维生素E对出生前和出生后代森锰锌暴露导致的第一代小鼠幼鼠睾丸损伤和精子参数的预防作用

摘要

本研究旨在探讨维生素E对代谢物诱导的第一代幼犬宫内和哺乳期睾丸损伤的影响．两组怀孕的NMRI小鼠在服用MNZ前分别服用500mg/kg代森锰锌（MNZ）作为MNZ组和200mg/kg维生素E作为MNZ+vit.E组。此外，在妊娠期和哺乳期每隔一天设计一个载体和一个对照组。每组雄性幼崽一直维持到成年（8-10周）。处死幼崽后，切除左侧睾丸和附睾。然后，对他们进行称重，并评估精子参数，包括数量、活力、活力、形态和睾丸结构。与对照组和载体组相比，代森锰锌处理的幼崽精子参数显著降低。维生素E治疗将MNZ的有害影响逆转至接近正常的状态。与对照组和载体组相比，MNZ组的睾丸参数（包括体重、性腺体指数、生精小管直径和Johnsen评分）以及生殖细胞（如精原细胞、精母细胞、精子细胞和支持细胞）数量显著减少。有趣的是，维生素E治疗在大多数这些参数中都是相反的。根据研究结果，在怀孕和哺乳期，幼崽接触代森锰锌会对雄性幼崽的生殖系统产生负面影响。然而，联合服用维生素E可以防止代森锰锌对精子和睾丸参数的有害影响。

1.介绍

代森锰锌，作为美国环保署(环境保护署)批准的农药[1]对哺乳动物的毒性最小[2]，越来越多地在世界各地使用[3.，4］.代森锰锌的生产可能会持续到2020年，至少由于低价格和全球需求。然而，一些研究人员认为，自从代森锰锌在1948年首次出现以来，受代森锰锌污染的农产品和水的不良影响一直在增加[1].在这方面，神经毒性作用和帕金森样症状[5，胎儿脑发育失调[6，甲状腺激素紊乱的情况尤为突出，尤其是在女性中[7］.此外，代森苯乙酮对成年男性生殖系统的抗精子和抗雄激素作用已经有报道[4].成年雄性小鼠和家兔服用高剂量代森锰锌后，精子发生中断[8，9］.然而，关于代森锰锌对某些发育器官(如生殖系统)的影响，数据中存在一些空白和尚未解决的问题[10]这是在一篇评论文章中提出的[1］.

一些报告发现代森锰锌给药和氧化应激之间的相关性，以及代森锰锌诱导的下丘脑-垂体-性腺轴破坏的一些证据[4，11］.活性氧(ROS)的过量产生被认为是男性生育能力的一个危险因素[12，13］.维生素是著名的强抗氧化剂。在目前的研究中，维生素E (α生育酚)作为脂溶性抗氧化剂[14]，对生育潜力有很大影响[15，16]，以评估其对代森锰锌诱导的雄性生殖系统发育损伤的影响。此外，还评估了胚胎和新生小鼠长期暴露于代森锰锌的影响以及维生素E对第一代幼鼠（f1）精子参数紊乱和睾丸损伤的预防作用。

2.材料和方法

2．1．化学物质

材料购自Sigma公司(MO, St. Louis, USA)。此外，Mancozeb(锰锌乙烯双(二硫代氨基甲酸酯))的纯度为80%，可湿性粉剂(CAS: 8018-01-7)从印度Indofil化学公司获得。

2．2.动物

NMRI小鼠购自伊朗巴斯德研究所，饲养于标准条件的动物舍，如温度22±1°C, 12:12光/暗周期(早上6点，亮灯)。此外，这些老鼠以标准的硬颗粒(伊朗巴斯德研究所)饮食喂养，并可以免费获得自来水。此外，它们被安置在小鼠笼子的玉米芯床上。该研究方案得到了科曼医学大学动物伦理委员会的批准(道德准则:ir.kmu.rec.2014.137)。

2.3.实验设计

本研究共选用18只8-10周龄的成年雌性小鼠和6只10-12周龄的成年雄性小鼠进行交配。将3只雌鼠和1只雄鼠关笼过夜，隔天早晨检查阴道堵塞的形成情况。阴道塞观察后第一天视为妊娠第一天。怀孕的小鼠随机分为4组(每组4只)，包括对照组(第一组)、对照组(第二组)和代森锰锌治疗组(第三和第四组)。第一组不进行任何处理，第二组给予0.1 ml/10克体重(BW)的橄榄油。此外，第三组(MNZ)给予溶在橄榄油中的代森锰锌500 mg/kg BW (1/10 LD50) [17第四组(vite +MNZ)给予维生素E(纯度≥95.5%，Sigma Aldrich, CAS: 10191-41-0，半合成醋酸酯α-生育酚)200毫克/公斤，溶于橄榄油和代森锰锌。后一组动物在代森锰锌服用前30分钟服用维生素E。这个间隔时间的选择是基于两个事实:(1)通过小肠吸收维生素E的时间;(2)灌胃后血浆中达到适当浓度的时间[18］.除对照组外，根据研究设计每两天灌胃一次，分别给予橄榄油、代谢锌、维生素E等不同处理。治疗从怀孕第二天开始，一直持续到哺乳期结束，这样胚胎和后代就可以通过胎盘接触到代代锌和维生素E [19]及血乳屏障[20.，21］.共有116只幼犬由16只母犬产下(n=4);男性59例，分别为对照18例、对照17例、对照11例、对照13例、对照MNZ例和对照e +MNZ例。断奶后，第一代幼鼠(从每组随机挑选10只)保持标准饮食直到成年(8-10周)。对成年公仔进行称重，颈脱位处死。最后，切除睾丸和附睾并称重，据此评估精子和睾丸参数。

２.４.精子参数评估

根据世卫组织指南(2010年第5版)评估精子参数，包括数量、活力、活力和形态。将左附睾尾放入1 ml含BSA (15 mg/ ml)的预温火腿F10培养基中，用手术剪刀剪开，37℃CO孵育20-25分钟₂5%用于评估精子参数。

2.5.精子数

将等体积的精子悬浮液与10%甲醛混合。然后，10μl的稀释溶液置于改良的纽鲍尔血细胞计上，用光学显微镜(Olympus bx51，东京，日本)×400放大观察。

2.6。精子生存能力

用曙红-黑色素染色法检测精子活力μL精子悬液与10μl伊红-黑胶苷染色，2分钟后在干净的玻片上涂片。至少200个精子被用光学显微镜(Olympus BX51，东京，日本)在×400放大率下进行了评估。最后，死精子和活精子分别为暗红色和淡粉色。

2.7。精子的运动性

首先,10μL的精子悬液放在一个干净的玻片上，盖上22×22 mm的玻片。用光学显微镜(Olympus BX51，东京，日本)×400放大观察精子，在5个区域评估至少200个精子的活力，并记录为活动精子的百分比。最后，将精子运动分为进行性运动、非进行性运动和非运动性。

2.8。精子形态评价

用光学显微镜(Olympus BX51，东京，日本)×200放大，对伊红-黑素染色玻片进行精子形态分析。每个切片至少评估了200个精子，并记录了头部、颈部和尾部任何类型异常的百分比。

2.9。性腺指数(GSI)的测定

在颈椎脱位前，各组动物用数字天平称重。此外，术后测定睾丸重量。计算睾丸与体重的比率，并记录为GSI的百分比[22］.

2.10。睾丸结构评估

样本包括4组28个睾丸(每组10个)。将组织用10%甲醛固定，用70-90-100%乙醇分级脱水，石蜡包埋μm切片用旋转切片机(Leitz，德国)制备。切片用苏木精和伊红(H&E)染色，在光学显微镜(Olympus BX51，东京，日本)下进行研究。Johnsen评分(精子发生)用于报告精上皮质量的变化[23，24]按照10分制，如下所示：完整的精子发生和正常组织的小管（10），许多精子但生发上皮组织紊乱（9），切片中只有少数精子（8），没有精子但有许多精子细胞（7），只有少数精子细胞（6），没有精子或精子细胞，但有许多精母细胞（5），只有少数精母细胞（4），只有精原细胞（3），没有生殖细胞，只有支持细胞（2），没有生发细胞和支持细胞（1）。

2.11。输精管参数的定量和定性评价

首先，每组7只小鼠每睾丸随机抽取20个输精管，测量输精管管腔直径、生发上皮厚度、生发上皮细胞(精原细胞、精母细胞和精子)数量、支持细胞数量等参数[25］.最后，对产精小管的定性参数，如生精细胞的退行性改变、小管的组织紊乱、上皮脱落和细胞脱落进行了评价。

2.12。统计分析

首先，利用Kolmogorov-Smirnov检验确定变量的正态分布。然后，当变量的分布是正态分布时，使用ANOVA检验和Tukey检验。否则采用Kruskal-Wallis检验。结果以均数±均数标准误差(SEM)报告。p <0.05时，差异有统计学意义。

3.结果

妊娠期服用代森锰锌对孕妇临床症状、死亡率、流产等无明显影响。

3．1.附睾精子数量和活力的评价

与对照组和对照剂组相比，代森锰锌处理小鼠附睾精子数量和活力显著下降(图)1(一)和1 (b))．与代森锰锌组相比，补充维生素E显著增加了精子数量(p<0.001)。精子活力在MNZ和vit之间具有可比性。E+MNZ组的精子存活率明显低于对照组和对照组。

3．2.精子形态评价

如图所示1（c），与其他组相比，代森锰锌给药导致精子异常形态急剧增加(p<0.001)。如图所示2，精子形态的异常形态，如针头、中部环状、弯颈、盘尾、无头、无尾(图2)， MNZ组多于其他组。有趣的是，与MNZ组(p<0.001)和对照剂组(p<0.01)相比，补充维生素E显著改善了精子形态。

3．3.精子活力的评估

数字3.说明了不同组的精子活力和进展。与MNZ组相比，MNZ组的精子活动率最低，显著低于其他组（p<0.001），而服用维生素E组的精子活动率显著增加（p<0.001）与MNZ组（p<0.001）、溶媒组（p<0.01）和对照组（p<0.05）相比，维生素E加代森锰锌组的进行性精子活动率最高（图3 (b)，3 (c),3 (d))．

3．4．体重、睾丸体重和性腺指数(GSI)的评估

数字4显示f1代后代的体重、睾丸重量和GSI比率。如图所示，在统计上，不同组的体重保持不变，而在vit显著增加。E+MNZ组与对照组和MNZ组比较(图4(一))．此外，与对照组和对照组相比，MNZ组睾丸重量显著降低(p<0.001)，而vit组睾丸重量显著增加(p<0.001)。E+MNZ组，与MNZ组比较(图4 (b))此外，与对照组和溶媒组相比，MNZ组的GSI显著降低（p<0.001），而与MNZ组相比，维生素E+MNZ组的GSI显著升高（p<0.05）（图4 (c))．

3.5.睾丸结构的评估

如图所示5，对照组、载体组和MNZ组之间的生精小管直径无显著差异，而与对照组和载体组相比，vit.E+MNZ幼仔的生精小管直径显著增加（p<0.05）（图5(一个))此外，与对照组和赋形剂组相比，代森锰锌治疗显著增加了生精管腔的直径（p<0.01），而补充维生素E显著降低了生精管腔的直径（p<0.01）与MNZ组相比，维生素E+MNZ组的直径仍显著高于对照组（图5 (b))此外，与对照组和溶媒组相比，MNZ组的生发上皮直径显著减小。然而，维生素E+MNZ组的生发上皮直径显著高于对照组（p<0.01）、溶媒组（p<0.01）和MNZ组（p<0.05）（图5 (c))．

3.6.生精细胞系的评价

数字6分别显示各组Johnsen评分和生精细胞系的变化。与对照组和对照组相比，MNZ组显著降低(p<0.01)。尽管与MNZ组相比，服用维生素E显著提高了Johnsen评分(p<0.01)，但与对照组和对照剂组相比，未能达到显著水平(p<0.01)6(一))．

载体组生精细胞系(精原细胞、精母细胞和精子细胞)的平均数量与对照组近似(p>0.05)。此外，与对照组和载体组相比，MNZ组生精细胞系和支持细胞数量显著减少(p<0.01)。然而，与MNZ组相比，给予维生素E显著增加了生精细胞系的数量(p<0.01)6 (b))．此外，vit中的精母细胞和精子细胞数量显著增加。E+MNZ组与对照组比较，差异有统计学意义(p<0.01)6 (b))．与mnz处理小鼠相比，维生素E预处理小鼠支持细胞数量增加(p<0.01)，但显著低于对照组(p<0.01)和对照(p<0.05)组(图3)6 (c))．

3.7. 睾丸组织病理学的定性评价

如图所示7对照组和载体组组织良好的生精小管结构定性观察到正常大小和外观。这些小管在不同的分化阶段被规则排列的生精细胞覆盖，其管腔被成熟精子占据。相比之下，MZN组的大多数生精小管出现变性改变。这些组织病理学改变的特点是生精小管萎缩、紊乱，外观不规则，精子发生不完全。生精小管缺乏精子细胞和分离的精子（表现为精母细胞群从生精上皮分离）。此外，生精小管的管腔直径增加。与代森锰锌治疗组相比，维生素E+MNZ组的生精小管显示组织良好的生精上皮，大小和外观正常，并且管腔中成熟精子的生精活跃。

4.讨论

代森锰锌等农药的使用就像一把双刃剑。农药的使用似乎是对抗植物害虫必不可少的，但它可以产生一些不良的副作用，特别是对人类。也就是说，既不能放弃，也不能忽视它们的使用风险。确定代森锰锌使用的副作用，寻找一种预防、修复和补救代森锰锌对发育器官的损伤的方法，可以视为该领域应用研究的目标。因此，本研究旨在探讨代代锌对第一代幼犬在妊娠期和哺乳期给予代代锌后睾丸结构的影响，以及给予维生素E可能的保护作用。

根据研究结果，由于代森锰锌中毒，第一代幼崽的睾丸结构受到相当大的损害。这种损害是由代森锰锌致死剂量（500mg/kg）的十分之一对动物造成的[3.]，这可能超过了自然界中作物和饮用水的实际代森锰锌污染[26］.因此，根据目前和以前的研究结果，低剂量代森锰锌在农产品和饮用水中的污染应该不会有很大的危害。因此，代森锰锌的有害影响是剂量依赖性的。换句话说，代锰锌影响的严重程度取决于消费剂量、慢性或急性使用、暴露时间(例如，在子宫、儿童期和成年期的性发育期间)以及动物模型和生命阶段的易感性[27- - - - - -29]因此，应考虑低剂量代森锰锌的危害性，因为发育期和婴儿期是生命中最敏感的阶段。

几乎所有的睾丸测量被代森锰锌的负面影响被coexposure减少维生素e .值得注意的是,第一代动物的代森锰锌暴露在怀孕和哺乳期间导致创建一些戏剧性的变化在精子参数和睾丸精子减少等结构参数包括数量、活力、活力和形态，睾丸参数包括重量、GSI、生发上皮厚度和Johnsen评分的降低[24，以及生殖细胞的耗竭。有趣的是，服用维生素E大大扭转了这些损伤。虽然目前的研究被认为是代森锰锌对第一代男性生殖系统有害影响的首次报道，但在文献中也有一些报道显示代森锰锌对成年男性生殖系统有害影响。例如，Khan(1996)研究了代森锰锌暴露对小鼠精子形态和精子数量的影响。此外，Krishanthe(2014)评估了短期代森锰锌暴露后牛精子的功能和活力，其结果证实了本研究的结果[30.，31].将最近的体外研究结果与目前的体内研究结果进行比较，同时揭示代森锰锌对多种特定细胞（如支持细胞、睾丸间质细胞、生精细胞和颗粒细胞）的毒性作用程度，显示代森锰锌造成的损伤的其他不同方面，包括超微结构和雄性和雌性生殖器官的形态变化、内分泌干扰和代森锰锌剂量依赖性变化[6，28，32，33］.

总的来说，越来越多的证据证实代森锰锌与生殖系统之间存在负联系[1］.此外，在Castro的研究中，代森锰锌的剂量为2-3 g/kg，在Rossi的研究中，代森锰锌的剂量为50-500 mg/kg，考虑代森锰锌穿过大鼠胎盘屏障的能力，报告了代森锰锌的致畸影响[17，34]此外，代森锰锌治疗组第一代幼崽的Johnsen评分和生精细胞显著下降可能导致不育或生育能力显著下降。当这些事件与支持细胞显著下降同步时，预计生育能力会受到更多损害但是，还需要进行进一步的研究，以了解代森锰锌对第一代幼崽生育潜力的深远和长期影响。

代森锰锌的有害影响与激素失衡和活性氧(ROS)水平增加有关[35]，与磷脂双层膜广泛相连[36并破坏细胞膜。此外，产生的氧化应激(OS)可能影响产前发育[37］.此外，精子产生的少量ROS [38]对精子获能和成熟有积极影响，尽管高水平可能威胁生育能力。活性氧的持续产生被内源性抗氧化剂扫过[39］.通过代谢霉素等外源性物质，打破产生和清除ROS之间的平衡，可能导致DNA和细胞膜损伤，从而激活p53，阻止细胞增殖和凋亡[40］.代森锰锌诱导的氧化应激引起的凋亡和坏死变化已经有报道[11，41］.据报道，在服用抗氧化剂后，生殖系统的这种变化会减少。因此，男性生殖系统可能会受到威胁，如果代森锰锌的ROS生成水平超过了精细胞系的氧化防御能力，则代森锰锌可能会产生一些破坏性影响。具有自由基清除能力的抗氧化剂可以减少ROS，帮助上述保护系统，减轻损害的严重程度。维生素E等维生素是强大的抗氧化剂，可抑制细胞膜脂质过氧化反应，保护细胞膜免受自由基的损害[42］.此外，维生素E被用作提高人类生育能力的补充物，是众所周知的抗不育物质[43- - - - - -47］.考虑到维生素E是一种脂溶性维生素，从身体中缓慢去除，它可能会对身体器官产生长期影响。因此，假设维生素E是在代谢唑服用之前服用的，那么它几乎是同时到达血液和组织的。简而言之，维生素E保护细胞免受氧化应激的机制包括维持谷胱甘肽作为细胞内自由基清除剂的自然水平，通过抑制过氧化作用保护细胞膜(免受农药造成的损伤)，清除细胞中的ROS [16，48，并减少细胞凋亡[49，50].据报道，摄入维生素E后精子参数的改善包括精子质量和数量的增加[51]精子存活率[52]，以及维持精子DNA的完整性免受氧化损伤[53］.另一方面，维生素E缺乏会损害睾丸组织，减少睾丸素合成，从而减少精子发生过程，从而对生殖性能产生负面影响[54］.

降低精子参数被认为是确认代森锰锌对睾丸有害影响的另一个原因，维生素E可显著恢复这种损害，并证实代森锰锌对OS的影响。这与Yue et al. 2010所描述的维生素E通过改善细胞膜和线粒体对精子参数的保护作用是一致的。因为维生素E是脂溶性的，可以通过胎盘和血乳屏障[55，56]，它可能在怀孕和哺乳期有效，并在出生前后中和代森锰锌的毒性作用。这些时期是发育睾丸等身体器官的最敏感时期。根据一些报道，睾丸结构及其生殖细胞易受代森锰锌等有害物质的影响。在本研究中，第一代生精小管的生精细胞和精子细胞显著减少，这表明代森锰锌对睾丸结构有破坏性影响。有报道称，服用代森锰锌后，睾丸生精细胞和血清睾酮水平降低[4］.然而，代森锰锌对胎儿宫内和产后的影响尚未得到评估。结果表明，代森锰锌对精原细胞、精母细胞和精子细胞均有明显的损伤，而维生素E可通过其抗氧化能力来防止这些损伤。最后，睾丸损伤的发生，精子参数的降低，以及可能的不育症被认为是一些谨慎的原因，暴露代森锰锌和可能使用维生素E的不同工人可能遇到代森锰锌暴露。

5.结论

根据研究结果，在妊娠期和哺乳期接触代森锰锌的第一代小鼠的睾丸组织很脆弱，可能受到损害。因此，建议临产孕妇保护自己，避免接触代森锰锌，即使是短剂量和低剂量接触，并在其身体状况下摄入维生素En建议。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者声明，本论文的研究、作者身份和/或发表不存在利益冲突。

致谢

作者非常感谢每一位帮助他们进行这项研究的人。本研究是博士学位论文的一部分，是科曼医学院授予的（930217）。

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