拟除虫菊酯类杀虫剂d-Tetramethrin和cyphenthrin二元混合物的斑马鱼胚胎毒性

摘要

Pesguard FG161™是d-tetramethrin和cyphenthrin(1:3比例)的混合物，被广泛用于快速控制登革热病媒，埃及伊蚊，在疾病爆发期间。D-四甲素和西肽素均为合成拟熟肽，已知对非哺乳动物的生物（如鱼类）具有不利影响。本研究旨在使用斑马鱼胚胎毒性模型来研究上述二元混合物对鱼类的毒性作用。特别是，斑马鱼胚胎毒性模型在动物福利视角方面提供了急性鱼类毒性测试的替代，因为胚胎未被认为直到受精后5天。斑马鱼胚胎（施肥后2小时）暴露于不同浓度的拟除虫菊酯的二元混合物（D-四甲醚：0.01-1.20μ摩尔氯菊酯:0.03 - 3.20μ摩尔 )在室温(26°C)下放置24、48和72小时。236.通过观察致死终点和LC计算胚胎死亡率₅₀使用概率分析计算每个时间间隔的值。这种二元混合物对斑马鱼胚胎具有高度毒性，并被发现与浓度和时间有关。LC.₅₀24小时(d-tet: 0.58μ摩尔 ,cyp:1.74μ摩尔 )48小时内显着降低（D-Tet：0.11μ摩尔 ,cyp:0.33μ摩尔 )72 HRS (d-tet: 0.03μ摩尔 ,cyp: 0.09μ摩尔 ).胚胎凝固是观察到的最常见的致死效应，也观察到缺乏体节形成和缺乏心跳。目前的研究表明，即使以名义浓度为基础，二元混合物对斑马鱼胚胎也是高度有毒的。因此，广泛使用这些杀虫剂可能会对鱼类种群有害，因此建议采用最低限度使用杀虫剂的综合病媒控制方法。此外，本研究强调了斑马鱼胚胎毒性模型作为研究拟除虫菊酯对鱼类毒性的替代方法的适用性。

1.介绍

登革热是一种主要的蚊媒病毒性疾病，影响了超过125个国家。全球登革热发病率已达到流行病水平，在过去50年里增长了30倍[1］.登革热每年造成约5亿例病例，100万至300万人死亡。此外，登革热的经济和社会负担巨大[2］.

尽管疫苗和化疗的发展进展，但蚊子矢量控制仍然是登革索控制最有效和主要的策略[三]。数十年来，病媒控制工作已成功地用于防治登革热感染。目前的病媒控制战略包括针对不同阶段蚊子的化学和生物制剂的组合以及繁殖地的管理[1］.登革热主要通过蚊虫叮咬传播埃及伊蚊[4］.然而,白纹伊蚊也被确定为二级病媒[5］.A. Aegypti.是一种在白天以多种宿主为食的城市传播蚊子[6]。这种行为大大助长了登革热的流行传播[7］.因此，控制病媒对减少疫情暴发极为重要。

杀虫剂是控制登革热等病媒传播疾病的主要工具。有机氯、有机磷、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯是广泛用于病媒控制的杀虫剂类别[8]50多年来，印度和太平洋流域国家广泛使用二氯二苯三氯乙烷（DDT）和六氯化苯（BHC）等有机氯用于农业和公共卫生目的，包括控制疟疾[9］.在斯里兰卡，DDT在大量用于控制疟疾中，主要是在1958年至1963年的五年期间，主要是在五年期间，发现非常有效和成功[10］.然而，这些化学物质被确定为持久性有机污染物;它们对环境和生物群的不利影响造成环境污染以及对野生动物和人类的影响有充分的文献记载[9］.因此，这些含氯杀虫剂被禁止或严格限制使用，并引入有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯等替代杀虫剂[9］.拟除虫菊酯通常用于蚊子控制，木材保存，羊毛地毯和纺织品中的应用[11]已知拟除虫菊酯可通过农业径流进入水环境，或通过空中或地面喷洒进入水环境，这些应用可能通过直接接触对鱼类种群构成威胁，尤其是对这些杀虫剂耐受性较差的幼鱼[11］.

Pesguard FG 161™ 是一种含有d-四氯菊酯（4%w/w）和氯氰菊酯（12%w/w）的商业制剂，广泛用于登革热病媒控制[12］.D-四甲菊酯（3,4,5,6-四氢邻丙二酰亚胺甲基（1RS)-顺反式-菊花)为敲除剂，环苯菊酯((S)- -cyano-3-phenoxybenzyl (1R, 3R)-2,2- dimethyl-3-(2-methylprop-1-enyl) cyclopropanecarxylate)为杀菌剂;协同作用能有效控制幼虫期和成虫期A. Aegypti.,白纹伊蚊,中华按蚊， 和这种致倦库蚊[12]．在登革热爆发期间，这种二元混合物被用作空间喷雾剂(地面或空气)，以迅速控制受影响地区的成蚊[13］.在某些情况下，较高浓度的混合物被用作杀幼虫剂[12］.Pesguard FG 161™在斯里兰卡的空间喷雾应用导致10米距离内100%的成虫杀死活动[13]是控制成蚊最有效和最常用的策略。

D-tetramethrin和cyphenthrin是合成的拟除虫菊酯[14］.拟除虫菊酯是天然除虫菊酯的化学类似物，是观赏植物的提取物菊花cinerariaefolium,及其近缘种[15］.拟除虫菊酯具有优异的杀虫性能、低哺乳动物毒性和低生物积累[14］.D-tetramethrin被归类为I型拟除虫菊酯，没有氰基部分α-位置，而氯菊酯属于II型拟除虫菊酯α-氰基在酯醇部分的苯基碳上[16]拟除虫菊酯通常是神经毒素；I型和II型都能延长蚊子电压门控钠离子通道的开放时间[17］.此外，氯氰菊酯(II型)通过干扰神经丝中的GABA(-氨基丁酸)受体来影响神经丝中的氯离子和钙离子通道[17］.

虽然建议使用杀虫剂来控制病媒传播疾病，但应仔细调查与过度使用有关的风险。未受人类活动影响的天然水中通常不存在拟除虫菊酯[16］.由于直接弃置、未使用的残余物、滥用或误用、喷溅和径流等原因，杀虫剂进入地表水[16］.拟除虫菊酯作为城市杀虫剂可通过郊区和城市地区的混凝土排水系统到达地表水[18］.虽然拟除虫菊酯对哺乳动物的毒性明显较低，但它们对鱼类的毒性却是高度和剧烈的[19］.鱼类对拟除虫菊酯过敏的部分原因是它们代谢速度缓慢、神经系统对拟除虫菊酯高度敏感，以及易于被鳃吸收[16,20.］.

斑马鱼模型为化学品(如杀虫剂、杀菌剂和药品)的环境风险评估提供了有价值的见解[21］.这种模式也被推荐作为鱼类急性毒性的替代方法[22,23］.斑马鱼，科学上称为鲐鱼类，是一种小型淡水鱼，身长约2-4厘米。体型小，生命周期短，繁殖力高，卵量大，胚胎在母体外发育透明，受精后24小时大多数器官原基形成，发育迅速，使斑马鱼成为鱼胚胎毒性(FET)试验的理想对象[24,25]。在斑马鱼毒性模型中，一系列不良的形态表型和行为终点被用来预测毒性作用机制[25］.

虽然拟除虫菊酯的哺乳动物毒理学已经建立，但对鱼胚胎毒性的研究相对较少。DeMicco等人(2009)报道，斑马鱼胚胎暴露于I型除甲胺磷外的拟除虫菊酯类(氯菊酯、甲胺磷和联苯菊酯)和II型除虫菊酯类(溴氰菊酯、氯氰菊酯和l-氯氟氰菊酯)时，观察到剂量依赖性死亡率[22］.然而，尚未研究D-四甲菊酯和西霉素及其对鱼胚胎的协同作用的影响。因此，本研究旨在探讨D-四甲菊酯和Cyphenrin对斑马鱼胚胎二元混合物的急性毒性作用。该研究的发现可能会扩大拟除虫菊酯毒性的现有知识。此外，我们的研究可能会鼓励可持续使用杀虫剂控制载体传染性疾病，随后降低了对环境的风险和影响，导致综合害虫管理（IPM）策略与替代方法或技术，如非经营替代方案.

2.材料和方法

2．1．杀虫剂

水性Pesguard FG 161™含有d-tetramethrin 4 g(12069.64μ摩尔 )和氯菊酯l2 g(31960.79μ摩尔 )斯里兰卡国家登革热控制股提供了用于超低容量和热雾化目的的建议配方。

2．2．本研究的伦理考量

这项研究涉及到长达72小时的胚胎毒性，研究不需要伦理批准。根据美国国家卫生研究院的说法，斑马鱼在受精后大约72小时孵化时被认为是活的动物[26］.

２．３．斑马鱼育雏种群的维持

根据OECD第236号指南进行育雏种群维护[27］.年龄在3到6个月之间的野生斑马鱼从科伦坡的一个水族馆购买，并在斯里兰卡开放大学动物学系的实验室作为一种产卵种群。雌性和雄性分别饲养在长80厘米、高50厘米、宽46厘米的玻璃鱼缸内，提供足够的空间供它们游泳(即:每条鱼1升)。标准稀释水(294.0 mgCACL.₂H·2₂O: 123.3毫克MgSO₄H·7₂O: 63.0毫克那科_三：5.5毫克ISO 7346-1及7346-2所建议的氯化钾)[28,29]是用来养鱼的。鱼保持在26±1°C;自然光照/暗循环12 HRS，连续曝气。将水的pH调至6.8至8.4(使用盐酸和氢氧化钠)。鱼每天喂食两次人工饲料(Aquaplus, Aqua鱼食，印度)。经常清除食物和粪便保证了氨、亚硝酸盐和硝酸盐保持在检测限度(0-5、0.025-1和0-140毫克)以下 ,分别)。然而，氨、亚硝酸盐和硝酸盐的含量是用市场上可买到的试剂盒(印度Aquaplus)进行测定的。

２.４.产卵的斑马鱼

卵由斑马鱼按雌雄比例2:1随机配对获得[27］.在产卵期间，女性容易被肿胀的肚胀与男性不同。使用绿色金属丝网（1.25mm）固定的玻璃育种罐（L 26cm：H 12.5 cm：w 20 cm）用于产卵，以防止鸡蛋被成年人蚕食。相同的稀释水用于产卵。人造植物用作育种兴奋剂和基材。提供连续通气。在黑暗发作前立即将鱼加入到繁殖罐中。

2．5．收集鸡蛋

日出后30分钟内产卵和受精。在天亮后一小时内采集卵。产卵后约30-60分钟，取出成鱼和铁丝网，用塑料吸管将鱼卵转移到含有标准稀释水(每盘50枚)的60 mm培养皿中。使用倒置显微镜(A.Krüss, Optronic, Germany)选择受精卵。通过胚胎的分裂鉴定受精卵。

2.6.胚胎毒性试验

对5 (d-tetramethrin: 0.01 ~ 1.20)的混合药剂进行了测定μ摩尔氯氰菊酯：0.02–3.20μ摩尔 )用标准稀释水稀释后的浓度。随机选取30枚受精卵，转移到60 mm培养皿中，培养皿中加入不同浓度的d-tetramethrin和cyphenthrin混合物，阳性对照(4mg(24.69μ摩尔 )3, 4-dichloroaniline) [27]（美国西格玛）和阴性对照（仅稀释水）[27，以尽量减少从稀释水直接转移的稀释浓度和尽量减少曝光延迟。

20个胚胎分别暴露在24孔微滴度板(美国康宁公司)中，每个孔含有各自浓度的2 ml杀虫剂混合物。板材用相应的溶液进行预处理，以尽量减少塑料材料的吸收[27］.用于每种试验，阴性对照和阳性对照的每种浓度24孔板。每个板的二十个孔用于试验溶液，其余的4个孔用作内部对照（含稀释水）。将板覆盖有非粘性箔，并在室温（26℃）远离阳光下，阳光直射为24,48和72小时[27］.试验在受精后2小时内开始。

2.7。毒理学终点的检测

在24、48和72小时的时间间隔，用倒置显微镜(SZ61, Olympus，日本)观察每种浓度的胚胎。毒理学终点，如凝血(CA)、尾不脱离(NDT)、缺乏体节形成(LSF)和缺乏心跳(LHB) [27]在复合显微镜下观察(CH30, Olympus，日本)，用相机捕捉(Tucsen，中国)。在72小时内观察胚胎的孵化情况。

2.8。统计分析

计算每个浓度在不同时间间隔的死亡率百分比。获得两个独立实验的平均值。LC₅₀使用SPSS软件包中的probit方法计算置信区间(CI)值[30.].使用SigmaPlot 14绘制图形。

3.结果

３．１．LC.₅₀d-四氯菊酯和氯氰菊酯二元混合物对斑马鱼胚胎毒性的价值

斑马鱼胚胎(受精后2小时内)暴露于不同浓度的四氯氰菊酯和氯氰菊酯二元混合物，表明毒性是时间和浓度依赖性的。如表所示1,信用证₅₀24小时(d-tet: 0.58μ摩尔 ,cyp:1.74μ摩尔 )48小时内显着降低（D-Tet：0.11μ摩尔 ,cyp:0.33μ摩尔 )72 HRS (d-tet: 0.03μ摩尔 ,cyp: 0.09μ摩尔 ).LC₅₀24小时时的值在72小时时减少了近20倍。LC₅₀值与暴露时间呈显著负相关(P<0.05)。不同时间间隔的卡方值不显著，表明胚群不均匀。混合物24、48和72小时的剂量响应曲线如图所示1这些曲线被拟合成4参数的S形希尔曲线。

在不同时间间隔的对照试验中，发现胚胎死亡率低于12.5%。此外，阳性对照组（4 mg(24.69μ摩尔 )3,4 -二氯苯胺)的胚胎死亡率甚至在暴露24小时也超过80%。内部对照未发现胚胎死亡率。阴性对照死亡率低，阳性对照死亡率高，验证了实验的可靠性。

20个批次的鱼胚胎暴露于5个不同浓度的d-tetramethrin和cyphenthrin二元混合物(在稀释水中稀释)中。在两个独立的实验中，每24小时间隔记录死亡率至72小时，并计算死亡率百分比的平均值。LCL和UCL分别表示信用证的下限和上限₅₀值。

３．２．暴露期间观察到的致死终点类型

图1总结了24至72小时暴露时的致死效应数据2．观察结果表明，凝血(图2)是观察到的最常见的致死效应形式。如图所示，在一些胚胎中也可以看到体节缺乏和心跳不足2。图中还显示了每个时间间隔孵化的斑马鱼数量2．试验72小时后孵化出无致死效应的胚胎。

表现出致死效应的胚胎也表现出低色素沉着和发育迟缓。然而，出于伦理考虑，当试验停止72小时后，孵化的幼虫没有表现出任何亚致死效应。

4.讨论

Pesguard FG 161™由d-tetramethrin和cyphenthrin(1:3)组成，广泛用于登革热病媒控制，但对环境影响的研究较少。在环境毒理学研究中，鱼类毒性有更大的前景。大多数鱼类毒性研究是用成鱼或幼鱼进行的[三,31];然而，有人提出反对使用活鱼[32]斑马鱼胚胎毒性模型被认为是经典的活鱼急性毒性试验最有希望的替代方法[32］.较高的繁殖力和快速的发展使得在较短的时间内检测大量样本成为可能[33］.此外，胚胎的透明特性使它们在测试过程中很容易看到形态和发育异常[33］.在母体外发育的卵子提供了将卵子直接暴露于毒物的能力，并允许与需要将毒物吸入母体的哺乳动物相比确定剂量[22］.此外，斑马鱼模型被推荐为评价手性农药的合适模型[33］.

我们的结果显示，Pesguard FG 161™d-tetramethrin和cyphenthrin二元混合物对斑马鱼胚胎具有高度毒性。毒性随暴露时间的增加而增加，试验胚胎在72小时时观察到。信用证的明显区别₅₀结果表明，两种拟除虫菊酯的增效作用与斑马鱼的不同发育阶段有关。此外，Pesguard FG 161™的商业配方可能含有其他可能导致毒性作用的物质。因此，在今后的研究中将重复使用纯形式的拟除虫菊酯。

有人认为，斑马鱼胚胎毒性的致死终点可能不能准确地代表敏感的神经毒性作用，而幼鱼或成鱼可能对拟除虫菊酯更敏感[33］.此外，拟除虫菊酯的立体化学性质也会影响其毒性。一般来说，对哺乳动物来说，拟除虫菊酯的顺式异构体比反式异构体毒性更大[34]鱼对立体化学的敏感性取决于拟除虫菊酯的类型[16］.然而，Kent(1996)指出d,d，反式氯氰菊酯与氯氰菊酯的差别不大[35]。然而，立法会₅₀在我们的实验中48和72小时的二元混合物获得的值低于前一个实验中的二元混合物，表明D-四甲菊酯和Cyphenrin的协同作用。此外，其他环境因素（温度，水，pH，总硬度和溶解氧）也可以影响毒理学测定。

四氯菊酯被发现对淡水虹鳟有剧毒(雄鱼mykiss)用信用证₅₀价值3.7μ克/升（0.01μ摩尔 )(流过)和21μg/L（0.06μ摩尔 )(静态)，分别使用96小时[36］.类似地，氯氰菊酯表现出LC₅₀值为0.38μ0.001 g / l (μ摩尔 )在急性流动系统内的虹鳟鱼于96小时内进食[36］.结果发现，与斑马鱼胚胎相比，四氰菊酯和氯氰菊酯对虹鳟鱼的毒性都很高。虹鳟鱼也是研究化学物质毒性效应的一个有价值的模型[37］.虹鳟鱼对拟除虫菊酯的高度敏感可能部分归因于斑马鱼胚胎可能不能很好地反映神经毒性化学物质造成的致命性。神经毒素会影响鱼的运动，进而影响鱼鳃的摄氧量，导致死亡[38］.这些影响在胚胎中是不存在的，因为氧气的摄入主要是通过扩散发生的[38］.因此，胚胎对拟除虫菊酯的敏感性可能低于成虫或幼鱼。尽管该模型对拟除虫菊酯的敏感性较低，但考虑到使用大量鱼类的伦理问题，该模型可作为评估鱼类毒性的一种有效替代方法。

斑马鱼胚胎毒性试验的最大挑战之一是难以维持浓度，而且实际暴露浓度通常会明显低于试验中使用的浓度[38］.因此，斑马鱼胚胎敏感性的降低可能是由于试验和暴露浓度的差异。因此，需要进一步的实验来确认实验的暴露浓度。此外，斑马鱼胚胎对拟除虫菊酯的敏感性可以通过对幼鱼进行平行研究来验证。

据报道，除哺乳动物比较等效浓度的哺乳动物，拟除虫菊酯比哺乳动物更高1000倍[16］.与其他脊椎动物相比，鱼类对拟除虫菊酯的敏感性主要是由于生物转化速度较慢[16].鱼类缺乏拟除虫菊酯水解酶[39］.此外，鱼的神经系统对拟除虫菊酯类杀虫剂非常敏感，而且易于通过鳃被鱼的血液吸收，因此鱼对拟除虫菊酯类杀虫剂的毒性更敏感[16,20.］.

在所有浓度和时间中，拟除虫菊酯二元混合物的致死效应以凝卵最常见，其次是体节形成和心跳减弱。先前对马拉硫磷进行的实验也报道了胚胎凝固是常见的致死作用[40这与我们的观察结果是一致的。每种浓度下观察到的所有活胚均在72小时孵化。虽然目前的研究集中在致死效应上，但亚致死和致畸变形的鉴定对于全面了解这些拟除虫菊酯的毒性至关重要。因此，鼓励进一步的研究。

在目前的试验中，单个卵子来自两个不同的育雏种群。人们相信，在不同批次的卵子之间传播的复制产生了更可靠的结果。对照组的死亡率较低（12.5%），阳性对照组的死亡率较高（超过80%）说明实验的可靠性。此外，没有胚胎在内部控制孔中死亡；因此，假设平板中的惰性物质没有影响。

虽然拟除虫菊酯对哺乳动物的毒性较低，但人类在轻度急性职业性接触后可能表现出短暂的头晕、头痛、恶心、厌食和疲劳症状[41］.皮肤接触拟除虫菊酯可能导致暴露部位的暂时性皮肤刺激和感觉异常。

拟除虫菊酯对鱼类和其他水生生物的毒性很高，因此在户外和水体中应用受到限制[42］.相反，它们被应用于超低体积(ULV)应用(也称为热或冷雾)[43］.两条巨型鳗鱼(欧洲鳗鲡)1991年和1995年在匈牙利巴拉顿湖的破坏发现，溴氰菊酯是一种抗疟原虫杀虫剂K-OTHRIN 1 ULV的活性成分，是病原体(Abramis brama)、梭鱼(光皮刺五加)及普通海鸥(美国落叶松)发现其他数种动物受影响[44］.虽然空间喷洒可迅速减少成蚊数量，但仍须定期重新喷洒，以维持控制[42]因此，在暴发期间，大量杀虫剂被释放到环境中。喷洒形式的杀虫剂可能随风和雨飘移，并可能冲入地表水中。此外，残留物的处理和不当使用（如清洗喷洒设备）可能会污染水体[45］.

与我们的研究一致，先前的实验还表明，拟除虫菊酯即使在急性暴露时也对鱼类和其他水生生物有害[46］.因此，应尽量减少这些杀虫剂对水体的污染。一般来说，拟除虫菊酯只存在很短的时间，并被阳光(光降解)、水中的化学反应(水解)和微生物的作用(生物降解)迅速降解[47］.因此，应开展更多的研究，以评估登革热暴发季节水体中这些化学品的残留水平。

尽管这些杀虫剂从疟疾和瘟疫中拯救了数百万人的生命，但它们对环境的长期影响可能是毁灭性的[48,49］.因此，公众对控制病媒传播疾病和与使用杀虫剂有关的环境风险的相互竞争的关切应得到平衡。

结论

本研究观察到的实验数据揭示了Pesguard FG 161™d-tetramethrin和cyphenthrin与非目标生物(如鱼类)联合使用的健康风险。拟除虫菊酯二元混合物在斑马鱼胚胎中具有致死终点;因此，该模型可作为鱼类保护阶段的替代模型。由于胚胎对拟除虫菊酯等神经毒素不太敏感，建议进一步研究。本研究的最终目标是以可持续和公平的方式减少疾病负担。如果拟除虫菊酯没有得到很好的维护，这些对生态系统的威胁很容易成为现实。

数据可用性

用于支持这项研究结果的[死亡率]数据包括在文章中

信息披露

这项研究没有从公共、商业或非营利部门的资助机构获得任何具体的资助。

的利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者非常感谢Mangala Gunathilaka教授在斑马鱼胚胎毒性模型方面给予的宝贵指导。我们特别感谢斯里兰卡国家登革热控制单位提供Pesguard FG 161™来开展这项研究。

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