曲马多引起肾上腺机能不全:组织学、免疫组织化学、超微结构和生化遗传实验研究

文摘

曲马多是合成,集中镇痛。它是最消耗世界上麻醉药物处方。曲马多滥用在埃及显著增加。长期使用曲马多可引起内分泌病。所以,本研究的目的是分析肾上腺机能不全引起的长期使用曲马多在实验动物并评估其戒断效应通过组织病理学和生化遗传研究。四十岁男性白化病老鼠被用于这项研究。老鼠被分为4组(对照组,tramadol-treated集团和戒断组)。曲马多是白化病老鼠的剂量80毫克/公斤体重3个月后戒断期(7 - 15天)老鼠牺牲。长期使用曲马多诱导严重肾上腺组织病理学变化。曲马多的血清皮质醇和DHEAS激素水平下降。 In addition, it increased the level of adrenal MDA and decreased the genetic expression of glutathione peroxidase and thioredoxin reductase in adrenal gland tissues. All these changes started to return to normal after withdrawal of tramadol. Thus, it was confirmed that long term use of tramadol can induce severe adrenal insufficiency.

1。介绍

盐酸曲马多(曲马多™)是合成集中作用与阿片肽和非阿片类镇痛药物的属性。使用非肠道和口服治疗中度到重度的疼痛由于其相对较低的风险呼吸抑郁或身体依赖性和更好的安全性相比与其他鸦片(1]。

曲马多是C的分子式₁₆H₂₅没有₂。口服后迅速吸收和血液水平达到峰值之后大约2 - 3小时。它的半衰期约5 - 6小时,脱甲基作用在肝脏代谢。其活性代谢物(O-desmethyltramadol)具有较高的亲和力mu-opioid受体和父药物镇痛效果的两倍2]。

曲马多的最常见的不良反应是恶心、呕吐、头晕、厌食、痉挛、低血压可能发生在治疗或有毒的剂量(3]。死亡的最常见的机制曲马多过量后心肺抑郁、抗休克、心搏停止,肝功能衰竭。曲马多的致命毒性报道后共同服用的其他药物包括普萘洛尔、乙醇、巴比妥酸盐,苯二氮卓类(4]。

最近,年轻人“通常用曲马朵代替海洛因的瘾君子。“曲马多重复政府在这样的病人可能会导致血液中有毒代谢产物的积累,从而提高其潜在毒性[5]。曲马多滥用显著提高了自2008年以来在埃及和导致许多严重的健康和社会问题,许多招生成瘾治疗中心(6]。

有最近的一项研究显示,大约40%的临时清洁工和21%的永久Zagazig城市在政府医院工作的清洁工在埃及使用曲马多。最近的一项政府调查1800名卡车和小型公共汽车司机发现,200人(11%)承认工作时经常使用的药物。同时,曲马多滥用与18.7%的死亡率由于道路交通事故7]。

许多研究人员探索和评估的影响长期使用曲马多在许多器官,例如,肝、肾、睾丸,心,和甲状腺。由于一些数量和稀疏数据的评价慢性使用曲马多对内分泌系统的影响,本研究的目的是分析白化大鼠的肾上腺功能不全引起的慢性使用曲马多和撤军的效果。

2。材料和方法

2.1。动物

本研究进行40成年男性纯种白化大鼠体重(体重大约200 - 250通用)12周的年龄。这些老鼠从Minia Minia大学实验动物生长中心,埃及。他们被安置在塑料笼子和美联储一个标准实验室饮食(随意)和水在实验期间。所有的老鼠都保持在良好的通风和充气房间的实验室温度 °C。动物护理和治疗的各个方面进行了根据当地导游行医学院伦理委员会,Minia大学埃及。

2.2。化学物质

曲马多(盐酸曲马多),50毫克平板电脑,从孟菲斯获得了制药和化工行业,埃及。溶解在水中,根据研究“Matthiesen et al。8]“LD₅₀值的口服曲马多估计约为300 - 350毫克/ Kgm老鼠和老鼠的体重。曲马多在剂量80毫克/ Kgm体重根据“El-Gaafarawi (9]。“这治疗剂量计算根据“佩吉特和巴诺(10]。“选择剂量几乎与人类有效的治疗剂量。

2.3。实验工作

这个实验工作做了部门的法医学&临床毒理学、生物化学、组织学,在医学院,Minia大学期间埃及,从1月1日到2017年3月底。动物被分成4组(每组10大鼠)如下:组(对照组):老鼠喂一个标准实验室的食物和水第二组(tramadol-treated组):老鼠给予曲马多的剂量80毫克/ Kgm体重口头通过鼻胃管12周第三和第四组:他们撤军曲马多组。一周后接受曲马多牺牲了曲马多戒断组3和2周后的曲马多组4中撤出。

老鼠被斩首后牺牲光乙醚麻醉和解剖年底12日13日和14周的治疗。所有批准的条件被认为是用于动物住房和处理。随后的实验使用协议的规定管理和实验动物的痛苦的牺牲。

2.4。组织学研究

2.4.1。光显微镜检查

每个部分肾上腺被完好无损,缓冲福尔马林固定在10%其次是使用常规石蜡包埋过程。Seven-micrometer部分与二甲苯deparaffinized和苏木精和伊红染色(圆))被光学显微镜检查肾上腺(11]。

2.4.2。免疫组织化学研究

其他部分是安装在poly-L-Lysine涂布幻灯片和用于免疫组织化学染色anti-iNOS(诱导一氧化氮合酶)和anti-Caspase-8根据以前公布的协议(12]。deparaffinized,简单地说,部分患者,为了获取抗原,部分被孵化CaCl胰蛋白酶为0.1%和0.1%₂2 h₂O(氯化钙脱水)在50 mM三羟甲基氨基甲烷(Trisaminomethane)缓冲盐水液pH值7.4 37°C 120分钟。部分被浸泡在无水甲醇含0.3%过氧化氢在室温下30分钟来消除内源性过氧化物酶活性。被孵化的部分有1.5%没有免疫山羊血清在室温下30分钟,然后用稀释伊诺孵化和稀释Caspase-8(1: 500)为30分钟,洗了三次磷酸缓冲盐(PBS)。此后,部分被孵化与生物素化的山羊anti-mouse Ig血清60分钟。用PBS洗净后,部分被孵化与抗生物素蛋白生物素过氧化物酶复合物。过氧化物酶绑定的网站使用显色3发现,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride衬底(涂)。组织部分与苏木精复染色(12]。

组织部分(肾上腺)检查和图像数字化使用了硬件组成的高分辨率彩色数码相机安装在一个奥林巴斯显微镜(奥林巴斯BX51、东京、日本)和连接到计算机,然后使用adobe Photoshop处理。

2.4.3。电子显微镜检查

组织被放置在2.7%戊二醛- 0.1毫升磷酸盐缓冲溶液连续2小时然后涌入4相同的固定剂0.15毫升浴磷酸盐缓冲剂(4°C) 1小时。样本后缀2%锇酸- 0.15毫升磷酸盐缓冲溶液为1小时(4°C),和4次淹没在0.15毫升磷酸盐缓冲溶液为15分钟。样本丙酮脱水和嵌入polyesteric树脂、聚合60°C(1 72小时(Semithin部分μ米)与甲苯胺蓝染色)。超薄部分都用超微切片机和双对比与醋酸双氧铀及柠檬酸铅的解决方案(13),检查JEOL电子显微镜(jem - 100 cxii)配备了照相机。

2.5。生化研究

在实验的最后,静脉血样撤出retroorbital丛使用毛细管吸管和包含5000年我在肝素化管收集。U /毫升肝素钠和离心机在3000转每分钟(转)15分钟。血浆分离和储存在−20°C,直到需要。每个样本被用来评估以下级别:(我)皮质醇水平:皮质醇ELISA试剂盒获得antibodies-online GmbH是一家公司,埃及,根据“埃雷罗等。14)”。测量单位是nmol / L。(2)脱氢表雄酮(硫酸脱氢表雄酮)水平:ELISA试剂盒从GenWay获得生物科技公司,埃及,根据“Grimby-Ekman et al。15]。“测量单位是微克/毫升。(3)谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)水平:从Biodiagnostic公司包了,埃及,比色法(16]。计量单位是富贵墟/毫升。(iv)硫氧还蛋白还原酶(TR)水平:从Biodiagnostic公司包了,埃及,比色法(17]。计量单位是富贵墟/毫升。

老鼠划痕后,部分肾上腺被切割和固定在10%福尔马林和2.7%戊二醛组织学、免疫组织化学及超微结构的研究。剩下的肾上腺被分成两部分。第一部分在液态氮冷冻,储存在−80°C到氧化酶和TR mRNA表达通过rt - pcr分析。第二部分是用于生化分析的丙二醛(MDA)。MDA工具包的获得Biodiagnostic公司,埃及,其估计的方法是根据“Ohkawa et al。18]。“测量单位μ摩尔/ mg湿纸巾。

(我)氧化酶和TR mRNA表达量化逆转录(RT)聚合酶链反应(PCR)。总RNA从均质肾上腺纯化样品使用Ribozol RNA提取试剂(美国梭伦Amresco)后,制造商的指示。的纯度和完整性的总RNA是由分光光度法和凝胶电泳。逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)和试剂盒进行一步法rt - pcr试剂盒(试剂盒、德国)按照制造商的指示;放大了在热循环(丙烯;Techne有限公司,英国Duxford)。

引物,扩增子大小和退火温度的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX),硫氧还蛋白还原酶,B-actin氧化酶(内部控制),和18 s (TR)的内部控制是在桌子上1。rt - pcr条件为:(一)逆转录,30分钟,50°C。(b)初始PCR激活步骤中,15分钟,95°C。(c)的3步骑自行车30周期,每个周期组成的变性为30秒94°c随后退火温度为30秒如表1和扩展为1分钟72°C。rt - pcr产品2%琼脂糖凝胶上分离,用溴化乙锭染色(19,20.]。PCR产品带的强度量化使用凝胶文档系统软件(德国Biometra GmbH)。

2.6。统计分析

值表示为平均值±标准偏差(SD)。数据分析通过使用SPSS为windows(版本10.0)。的意义差异计算通过使用单向方差分析测试。 被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。组织学研究的结果

图1显示肾上腺组织我成立两部分,肾上腺皮质和肾上腺髓质。大脑皮层显示三个区域,球状带(ZG),束状带(ZF)和网状带(ZR)(图1(a))。ZG层形成椭圆形或圆形的细胞集群深深细胞核染色(图1(b))。束状带细胞(ZF)被安排在直声带毛细血管隔开。一些细胞大而多面苍白有液泡的细胞质。其他人似乎没那么有液泡的嗜酸性胞浆和水泡圆核(图1(c))。细胞ZR型小而深染色,形成不规则的绳索和集群,由毛细血管。肾上腺髓质在中心。细胞被圆形的形状,而嗜碱性的食品,安排在集群(图1(d))。

考试的第二部分的肾上腺皮质组织透露ZG的正常结构和ZF(图2(a))。大部分ZG和ZF细胞出现膨胀和析稀。他们的细胞核固缩的。一些细胞和致密的核(图萎缩2(b))。ZG的毛细血管,ZF, ZR明显拥挤(数字2(b)和2(c))。相同的形态变化观察到在第三组,在组II(数字3(一),3(b)3(c))。检查部分第四组显示大部分的形态变化观察到在第二和第三组改善。许多ZF细胞或多或少类似于对照组。仍然有一些ZF细胞的萎缩hyperacidophilic细胞质和细胞核固缩的(图4(一))。许多拥挤的毛细血管被观察到专门的ZR(图4 (b))。有趣的是许多细胞的有丝分裂数据观察ZR(图4 (c))

免疫组织化学染色对伊诺显示,对照组显示消极的部分表达式以及肾上腺皮质的长度,包括ZG ZF和ZR(数字5(一个)和5 (b))。高积极表达注意到细胞的细胞质的区组II(肾上腺皮质的人物5 (c)和5 (d))。经过一个星期的撤军,第三组,表达高ZG和ZF(图5 (e)在ZR温和的表情),而注意到(图5 (f))。在第四组,观察微弱表达ZG在细胞质中,ZF和ZR型细胞(数字5 (g)和5 (h))。

的caspase-8疣状是负对照组在肾上腺皮质(数字6(一)和6 (b))。密度表达式是发现在几乎所有球状带,下方,网状带细胞细胞质(数字6 (c)和6 (d))。在第三组,细胞的表达温和ZG和ZF(图6 (e)),而细胞ZR型显示微弱的细胞质表达(图6 (f))。第四组的部分显示immunopositive细胞分散在ZF(图6 (g)),而ZG和ZF细胞出现负(图6 (h))。

电子显微镜检查结果(EM)显示,控制鼠的肾上腺皮质球状带细胞显示(ZG)和大量的线粒体,自由核糖体,脂滴。脂滴被视为电子朗讯有明显界限。细胞核是球形或不规则与外围异染色质和常染色质的(图7)。

ZG细胞在第二组中显示大量的退化与破坏嵴线粒体,SER扩张池,脂滴。细胞核不规则轮廓,萎缩与核被膜(图的细胞核周围的空间扩大8)。

曲马多戒断1星期显示一些增强肾上腺皮质在第三组显示ZG细胞常染色质的细胞核不规则轮廓和周围的异染色质团时,脂滴明显增加,与完整的线粒体嵴或多或少的控制。一些细胞显示,脂滴的模糊界限;扩大细胞核周围的空间和大液泡也观察(图9)。

而2周显示曲马多撤军更增强肾上腺皮质的第四组ZG细胞与周围的异染色质团时,常染色质的核许多正常的线粒体与完整的嵴和降低脂滴而第三组(图10)。

通过EM,束状带细胞群我给大量的脂质滴,很多水泡的线粒体嵴,光滑型内质网,常染色质的核外围的异染色质团(图11)。

束状带细胞组II显示与电子致密核心变量大小的空泡,线粒体与摧毁嵴,许多脂滴没有明显的轮廓,和一个萎缩浓染的细胞核不规则的轮廓。的脂质滴相互融合,成为支流。其他细胞有不规则的核扩张细胞核周围的空间和大量扩张的光滑型内质网(图12)。

下方细胞第三组包含大量的完整的线粒体和脂滴。但有些脂滴仍汇合的,没有显示出明显的轮廓。一些细胞圆形常染色质的核和其他人有不规则的核和扩张核被膜(图13)。

下方第四组的细胞显示大多数细胞常染色质的核与常规的轮廓,大量的线粒体与完整的嵴,大量脂滴。一些细胞汇合的脂质滴,稀缺的细胞核萎缩和深染(图14)。

3.2。生化研究的结果

皮质醇和DHEAS水平明显下降组II, III和IV组i也相比,都有显著增加荷尔蒙水平相比,第三组和第四组II。两周的撤军曲马多组第四导致显著增加之前的激素水平比第三组(曲马多的一周撤军),但仍没有达到其水平在对照组(表中2)。

表3和4显示有显著减少氧化酶和TR,分别在第二组中,III, IV组相比,即抗氧化剂在第三和第四组相比显著增加组II。显著增加抗氧化剂水平被发现在第四组第三组相比,但仍低于正常水平。

肾上腺MDA显著增加团体透露II, III, IV组相比i MDA水平明显降低组III和IV组II。显著降低MDA水平被发现在第四组第三组相比,但仍没有达到对照组(表的水平5)。

表6和7显示显著降低强度的PCR产品群氧化酶和TR在第二组中,III, IV组相比我乐队的强度是第三和第四组显著增加,但在第四组时相比,第二组。rt - pcr产物的琼脂糖凝胶电泳显示氧化酶和TR基因的表达增加肾上腺曲马朵戒断组(组III和IV)超过曲马多组(第二组)(数据15和16)。

4所示。讨论

曲马多是synthetic-4-phenyl-piperidine可待因的模拟。这是一个中枢镇痛与阿片受体亲和力较低。它用于治疗中度到重度的疼痛通过结合mu-opioid受体激动剂和去甲肾上腺素和5 -羟色胺再摄取抑制效果。曲马多的M1代谢物由liver-O-demethylation显示了父母对阿片受体亲和力高于药物(21]。

曲马多滥用大幅增加在中东地区特别是在伊朗和埃及。男性的患病率较高(77.2%)。在中学的男生中,0.84%滥用鸦片。最后一个全国性调查报告指出,9.6%的埃及人用药物至少一次在他们的生活22]。在其他的研究中,大学生与先前的吸烟史和消费容易上瘾阿片类药物的滥用曲马多。据说,几乎90%的曲马多急性毒性,慢性7.9%,2.1%是急性的慢性过量(23]。

康纳et al。24]说的推荐剂量曲马多是50 - 100毫克/ 4 - 6小时,最大每日总剂量不应超过400毫克二级高剂量的增加副作用的风险。LD的₅₀曲马多的小鼠和大鼠被确定为350毫克/公斤体重和228毫克/公斤体重,分别口服剂量。此外,一个LD₅₀200毫克/公斤体重和286毫克/公斤体重已经在小鼠和大鼠,分别后皮下剂量(8]。

本研究曲马多在这是给定的剂量80毫克/公斤体重口服(35%的口腔LD₅₀曲马多的老鼠)根据研究“El-Gaafarawi (9]。“严重病理变化观察肾上腺的老鼠,虽然没有一个老鼠实验期间去世。

Opioid-induced内分泌病是最常见的一种,然而,至少经常诊断长期阿片类药物治疗的后果。许多研究评估的影响长期使用曲马多在许多器官,例如,肝、肾、睾丸、卵巢、心,和甲状腺。由于数量有限的文献的存在,研究曲马多在肾上腺的病理效应,作者用完了这工作说明曲马多的戏剧性的组织病理学影响肾上腺。

本研究证明,长期使用曲马多诱导在肾上腺病变的形式失去正常结构的ZF和ZG。细胞变得膨胀,有液泡的致密的核和拥挤的毛细血管,光显微镜检查。免疫组织化学染色对伊诺和Caspase-8显示阳性表达细胞的细胞质的高区tramadol-treated组大鼠肾上腺皮质的。

超微结构检查肾上腺的目前的研究显示许多退化与破坏嵴线粒体和不规则的轮廓ZG细胞的细胞核。ZF显示多个空泡细胞萎缩细胞核浓染的不规则的轮廓,和光滑型内质网扩张概要文件。

病理变化和氧化损伤引起的长期使用曲马多可以用其来解释能力生成氧自由基能攻击细胞膜,导致不稳定和崩溃的细胞膜脂质过氧化作用的结果(25]。

慢性曲马多使用一周撤军后,相同的形态变化观察组第三组II的光显微镜检查。通过免疫组化染色,伊诺的表达和Caspase-8高ZG ZF,同时,在锆、温和的表情被注意到。超微结构检查肾上腺透露了一些增强ZG和ZF细胞和外观的常染色质的细胞核不规则轮廓和周围的异染色质团。

两周撤军曲马多导致更多改善ZG形态学变化,ZF, ZR细胞或多或少与对照组相似的光和电子显微镜检查。微弱表达伊诺和细胞质中的Caspase-8 ZG ZF, ZR细胞被免疫组织化学研究。

据我们所知,浏览所有可用的搜索引擎后,没有单一的研究,可以确定生化氧化应激引起的慢性曲马多使用及其影响肾上腺撤军和曲马多的影响在某些抗氧化酶的基因表达;因此,本研究的目的是确定的生物化学变化(激素、氧化应激和基因表达),可以引起慢性使用曲马多和撤军。

慢性曲马多用于研究导致肾上腺MDA水平显著增加,除了抗氧化酶水平明显下降(氧化酶和TR)的血液。曲马多撤出导致显著降低MDA的水平,显著增加的水平高于酶2周后撤离超过一周曲马多撤军。这些结果证实了研究氧化酶的基因表达和TR在肾上腺。rt - pcr产物的琼脂糖凝胶电泳显示氧化酶和TR基因的表达增加肾上腺曲马朵戒断组(组III和IV)超过曲马多组(组2)。

Ghoneim et al。26]和Nna Osim [27]研究了氧化应激标记期间和之后撤回曲马多。他们的研究显示,慢性曲马多使用MDA水平的增加,过氧化氢酶水平降低,超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶在睾丸和大脑组织和改善这些标记后发生曲马朵撤军。

荷尔蒙的变化引起的慢性曲马多用于这项研究显示显著降低皮质醇和DHEAS水平曲马多组和曲马多撤军后显著增加他们的水平(曲马多2周后退出)。这些结果应对所讨论的其他研究结果(28- - - - - -31日]。他们的研究显示,长期使用外源性阿片类药物被发现ACTH和皮质醇水平降低。此外,他们的研究显示,DHEAS水平,肾上腺雄激素的前兆,也减少了在慢性阿片类用户。

opioid-induced肾上腺机能不全的知识是有限的,缺乏大规模研究。阿片类药物可能会降低肾上腺应激反应,导致肾上腺机能不全的症状在急性疾病或压力。主要重要机制opioid-induced内分泌病是阿片类药物的大型戏剧效果-肾上腺轴(HPA)。抑制HPA的患者长期使用吗啡所示,慢性皮肤芬太尼、美沙酮、曲马多(32,33]。

此外,患者μ受体多态性A118G将有更多的阿片内分泌病和阿片类药物抑制神经元释放促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)这将解释阿片类药物诱发肾上腺机能不全在这些人34,35]。

5。结论和建议

最后,得出结论:长期使用曲马多对身体不同器官能导致许多有害的影响。从当前的研究中,它被批准,长期使用肾上腺机能不全引起的曲马多经病理和生化和曲马多使用的中断会导致降低其有害影响不仅在肾上腺也在不同的身体器官。

所以,建议来解决公共协会和政府机构对曲马多的危害提高意识。举办研讨会筹备和高中的学生应该获得知识曲马多的不良影响减少成瘾。此外,建议添加对曲马多的药物筛选所有形式的基本毒性筛选和制定严格的制裁对司机和工人与一个积极的测试和药店出售曲马多没有医疗处方。最后,我们的研究结果强调需要未来的研究可以解释肾上腺机能不全的其他可能的机制引起的慢性曲马多的使用。

的利益冲突

之间没有利益冲突的任何作者关于这篇文章的发表。

作者的贡献

Shereen Abdelhakim负责的想法写所需的研究和数据收集;奥萨马a哈桑负责收集所需的引用的研究和写作部分吗;康复Rifaai和Nashwa El-Tahawy负责组织的组织学检查;夏f·艾哈迈德和Nagwa m . Zenhom负责组织和血液样本的生化分析。

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