或作用的改变而导致的长期高血糖。不受控制的糖尿病会导致并发症，如伴有酮症酸中毒的高血糖症或高渗性非酮症综合征[24.］．糖尿病是世界范围内影响患者生活质量的最常见疾病，其长期并发症包括视网膜病变、肾病和自主神经病变，以及对男性生殖功能的有害影响[24.- - - - - -26.］．通过损害睾丸内分泌和外泌发功能或破坏分泌功能精子发生，甾体制，精子成熟，阴茎勃起的损伤和射精的损伤以及射精的损伤是DM的一些主要并发症26.- - - - - -28.］．本研究旨在评估氟化物次级暴露对精脲佐菌素（STZ）诱导的小鼠糖尿病患者精子功能的影响。

2。材料和方法

2.1。动物和实验设计

雄性CD1小鼠是从Hidalgo自主大学（墨西哥Hidalgo）的健康科学研究所获得。根据制度伦理动物护理和使用委员会（CIECUAL）的规范保持这些动物，在标准条件下，12小时/ 12小时光/暗循环，恒温（22±2°C）和湿度（50％）.食品（LabDiet®5013）和水在其家庭笼子里自由提供。Hidalgo自治大学批准的实验程序。

将24只动物随机分为4组:对照组(I组)、stz诱导糖尿病组(II组)、氟暴露组(III组)和氟暴露组(IV组)。将45日龄小鼠腹腔注射溶解于柠檬酸缓冲液(pH 4.5)中的STZ 150 mg/kg，制成糖尿病小鼠。注射7天后测定尾静脉血糖，血糖浓度≥250 mg/dl的动物纳入本研究。在第60天，stz处理小鼠的平均血糖为460 mg/dl。一旦证实这些动物患有糖尿病，就开始与氟化物共同接触。对照组小鼠给予去离子水，III和IV组小鼠在60天内给予45.2 ppm的含氟水。这些动物被饲养了60天，以确保小鼠有超过一个生精周期(大约40天)[29.］．

2.2。精子质量

治疗60 d后，小鼠颈椎脱位安乐死，切除精巢-附睾-输精管复合体，37℃下用1 ml磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.4)冲洗输精管和附睾尾管腔，分离精子。精子参数，包括活力，活力和浓度，根据之前描述的方法，在光学显微镜下×400放大[30.］．20微升的精子悬液被转移到一个干净的载玻片上。精子活力的评估是通过计数活动和不活动的细胞在五个独立的和随机的领域每个幻灯片重复。用PBS稀释精子悬液(1:20)测定精子计数。10微升被转移到纽鲍尔腔室(HBG，汉堡，德国)。用光镜(Olympus Corp. Center Valley, PA USA)人工计数精子一式两份，数据以百万/毫升表示。用等量(0.4%)锥虫蓝混合精子悬液来评估精子活力。在光学显微镜下计数未染色和死亡精子(Olympus Corp. Center Valley, PA USA)。每只小鼠样本有100个重复计数的细胞。

2.3。精子线粒体膜电位

线粒体膜电位(ψ用荧光团JC-1染料测量m）。JC-1形成单体在线粒体中发出绿色荧光，具有低膜电位。为线粒体膜电位染色制备DMSO中JC-1（分子探针）的3mm储备溶液。每个精子样品在PBS中（5×10⁶/ ml）用2.5染色 L of JC1股票解决方案[31.］．使用流式细胞仪(FACSCalibur系统，Becton Dickinson;新泽西富兰克林湖)。

2.4。胱天蛋白酶3/7酶活性的检测

通过细胞事件caspase 3/7绿色检测试剂进行活性胱天蛋白酶3和7的检测，其是与核酸结合染料缀合的四氨基酸肽（Devd）。在凋亡细胞中激活Caspase-3/7后，DeVD肽被切割，使染料能够结合DNA并产生明亮的荧光反应。对于每个精子样品，PBS中的1ml精子悬浮液（10×10⁶在37℃下，在37℃下用Caspase 3/7试剂（2 m）和sytox（1 m）[32.］．使用流式细胞仪（Facscalibur System Becton Dickinson; Franklin Lakes，NJ）对10,000个细胞测量荧光强度。

2.5。氟尿液浓度

在氟化物的暴露期间，在0,30和60天的研究中以非燃点收集尿3倍。对于尿液收集，将动物留在代谢笼中，并在24小时内收集尿液以通过使用离子选择电极（ORION 9609）通过电位法定量氟化物浓度。对于其分析，尿液与TISAB II（1：1）混合。电极在0.01-10ppm的标准范围内校准[33.］．所有阅读都重复了。

2．6．组织学分析

记录睾丸的重量以使用以下公式计算促性腺指数：[Gonada重量×体重^-1]×100.对照测试样品和糖尿病氟化物暴露小鼠用磷酸盐缓冲盐水（pH7.4）的10％固定在福尔马林中，并用常规的石蜡包埋的方法加工。之后，将铅化组织块分成5个 M并用苏木精和曙红（H＆E）染色。从更具圆形的管状横截面获得半成小管的计数和直径。每只动物评估四个横截面组织学。测量是用安装在光学显微镜（Olympus Corp.，Centre Valley，Pa，USA）的高清摄像机进行的测量，以10×镜头，配备V.3.7。Amscope软件（Myford Road，Irvine，CA，USA）。

此外，Johnsen的标准通过分析每只动物的二十五个半血管小管进行了评估的精子发生。在该评估中，分配得分以定量描述精子生成过程。考虑到嗜聚小管的渐进性变性呈现成熟精子的损失，并持续直到精子的丧失，然后达到血清细胞。根据这些标准，得分为9或10表示正常的睾丸组织学，得分为8表示Hypo-精子发生。得分为3-7代表成熟滞留，评分为2表示血清细胞的Allasia，并评分为1表示管状纤维化。用相位对比显微镜检查样品，在40×倍率下检查[34.］．

2.7。数据分析

采用Sigma Stat Statistics Analysis System version 4.0程序对数据进行统计分析。单向方差分析，然后Bonferroni校正来评估两两差异。一个 -值<0.05被认为是显着的。

结果

3.1。在STZ诱导的糖尿病条件下氟化物暴露会加剧精子质量的恶化

通常，在60天时，与对照和氟化物暴露的基团相比，氟化物加STZ组中的平均体重明显下降1.40倍和1.16倍。此外，与STZ组相比，体重没有显着差异（表1）.接下来，我们根据表中总结的几个参数对精子的整体质量进行分析1．与对照组相比，氟加STZ组精子活力明显降低(3.8倍)。同样，与STZ组和氟暴露组相比，他们的运动性下降(2.39倍和2.47倍)。与对照组相比，氟加STZ组的精子浓度也显著降低(2.6倍)，与STZ组和氟暴露组相比，精子浓度显著降低(2.55倍和2.9倍)。如图所示，与对照组和STZ组相比，氟加STZ组的精子活力显著下降(2.6倍)，与STZ组和氟暴露组相比分别下降(1.77倍和1.46倍)。与氟暴露组相比，氟加STZ组的性腺指数显著降低(1.57倍)，与氟暴露组相比(1.26倍)。此外，我们用Johnsen睾丸评分进行组织学评估。如表所示1，对照睾丸具有典型的睾丸结构和规则的精管形态，包括最外层的支持细胞和精原细胞，中层的精原细胞和最内层的精子，表明精子发生正常。然而,在糖尿病小鼠的睾丸接触氟化物,我们观察到的大小和数目减少细精管,不规则的小管和spermatogonia和精母细胞的数量较低,导致在约翰森的睾丸得分显著减少,暴露在这些条件下睾丸损伤的程度。

3．2．stz诱导的糖尿病条件下氟暴露导致Δ的降低更高Ψm伴随着半胱天盒激活的增加

线粒体膜电位（δΨm）评价是精子质量的指标。我们使用荧光团JC-1评估了线粒体活性。结果表明，STZ加氟化物组显着降低了δΨ与对照相比，精子（1.65倍）的m。此外，与STZ组相比，线粒体活性降低（1.29倍），与氟化物组相比（1.34倍）（1.34倍）（图1）.我们使用细胞事件caspase-3/7 Green检测试剂评估细胞凋亡。结果显示，与对照组相比，STZ +氟组caspases 3/7的活化显著增加(2.23倍)，与STZ组相比增加(1.62倍)，与氟组相比同样增加(1.54倍)(图)2）.

3.3。在STZ诱导的糖尿病条件下氟化物暴露导致尿氟化物排泄减少

数字3.结果显示氟+ STZ组和对照组小鼠60 d尿氟浓度。突然间，与氟组相比，stz诱导的糖尿病小鼠在30天和60天尿氟浓度显著降低(4.68倍和2.37倍)。

4.讨论

本研究旨在评估氟化物次级暴露对STZ诱导糖尿病小鼠氟化物暴露引起的精子引起的损伤的影响。有几项研究表明，氟化物暴露对男性繁殖，改变精子质量，癫痫成熟，产能，副反应，对DNA完整性的损害以及施肥进行负面影响[9，16- - - - - -21.，35.］．有趣的是，通过人群中饮用水的氟化物消耗与糖尿病发病率的增加有关[36.］．此外，已经显示反复暴露于氟化物，以增加具有STZ诱导的糖尿病的动物中的血清葡萄糖[37.];这可能是由于胰腺细胞胰岛素分泌减少引起的[38.］．

另一方面，诱导的糖尿病和糖尿病疾病都表现出对精子质量和精子DNA完整性的不利影响[26.，27.，39.- - - - - -41.]。由于以上，研究氟化物暴露在糖尿病条件下的生殖效果是有趣的。早期的研究记录了STZ诱导的糖尿病动物在高浓度下暴露于氟化物（270ppm的F），加剧了睾丸造成的损害[42.］．在本研究中，我们根据雄性小鼠54.4 mg氟离子/kg体重的LD50值，在饮用水中使用100 mg/L氟化物，相当于45.2 mg氟离子/L，持续60天)[43.］．

在同一研究中，与糖尿病组和氟化物组相比，糖尿病条件下亚慢性氟化物暴露加重了精子质量(活力、活力和浓度)。精子活力依赖于氧化磷酸化产生的ATP水解所获得的能量[44.］．以前的研究表明，暴露于氟化物显着降低了精子中的ATP水平[16，17，这是由于电子传递链复合物III和IV发生了改变，并伴随着线粒体超微结构的病理改变[45.，46.]除了精子毒素线粒体DNA拷贝数的改变还[44.］．哺乳动物的精子线粒体在ATP产生、钙稳态渗透调节、活性氧(ROS)产生、细胞凋亡等方面起着至关重要的作用[47.］．我们也评估了精子ΔΨM广泛使用表征线粒体功能状态，也被认为是潜在的调节因子和精子毒性的指标，因此与男性生育有关[31.，48.］．我们的结果显示Δ的下降幅度更大ΨM在糖尿病条件下暴露于氟化物的精子。几项研究表明，氟化物暴露增加了超氧化物阴离子和其他ROS的产生[16，49.- - - - - -51.]众所周知，它显着降低了睾丸和精子中的超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（猫）等抗氧化酶的活性[16，52.]，并降低附睾中SOD和CAT的活性和mRNA [53.］．氧化应激是男性不孕症中氟中毒的可接受机制。

凋亡是一种受调控的细胞死亡程序，是通过外部途径(涉及细胞表面死亡受体的激活)或内在途径(涉及线粒体外膜通透)或内质网应激引起的凋亡信号通路触发的[54.，55.］．细胞凋亡在精子发生和精子成熟中起重要作用[56.];然而，线粒体通路引起的异常凋亡、睾丸的改变也会对精子发生和精子数量产生负面影响[57.］．凋亡标记可用于评估精子施肥的能力[58.］．在该研究的细胞凋亡中，在糖尿病条件下，在亚温氟化物暴露中观察到精子杂种中的半胱天冬酶3/7激活的较大显着增加。以前，已经证明了细胞色素C和活性Caspase-3的蛋白质表达的显着增加，该小鼠的小鼠暴露于氟化物的小鼠中解释细胞凋亡的高比例。证据表明，在妊娠前，妊娠期，出生和后青春期前的氟化物暴露导致睾丸内质网胁迫和炎症反应，以及由线粒体途径介导的氧化应激和胚细胞凋亡，并在睾丸中的逆转[52.，59.］．在这项研究中，我们观察到在糖尿病条件下亚温氟化物中睾丸组织学的显着改变。以前的研究表明，氟化物暴露会导致与氧化应激和细胞凋亡有关的功能和睾丸结构损伤[19，59.，60.］．

同样地，通过微阵列分析和实时RT-PCR，63个下调基因对雄性繁殖暴露于荧光引起的几种改变，这些过程参与了包括信号转导，氧化应激，细胞凋亡的几种精子生物学方法，电子传输链，糖酵解，趋化性，精子发生和精子加固[45.］．近年来，一些涉及蛋白酶抑制剂活性、凋亡、泛素介导的蛋白质水解以及钙、JAK-STAT、MAPK、p53、Wnt信号通路的miRNAs的变化已被证实;已被证明与氟暴露引起的生殖毒性中精子质量直接相关[61.］．

此外，氟化物导致管状细胞的变性和坏死，肾小管透明浇注，以及肾小球肿胀，伴随着肾氧化损伤引起的肾功能的改变[62.］．此外，患有氟牙症的儿童的肾功能也发生了改变[63.］．在本研究中，糖尿病小鼠暴露氟后30天尿氟化物的排泄减少。由于氟化物通过肾脏排出，肾功能不全将损害氟化物的清除，这表明这些情况，慢性氟暴露的不良影响可能会加重。早期的研究表明，stz诱导的糖尿病动物接触氟化物会加重对肾脏的损害[37.］．

另一方面，DM是一种影响由于各种内在并发症导致的生命时间和生活质量的疾病。DM可以以多种方式影响精子生成过程[28.]，涉及丘脑垂体 - 垂体轴轴的损害，睾酮水平降低[64.- - - - - -66.]交配率，生育和窝量的不良结果[66.，67.］．氧化应激在DM通过高血糖产生，降低抗氧化防御和启动细胞凋亡的雄性繁殖引起的男性繁殖的发病机制中发挥着至关重要的作用。68.］．有趣的是，睾酮水平可以保护内皮细胞免受caspase-3和Bax/Bcl-2介导的晚期糖基化终末产物(AGEs)诱导的凋亡[69.］．以前，它表明DM导致质量精子（运动，活力，计数，形态）和DNA碎片增加的增加，并且线粒体功能受损[28.，39.，40，70，71.］．最近，糖尿病人体精液的蛋白质组学分析表明，在ATP合酶，细胞色素C氧化酶和NADH脱氢酶的水平下，患有线粒体代谢改变的几种蛋白质增加了几种蛋白质，证实了线粒体功能受损的[72.］．有趣的是，STZ诱导的糖尿病雄性小鼠改变了两代后代后代睾丸的精子质量和表达模式[71.］．

最近有研究表明，同时接触氟化物和二氧化硫会加重大脑和肾脏毒性[73.，74.］．在本研究中，类似的精子质量改变，线粒体功能受损，凋亡增加已经在氟和糖尿病暴露在生殖水平上证实;然而，它们的结合加重了精子的功能。

5.结论

本研究结果提示，糖尿病小鼠氟暴露加重了精子功能，线粒体膜电位降低，细胞凋亡增加，睾丸细胞组织学变化恶化。此外，男性质量参数的降低可能反映了氟和DM共同暴露对精子发生的损害。需要进一步研究，以确定氟在糖尿病条件下联合作用产生巨大毒性作用的机制。

数据可用性

支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者希望感谢Alvaro Rubén Hernández Cruz对组织学技术的支持。这项研究得到了profoccie 2018的部分支持。

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