体细胞的基因毒性的铜和镍纳米颗粒黑腹果蝇

文摘

铜和镍纳米颗粒(分别Cu-NPs和Ni-NPs)被用于各种工业应用,如半导体、催化剂、传感器、和抗菌药物。尽管研究其潜在的基因毒性已经存在,其中的一些报告在活的有机体内数据。在本研究中我们使用wing-spot化验黑腹果蝇确定基因毒性活性Cu-NPs Ni-NPs,和这些数据与微粒形式(MPs)获得。此外,一个完整的物理特性NPs使用透射电子显微镜(TEM),动态光散射(DLS)和激光多普勒测速仪(LDV)技术也执行。结果与Cu-NPs Cu-MPs表明都未能诱发突变的频率点的增加形成的翅膀成年人,暗示缺乏体细胞的基因毒性d .腹。然而,当Ni-NPs和Ni-MPs评价,显著增加小的单点和总变异点观察只为Ni-NPs (P < 0.05)在最高剂量评估。因此,基因毒性Ni-NPs似乎与他们的纳米尺寸,因为没有报告基因毒性效应与微粒子和离子。这项研究是第一次评估在活的有机体内基因毒性Cu-NPs和Ni-NPs的潜力果蝇模型。

1。介绍

鉴于其特殊的理化特性和低成本制造、铜和镍纳米颗粒(分别Cu-NPs和Ni-NPs)被广泛应用于不同的工业应用。一方面,Cu-NPs显示热高、导电性和被用于制造润滑剂、聚合物、塑料、金属涂料、和电子设备。此外,他们表现出抗菌性,因此Cu-NPs一直作为潜在的抗菌和/或抗真菌制剂(1]。另一方面,Ni-NPs高导电性和耐腐蚀,在常用的医疗器械,密封剂,塑料,电子设备(2]。尽管使用金属NPs增长,不良信息和基因毒性效应是有限的。

NPs的极其微小的大小允许通过渗透达到轻松活细胞的细胞核通过核孔或在有丝分裂和组织直接与DNA相互作用在染色质和染色体遗传损害(3]。然而,诱导的DNA损伤,NPs不需要接触DNA因为NPs可以与蛋白质参与DNA复制,有丝分裂,也产生大量的氧化应激,从而引起间接损害DNA (3]。因此,NPs应该评估他们的基因毒性效应可能生成和促进人类和环境健康风险。

从现有的文献,我们发现了一些在体外研究表明Cu-NPs诱导神经元细胞死亡和生存能力损失,建议相关的潜在神经毒性和神经退化机制(4,5]。

相反,在活的有机体内用老鼠进行的研究表明,Cu-NPs可以诱导一些毒性效应和损伤肾脏,肝脏,脾脏,但铜微粒或散装形式的不6]。上面也曾被观察到在鱼类生物Cu-NPs已经证明,他们敏锐地对斑马鱼有毒,而且Cu-NPs产生不同的形态和全球影响基因表达模式在斑马鱼腮,但可溶性铜不显示同样的效果,表明这些金属的高毒性效应NPs (7]。最近,Cu-NPs诱变在艾姆斯发现了细菌回复突变试验;这些也可以诱导显著增加的双核细胞微核在最高浓度能促进DNA链断裂和DNA氧化损伤,表明基因毒性风险Cu-NPs接触(8]。

Ni-NPs无疑是研究其他金属NPs越少。然而,也有一些证据表明Ni-NPs可能诱发氧化应激和细胞凋亡在人类细胞(9]。此外,Ni-NPs也可以促进肉瘤和激活或上调基因与癌症相关的通路(10),在在体外研究金属镍好和纳米颗粒都可以诱发高致癌潜力老鼠表皮JB6细胞(11]。尽管缺乏在体外和在活的有机体内基因毒性和诱变研究金属镍和镍基NPs,最近的研究表明,Ni-NPs有更高的细胞毒性和基因毒性的影响比镍微粒在体外而在在活的有机体内研究在相同治疗剂量使用人类细胞和大鼠模型(12]。应该注意的是,最近的研究表明,镍oxide-NPs基因毒性和诱变在哺乳动物细胞在体外而在黑腹果蝇模型(13]。

在目前的研究中,在活的有机体内诱变和recombinogenic活动相关的暴露Cu-NPs wing-spot Ni-NPs测量的试验黑腹果蝇被评估。需要注意的是,近年来果蝇d .腹在检测起到了相应的作用吗在活的有机体内基因毒性和诱变作用的几种金属和金属氧化物NPs,提供几个生物和遗传优势研究急性和慢性影响,NPs行动的潜在机制14]。

2。材料和方法

2.1。果蝇菌株

下面的突变果蝇菌株用于wing-spot测试:多个翼头发菌株的遗传素质y;mwhj;的flare-3菌株的遗传素质flr³/ln(3 lr)TM3,双相障碍^年代。的多个翼毛发标记(兆瓦时,3 - 0.3)是一个完全隐性纯合子的可行的突变,这是保存在纯合状态。它产生多个毛状体每个细胞而不是通常的独特的机翼细胞的毛状体。的flare-3标记(flr³,3 - 38.8)是一种隐性突变,影响翼头发的形状,产生畸形的翼光斑形状的头发。鉴于其合子的杀伤力,耀斑等位基因必须保持股票在均衡器染色体携带多个反演和主要标志,是一个致命的纯合子(TM3,双相障碍^年代)。更详细的信息在表型的遗传标记和描述是由Lindsley和陈军(15]。两个菌株培养在玻璃瓶的标准中果蝇(即。,agar, corn flour and yeast) at a temperature of °C和~ 60%的相对湿度。

2.2。化学物质

铜纳米粒子(Cu-NPs, 60 - 80 nm,中科院7440-50-8,Ref。774103)和镍纳米颗粒(Ni-NPs, < 100海里,ca 7440-02-0)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,美国)。铜微粒(Cu-MPs, < 63μm,中科院7440-50-8,Ref。102703)和镍微粒(Ni-MPs 10μ得到了112277 m, 7440-02-0, Ref。)从默克公司(达姆施塔特,德国)。

2.3。NPs的表征

由于化学供应商对设备所提供的详细信息和方法用于NPs的物理特性限制,一个详尽的铜的物理特性和Ni-NPs在目前进行的研究。为此,透射电子显微镜(TEM),动态光散射(DLS)和激光多普勒测速仪(LDV)。TEM和JEOLJEM - 2011进行了仪器的大小来确定NPs在干燥的形式。DLS和LDV进行莫尔文Zetasizer Nano-ZS zen3600仪器测量水中悬浮体的水动力直径和电动电势,分别。TEM分析,metal-NPs测量浓度为2.56毫克/毫升。DLS和LDV技术,NPs样本测量浓度的10μ克/毫升。

2.4。粒子的制备

粒子制备,我们跟着卡蒙的方法等。16)在不同浓度的Cu-NPs和Ni-NPs(从1毫米到10毫米)准备,用蒸馏水稀释磁性搅拌。之后,色散是由声波降解法使用超声波浴(Elmasonic年代,37千赫)在室温下30分钟。Cu-MPs和Ni-MPs被用来比较基因毒性效应和微观粒子之间nanoparticulated形式。这些化合物是准备和蒸馏水稀释通过磁在室温下搅拌10分钟。蒸馏水作为消极的控制,而诱变剂甲烷磺酸乙酯(EMS)在1毫米作为积极与wing-spot控制在每个实验中进行。

2.5。粒子的毒性果蝇

不同浓度的纳米和微粒子基因毒性实验中使用的铜和镍d .腹菌株选择根据以前的毒性和可行性研究(数据未显示)。一方面,一系列的剂量从0.1到10毫米成立两个粒子大小的铜,和在这些剂量范围Cu-NPs显示比Cu-MPs更高的毒性。因此,而对于Cu-MPs合适的幼虫可行性(> 70%)达成了在10毫米,Cu-NPs无法评估在浓度高于5毫米。

另一方面,一个剂量范围从1到10毫米被选为镍粒子,并在这个范围内得到一个合适的生存能力(> 70%)。一般来说,Ni-NPs和Ni-MPs显示相似的毒性水平;因此粒子都在同一浓度化验。主要标准选择最后的浓度是新兴的幼虫的数量和成人治疗后与wing-spot足够高的执行基因毒性实验测试(17]。

2.6。Wing-Spot测试协议

wing-spot测试作为一个简短的测试系统的基础上,杂合性丢失(LOH)和相应的正常基因的表达隐性标记,叫道多个翼头发(兆瓦时),flare-3(flr³),在成年苍蝇的翅膀叶片18]。因此,诱导基因毒性效应是显微镜下观察到的频率增加突变克隆细胞(兆瓦时或flr³表型)翼幻灯片准备。这个分析可以检测各种突变事件如点突变、缺失,某些类型的染色体畸变(不分离),和体细胞重组18]。

处女的女性flr³应变是交配兆瓦时如前所述(男性17]。从十字架这鸡蛋收集8 h时期在文化瓶包含标准的媒介。结果抱幼虫(第三龄幼虫)被放置在含有4.5克的塑胶瓶果蝇即时介质(卡生物供应,伯灵顿,NC)准备10毫升的各种Cu-NPs无毒浓度(0.1、1和5毫米),Cu-MPs, Ni-NPs, Ni-MPs(1、5、10毫米)。幼虫在这个媒介,直到美联储蛹化。幸存的成年人被收集并存储在70%的乙醇。之后,翅膀被删除好镊子和安装在福尔在显微镜载玻片的解决方案。翅膀是得分在放大400倍的存在小单点,大型单点、双点。小单flr³点也在机翼样品,但这些都是包含在总突变点,通常已经在以前的作品中表达的19]。在每个系列,80翅膀得分(40人)。苍蝇和数据评价得分进行wing-spot测试的标准程序后,使用最近的调查(20.]。

2.7。统计分析

条件二项测试用于评估每种类型的点的频率差异处理和并发负控制显著水平α=β= 0.05 (21]。多重判定过程被用来判断一个代理的总体响应积极、消极的,或不确定的22]。治疗被认为是积极的,如果克隆突变的频率至少在治疗系列米(倍乘法因子)在控制系列。因为小单的斑点和总斑点自发的频率比较高,米是固定在一个值2(自发频率的测试一倍)。对于大型单点、双点自发频率较低,米使用= 5。克隆形成的频率计算,没有尺寸修正,除以的数量兆瓦时克隆/翼,到24400年,这是近似的细胞检查数量(一个翅膀23]。

3所示。结果与讨论

为了证实金属的物理特性NPs供应商TEM, DLS直径和LDV技术进行评估,形状,水动力大小,分别与稳定Cu-NPs和Ni-NPs。

TEM是用来描述干燥metal-NPs的大小。一方面,Cu-NPs显示球面形状和显示低水平的聚集(图1(一))。Cu-NPs的大小范围从9.6到100 nm直径、直径和平均(±SD) 纳米(图1 (b))。TEM图像和分析代表Cu-NPs (n = 100)表示,规模较小的比从制造商的迹象(60 - 80 nm)。

另一方面,Ni-NPs展出主要是椭圆形的形状和他们的NPs显示一定程度的聚集(图1 (c))。Ni-NPs的大小范围从19.30到187.27 nm直径,平均(±SD) 纳米(图1 (d))。Ni-NPs TEM分析表明,大小类似于制造的迹象(< 100海里)。

水动力特性metal-NPs总结表1。metal-NPs在水中悬浮的平均直径是不同的和高于TEM分析,达到平均值为260.9 nm为Ni-NPs Cu-NPs和217.5海里。这些差异通常解释为NPs结块的趋势在水介质中,使他们比在初级大小(24]。电动电势的平均−19.6 mV Cu-NPs Ni-NPs和−24.6 mV,表明适度稳定和分散在水介质nanocompounds喂养d .腹幼虫(25]。

的数据Cu-NPs和Cu-MPs wing-spot测试总结表2。虽然克隆形成的频率随浓度依赖方式(从1.35到2.01),结果表明,Cu-NPs不引起任何突变点的频率明显增加,与消极的控制。此外,Cu-MPs显示类似的负面结果,表明这两个粒子不促进突变事件和重组活动果蝇。

表3总结了结果和Ni-NPs Ni-MPs治疗。结果表明,Ni-NPs能引起显著的单小点的频率和总突变点。上述确认的频率克隆形成,表现出明显的增加趋势当Ni-NPs浓度增加(1.15 - 2.50)。然而,Ni-MPs不引入突变点的显著增加,表明NPs会观察到负责基因毒性影响。应该注意的是,突变点的平均频率记录在消极的控制(0.28 - -0.41)是按照正常的背景在实验室里观察到的范围和不显著不同于以前的结果26]。积极的控制进行1毫米EMS显示一个明确的回应,和突变点频率也同意以前和最近的研究。

在本研究中,wing-spot测试的果蝇被选为评估基因毒性的铜和镍纳米材料。这在活的有机体内短期测试使用真核生物是一个全面的基因毒性试验等不同突变事件可以测量,如点突变、删除和某些类型的染色体畸变。此外,wing-spot化验也区分增生性体细胞有丝分裂重组,是一个复合的定量recombinogenic活动最重要的基因毒性筛选与致癌过程由于强烈的关系(27,28]。因此,这种分析提供了许多优点,它已被证明是一个优秀的候选人作为生物监测基因毒性纳米材料(14]。

一般来说,有几个基因毒性和诱变研究Cu-NPs可用文献中,这可能是难以与当前的研究果蝇。

然而,在体外研究表明,Cu-NPs可以诱导细胞死亡,生存能力损失,多巴胺耗竭,改变多巴胺基因的系统表达,和氧化应激在神经元的老鼠,表明潜在的神经毒性和神经退化机制与急性博览会Cu-NPs平均直径40到90海里(4,5]。此外,Cu-NPs可以诱导一些毒性效应和损伤肾脏,肝脏和脾脏小鼠暴露于Cu-NPs 24海里的平均直径(6]。在斑马鱼模型(鲐鱼类),Cu-NPs平均大小为80 nm表明,他们敏锐地有毒斑马鱼在低浓度(1.5 mg / L),而无毒浓度(100μ吉尔g / L)可以诱导损伤,影响吉尔生化标记物的功能,改变压力和金属反应基因表达鳃(7]。因此,这些金属NPs似乎引起毒性作用在不同的测试系统包括哺乳动物和鱼类生物。

直到现在,只有一个研究已经发表Cu-NPs的基因毒性。在这项研究中,发现Cu-NPs诱变在艾姆斯测试(TA98和TA100菌株),还发现有毒细菌的细胞(细胞毒性)的剂量依赖性的方式。同时,Cu-NPs诱导显著增加数量的双核细胞微核在猴肾细胞浓度评价最高,表明染色体损伤在体外。最后,Cu-NPs还诱导DNA链断裂的彗星试验和DNA氧化损伤相关(8]。这些结果与wing-spot试验中所观察到,在纯Cu-NPs没有促进体细胞的突变和重组活动d .腹。但这些差异可以通过使用不同的系统分析(在体外与在活的有机体内测试)和生物模型(细菌和哺乳动物和昆虫)基因毒性筛选。因此,进一步全面研究包括不同和有毒生物和基因毒性评估要求澄清Cu-NPs遗传效应;特别是在活的有机体内研究需要确定整个生物体的基因毒性机制。

另一方面,Cu-NPs显示高水动力大小(261海里)和低Z潜力,表明集聚和较低的稳定的粒子在水介质中,这代表NPs接触的实际情况与智能测试实验果蝇。因此,没有在本研究中发现的基因毒性可能与物理性质的变化Cu-NPs失去生物活性(由小尺寸和大表面积)和生成DNA损伤的能力通过直接或间接的机制的体细胞d。然而,缺乏积极的结果与Cu-NPs wing-spot测试也可能相关的这种纳米材料在水中的溶解度差媒体,因为以前聪明的研究表明积极的结果,更多的可溶性铜形式:CuO-NPs [26]。因此,铜离子释放NPs可以被认为是一个在活细胞毒性的主要机制,表明NPs的溶解度和基因毒性的关系时要占一个方面解释纳米毒理学结果Cu-NPs [29日]。

尽管一些数据关于基因毒性的影响单Ni-NPs可用文献中,这项研究的结果与最近的研究进行的协议在体外和在活的有机体内研究。从DNA证据使用彗星碎片分析试验表明,Ni-NPs平均直径52 nm主要引起DNA损伤的剂量和时间的方式。这些Ni-NPs还发现诱导氧化应激,活性氧(ROS)的产生和消耗的谷胱甘肽(谷胱甘肽),暗示的能力Ni-NPs诱导氧化应激导致基因毒性对人类皮肤细胞(A431) [30.]。其他镍基纳米材料,如氧化镍纳米颗粒(NiO-NPs)显示诱导细胞周期改变的人类肺上皮细胞系(BEAS-2B和A549)甚至在不同阶段和这些修改可能引起NPs基因毒性效应,提出的核易位phospho-ATM和phospho-ATR31日]。

另一方面,在活的有机体内研究女性Wistar鼠评估与微核基因毒性,染色体畸变,彗星化验表明,NiO-NPs管理通过口服途径能够诱导染色体变化和DNA断裂在高剂量水平和这些影响更加突出在24小时采样时间(32]。

除了基因毒性效应,应该注意的是,Ni-NPs显示肿瘤促进剂诱导的影响或抑制基因表达以及细胞转换(JB6细胞)在小鼠表皮细胞,表明金属Ni-NPs carcinogenetic在体外(11]。因此,使用金属Ni-NPs为未来的应用程序应该谨慎对待由于其潜在毒性和致癌性。

我们的研究结果首次报告上的数据评估Ni-NPs基因毒性的在活的有机体内wing-spot测试果蝇。治疗与高浓度的Ni-NPs诱导显著增加单和总点的频率分析;然而,Ni-MPs负诱导突变点。主要是因为Ni-NPs诱导单突变体和低双点的数量,可以主要归结为基因毒性观察Ni-NPs(即突变事件。、点突变、缺失和染色体分离),不包括recombinogenic活动。考虑到先前的研究与镍离子和可溶性形式(例如,NiCl₂和你₄)显示的负面结果果蝇wing-spot测试(33),不会影响发现Ni-NPs表明内在纳米尺寸和大表面积这些粒子扮演相关角色的属性归纳的体细胞突变果蝇。此外,最近的研究也NiO-NPs表明基因毒性和诱变果蝇这种金属纳米粒子支持本研究中发现的基因毒性效应(13]。尽管氧化DNA损伤并不在本研究评估果蝇,先前的研究已经表明,Ni-NPs可以生成细胞内氧化应激损害DNA细胞,这表明该机制的行动负责他们的基因毒性8,12,34]。

4所示。结论

Cu-NPs未能诱发突变点的增加果蝇翅膀的成年人,表明缺乏体细胞的基因毒性d .腹。然而,Ni-NPs评估时,显著增加小单点和总变异点的观察在最高剂量评估。因此,基因毒性Ni-NPs似乎与纳米级大小有关,因为他们没有报告基因毒性效应与微粒子和离子形式。这项研究是第一个评估在活的有机体内基因毒性Cu-NPs和Ni-NPs的潜力果蝇模型。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突的研究,本文的作者,和/或出版。

确认

作者感谢FONDECYT-CONICYT所提供的金融支持,项目11110181;Direccion一般de Investigacion y Postgrado,天主教大学de Temuco DGIP节点CD 2010 - 01年项目,和MECESUP开普敦大学0804项目。作者感谢M.J. Rivadeneira和M.M.卡修改英文版本的手稿。

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