肝细胞CYP2B6可以表达在细胞培养系统施加生理水平剪切:ADME测试的影响

文摘

细胞色素2 b6 (CYP2B6)大量临床对发病率和死亡率的影响及其对药物代谢的影响应该是肝毒性筛选的一部分。CYP2B6影响的例子包括连杆在环磷酰胺治疗死亡率和角色在决定肝毒性在依法韦伦治疗艾滋病毒感染和中枢神经系统毒性。CYP2B6是许多常见药物代谢的关键从阿片类药物抗抑郁药、麻醉药、抗惊厥药物。但是CYP2B6已经极难表达在细胞培养中,因此,它在很大程度上印在临床前毒性研究。它已经表明,CYP2B6表达式可以支持长时间使用悬浮培养技术,发挥生理水平剪切。新的理解CYP2B6已经确定了五个临床显著的遗传多态性,在很多人群发病率高,传达一个大动态范围的活动。我们建议使用文化设备施加生理剪切水平,CYP2B6依赖药物测试,包括多态性和应用程序的特定抑制剂的定义,应该是一个标准的一部分,临床前吸收,分布,代谢,排泄(ADME)测试。

1。介绍

CYP2B6在药物代谢的重要性越来越明显(1,2]。CYP2B6代谢2% -10%的临床使用的药物包括抗肿瘤的药物如环磷酰胺和异环磷酰胺,麻醉剂异丙酚、氯胺酮等,合成阿片类药物如哌替啶、美沙酮和抗逆转录病毒药物奈韦拉平和依法韦伦等(1- - - - - -3]。CYP2B高度多态(4),但直到最近,困难在维护其表达培养肝细胞研究CYP2B多态性的影响有限,抑制剂,和抗病诱导剂,对动态范围的活动(1,2,5,6]。很难保持CYP2B表达式也意味着这CYP临床上重要的作用在很大程度上是不解决当前肝毒性测试。在本文中,我们将讨论的挑战培养肝细胞,细胞内剪应力的作用,剪切应力引入文化系统和策略以促进CY2B的表达。

2。实验模型缺乏生理应激细胞培养系统

目前的体外药物毒性方法的可靠性取决于使用的肝细胞类型和它们的条件培养(7)(表1)。主要的人类肝细胞是FDA认可的黄金标准。有几种肝细胞细胞系,但所有表达低数量的第一和/或第二阶段酶比新鲜的肝细胞。并排比较,主要人类肝细胞检测到8 9肝毒素,而肝细胞系HepG2 HepaRG和致癌基因转染Upcyte发现只有6行,3和3分别为9肝毒素(8]。代的肝细胞的干细胞显示承诺(9),但胚胎干细胞有限的可用性。诱导多能干细胞与残余组织倾向于显示表观遗传记忆的表达基因的组织起源,以及一期和二期的低表达酶,并倾向于表达胎儿基因(7]。

文化条件对肝细胞分化产生重大影响,因此体内模型的保真度代表肝细胞体内。当前默认的行业标准是文化人类肝细胞作为组织培养的二维单层板在静态条件下(10]。然而,当看到一个硬塑料衬底的组织文化,是否单独或涂有细胞外蛋白质如胶原蛋白、肝细胞去分化和小时天内失去效用5,11,12]。贝尔等人发现457个蛋白质,代表肝细胞蛋白质组的13.9%,显著改变的第一个24小时内肝细胞在2 d镀单层膜(13]。

夹层之间的肝细胞层稠化细胞外蛋白质支持细胞极性,胆汁淤积,形成和转运体的表达蛋白质长达两周(7,14]。然而,表达CYP2C8 CYP2C19、CYP2D6随时间,作为筛查工具,使用时肝细胞夹在凝胶只有50 - 60%确定肝毒素(真阳性率15]。此外,可变性之间大量的细胞外蛋白质额外的变化归纳为化验(7]。微型图象cocultures,周围肝细胞的小鼠成纤维细胞作为细胞,显示更好的敏感性检测肝毒素,但涉及细胞从两种类型的困难7]。各种其他organ-on-a-chip平台显示承诺organ-organ交互研究但既不简单,廉价,也可伸缩的肝毒性的常规筛查(7]。此外,这些方法支持不足的表达,如果有的话,CYP2B [7]。

在3 d是一个球状体改善肝细胞2 d文化(7,13]。贝尔等人发现,在新的肝细胞相比,358年的表达有显著改变蛋白质在2 d条件下相比,只有132蛋白质三维球状体(13]。可以生成三维球状体在生物反应器中,在悬滴,或超低依从性塑料碗。

生物反应器搅拌肝细胞悬浮在媒体直到他们总16]。生物反应器非常适合处理细胞体积的几十到几百毫升,但不切实际的筛选试验,个别样品需要保持在100 - 1000毫升,以保持低成本,允许扩展高吞吐量的系统。此外,生物反应器搅拌器产生大量的剪切应力和机械损伤的肝细胞的影响。

悬挂的球状体悬滴低量的解决问题和避免细胞分裂,但是这种方法排除了试剂添加和媒体补充在文化,没有被广泛验证,有限的传播由于使用专有的材料(7]。

主要人类肝细胞self-aggregate成球状体超低粘附细胞培养板(5),这种方法既经济又可伸缩。球状体生成的这种方式可以保持在无血清媒体和保持其形态、生存能力和hepatocyte-specific函数连续5周(5,13]。CYP1A2活性、CYP2D6和CYP3A4保持稳定在这个区间[5]。肝细胞肝毒素的球状体的敏感性增加五周,呈现他们在临床相关敏感毒素浓度(13]。3 d肝细胞球状体可以与nonparenchymal cocultured细胞和可以证明肝胆汁郁积等病态,脂肪变性,病毒性肝炎(13]。尽管在很多方面有所改善,3 d在这种方式生成的球状体仍有局限性:大骨料有坏死核心,CYP2C8活动下降,CYP2C9的增加,和CYP2B6尚未确定的活动5]。

3所示。策略引入生理水平剪应力文化

每个文化的方法上面描述了一个关键参数,使细胞的能力生理剪切应力水平(表1)。血流动力学流是有据可查改善大鼠肝细胞形态、功能和代谢活动在体外(17- - - - - -19]。肝脏特异性功能,如白蛋白合成、尿素分泌,基线的表达和诱导期和二期酶活性以及代谢能力选择药物,在3 d生物反应器保存更长时间,提供剪切应力,而单层系统没有剪切应力[19]。流体剪切力也有大量的生化和肾细胞超微结构的影响20.- - - - - -24]。剪切应力重新进入血流动力学流系统维护某些cyp的表达式(17,25]。在鼠肝细胞单层膜暴露在0.6达因/厘米²剪切应力的灌注Transwell设备,CYP1A1 54-fold增加,CYP1A2增加64倍,CYP2B1增加了15倍,而且,最重要的是论文的综述,CYP2B2相对静态的文化(增加3倍17]。然而,剪切必须保持在体内水平因为可以逆转为应用剪切的影响增加了(26]。培养肾细胞也应对剪切应力和剪切力的影响在很大程度上取决于密切近似体内的水平(24,27]。

灌注生理剪切可以重新使用Transwells [17),中空纤维文化设备(28),和3 d细胞生物打印到perfusable芯片(14,29日]。然而,这些方法可伸缩性和有限可能需要人工细胞外基质和生长因子,引入模糊意想不到的效果。一个很好的方法,还有待利用制药行业是使用悬浮培养设备称为旋转血管壁(30.,31日]。旋转血管壁的垂直旋转圆柱形液体没有顶部空间,没有空气。血管壁压力旋转可以通过维护交付在生理水平层流条件(30.,31日]。旋转血管壁可以旋转的速度交付达因/厘米~ 0.4到0.12²剪切应力的值接近体内的水平(17,18,30.- - - - - -33]。

4所示。剪切应力的作用在维持细胞分化包括CYP2B

悬挂文化旋转壁血管恢复许多结构和功能元素发现体内(27,31日,34,35]。人肾近端小管细胞悬浮培养表达内吞作用的食腐动物蛋白质cubilin megalin和相关高度差异化的膜泡运输系统未见的2 d的文化。他们也恢复的微绒毛和紧密连接在二维文化34,35]。

只有肝细胞培养系统恢复的生理水平剪切已经证明了保持表达CYP2B6 [5,28]。旋转血管壁已被证明的维持肝细胞CYP2B6表达式至少35天(5]。如图1,肝细胞在血管壁旋转培养球状体生理切应力条件下显示一个初始蘸CYP2B6活动第一周,其次是稳定和提高表达之后(5]。同样,在原发性肝细胞灌注在小型中空纤维文化引入剪切设备,CYP2B6水平部分维护(28]。在这两种情况下,肝细胞有保存完好的结构和功能特性,包括广泛的药物的代谢。

维护CYP2B6文化活动在肝细胞细胞暴露于生理水平剪切谓词紧急扩张测试参数的范围。新研究应该解决特定CYP2B6抑制剂和测试安非他酮羟基化而不是pentoxyresorufin-O-dealkylase活动,因为这是CYP2B量化的新状态的艺术活动。

5。实用的建议:在ADME CYP2B6表达和多态性

越来越明显的是,许多多态性CYP2B6都是比较常见的,有一个实质性影响的药物代谢率(3,6,36,37]。因此,在筛查CYP2B6-mediated药物代谢,它不仅是重要的文档表达也定义单体型被研究。

CYP2B6多态性是不寻常的在几个方面。初步分析CYP2B6多态性的外显子编码区识别九单基地突变;五是产生氨基酸的变化,四是沉默突变(1,38]。确定的数量继续增加CYP2B6单体型。CYP等位基因的主页(http://www.cypalleles.ki.se/cyp2b6.htm)目前列出了58个单、28个等位基因和多个snp单待定。

许多CYP2B6多态性是异常高的频率(3,6,36,37但通常race-dependent [4,39]。,例如,C64T G516T C777A, A785G,和C1459T突变被发现在5.3%,28.6%,0.5%,32.6%,和14.0%,分别为215白人患者。在172土耳其病人的一项研究中,三个单核苷酸多态性频率28% G516T, C1459CT A785G为33%,12%。这类似于在欧洲人发现的频率,但显著不同,亚洲人口报告(2,36]。这些频率大大高于其他CYP450基因多态性,CYP2D6,例如,可怜的代谢表型在5 - 10%的白种人和亚洲人只有1 - 2%。

CYP2B6多态性分析应该执行与其他cyp的多态性,分析n -乙酰转移酶(NAT1和NAT2), thiopurine-5-methyltransferase(硫代嘌呤甲基转移酶),uridine-5二磷酸葡糖醛酸基转移酶(UDP-glucuronyl转移酶),二期的酶和转运蛋白。一些商业服务提供对肝细胞药物代谢测试与野生型和选定的CYP450酶的遗传多态性。这种方法需要应用到CYP2B6分析。多重PCR方法可以测定所有目前已知的多态性,但测序成本的崩溃让平行的成本效益分析两个已知的和所有一期和二期的新等位基因酶和转运蛋白有关。

悬浮培养的旋转血管壁形式概括许多药物筛选和疾病建模所需的响应。最初昂贵的和有限的大量文化在开发期间超过三十年前,新材料、加法制造,注塑生产技术应该允许生产体积小血管适合高通量肝毒性测试四个数量级低于原设备(27,31日,34,35]。鉴于这种戏剧性的变化在可行性,旋转墙悬浮培养的肝细胞更值得深入探索和定义,以便它可以实现药物毒性筛选的高通量分析。

6。结论

CYP2B6拥有丰富的临床重要性。CYP2B6频繁的多态性,从而诱导动态范围的活动,直接导致肝毒性和死亡率在常用药物管理局(40- - - - - -42]。新的悬浮培养方法,介绍生理水平剪切现在可以保持CYP2B6体外表达(5,33]。肝细胞表达的已知多态性CYP2B6临床代谢测试应该是一个标准的一部分。理解和分析细胞色素P450多态性,尤其是CYP2B6,将提高药品安全当我们发展个性化医疗(43]。

信息披露

内容不代表视图的退伍军人事务部或美利坚合众国。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

引用

1. t·朗k . Klein j·菲舍尔et al .,“广泛的遗传多态性在人类CYP2B6基因表达和功能与影响在人类肝脏,”遗传药理学,11卷,不。5,399 - 415年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. 王h和l·m·汤普金斯“CYP2B6:洞察历史忽略细胞色素P450同工酶,”目前的药物代谢,9卷,不。7,598 - 610年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. w·d·Hedrich h·e·哈桑,h . Wang”见解CYP2B6-mediated药物之间的相互作用,”Pharmaceutica学报B》第六卷,没有。5,413 - 425年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. 美国m .藏克莱恩k, t . Saussele j . Blievernicht m·h·霍夫曼和m . Schwab,“多态CYP2B6:分子机制和新兴的临床意义,”药物基因组学,8卷,不。7,743 - 759年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. l·a·布朗,l . m . Arterburn a·p·米勒et al .,“维护肝脏功能在鼠肝细胞培养的球状体旋转血管壁,在“体外细胞与发育生物学,动物,39卷,不。1,p。13日,2003。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. S.-F。周,j。刘,b . Chowbay“人类细胞色素P450酶的多态性及其临床的影响,“药物代谢的评论第41卷。。2、89 - 295年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. v . m . Lauschke d·f·g·亨德里克•c . c·贝尔·t·b·安德森和m . Ingelman-Sundberg“小说三维培养系统研究人类的肝功能和评估药物和药物肝毒性的候选人,”化学毒物学研究卷,29号12日,第1955 - 1936页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. r . l . Sison-Young v . m . Lauschke e .约翰et al .,“多中心评估的单细胞模型一致的标准措施的细胞健康预测急性肝中毒,”档案的毒理学,卷91,不。3、1385 - 1400年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. 国家研究委员会,毒性测试在21世纪:愿景和战略美国国家科学院出版社,洗,2007。
10. A . Guillouzo A . Corlu c . Aninat d . Glaise f·莱尔和c . Guguen-Guillouzo“人类肝癌HepaRG细胞:高度分化的外源性物质对肝脏代谢和毒性的研究模型,”Chemico-Biological交互,卷168,不。1,第73 - 66页,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. a·p·李,“人类托克斯ADME /药物筛选属性在药物发现,“药物发现今天》第六卷,没有。7,357 - 366年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. a·p·李,“人类肝细胞:隔离,低温贮藏和应用在药物开发中,“Chemico-Biological交互,卷168,不。1、16至29页。2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. c·c·贝尔·d·f·g .•s·m·l·莫罗et al .,”表征的主要人类肝细胞球状体作为药物引起的肝损伤的模型系统,肝脏功能和疾病,”科学报告》第六卷,25187页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. r . Kostadinova f . Boess d·阿普尔盖特et al .,“一个长期的肝脏三维培养系统来提高预测的临床相关的药物引起的肝毒性,”毒理学和药理学应用,卷268,不。1,硕士论文,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. j。j, p . v . Henstock m·c·邓恩,a . r .史密斯,j . r .证据和d·格拉夫,“临床药物引起的肝损伤,细胞成像预测”毒物学的科学,卷105,不。1,第105 - 97页,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. r . m . Tostoes s b·雷特·m·塞拉et al .,“人类肝细胞球状体扩展灌注生物反应器文化反复给药药物测试,”肝脏病学,55卷,不。4、1227 - 1236年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. a, m . b .小说t g -迪尔岭et al .,“血流动力学流改善大鼠肝细胞形态、功能和代谢活动体外,”美国生理学,细胞生理学杂志》上,卷304,不。11日,C1053-C1063, 2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. 崔k . w . p .刘德m·e·安徒生r . s . Thomas h . j . Clewell和e . l . Lecluyse”发展的人类肝脏的三维动态流模型及其应用的预测代谢7-ethoxycoumarin结关,”组织工程- C部分:方法,20卷,不。8,641 - 651年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. j·p·米兰达,s b·雷特Muller-Vieira, a·罗德里格斯·m·j·t·Carrondo p . m .阿尔维斯,“对一个扩展功能的肝细胞在体外文化。”组织工程C:方法,15卷,不。2、157 - 167年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. m . Essig g·弗里德兰德,“管状剪切应力和肾近端小管细胞的表型,”美国肾脏病学会杂志》上,14卷,S33-S35, 2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. y段:后藤问:燕et al .,“Shear-induced重组肾近端小管细胞肌动蛋白细胞骨架和顶端交叉的复合物,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷105,不。32岁,11418 - 11423年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. 段y, z Du燕,a·m·温斯坦s Weinbaum和t . Wang”Mechanosensory功能肾近端小管的微绒毛,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷101,不。35岁,13068 - 13073年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. d . Maggiorani r . Dissard m . Belloy et al .,“剪切压力诱导改变人类肾小管的上皮组织细胞,”《公共科学图书馆•综合》,10卷,不。7篇文章ID e0131416 21, 2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. k . a . Homan d . b . Kolesky m·a·Skylar-Scott et al .,“生物打印的3 d肾近端小管曲Perfusable芯片,”科学报告》第六卷,34845页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. h . Rashidi s Alhaque d . Szkolnicka o·弗林特市和特区干草,“流体剪切应力调制hepatocyte-like细胞功能”,档案的毒理学,卷90,不。7,1757 - 1761年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. j·m·皮德森y垫片,诉汉斯et al .,“流体动力学建模支持基于流的代谢研究肝细胞培养系统的发展,“在生物工程和生物技术前沿卷,4 p。72年,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. n . l . Cowger e·贝奈斯·l·艾伦和t·g·哈蒙德,“肾细胞蛋白质标记的表达依赖于初始机械文化条件,”应用生理学杂志,卷92,不。2、691 - 700年,2002页。视图:谷歌学术搜索
28. s . a .霍夫曼Muller-Vieira, k . Biemel et al .,“分析药物代谢活动的小型肝细胞生物反应器用于药理研究,“生物技术和生物工程,卷109,不。12日,第3181 - 3172页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. s·m·王,j·w·希金斯,c·r·尼诺et al .,“3 d的概括关键方面肾近端小管组织生理,使肾毒性测试,”前沿生理学,8卷,p。123年,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. d . a .狼和r·p·施瓦兹”分析gravity-induced NASA-designed旋转的粒子运动和液体灌注流量zero-head-space组织培养容器,”技术代表、美国国家航空航天局,1991年。视图:谷歌学术搜索
31. t·g·哈蒙德和j·m·哈蒙德”优化的悬浮培养:旋转壁式船”,美国Physiology-Renal生理学杂志》上,卷281,不。1,F12-F25, 2001页。视图:谷歌学术搜索
32. t . Niiya m .村上t青木:井,y清水,和m . Kusano”直接入口压力的增加,反映出正弦剪切应力,诱导部分肝切除术后肝再生,”Hepato-Biliary-Pancreatic外科杂志》》第六卷,没有。3、275 - 280年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. t·哈蒙德,p·艾伦和h . Birdsall”有太空技术与临床前药物毒性测试解决问题?”医药研究,33卷,不。7,1545 - 1551年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. t·g·哈蒙德e·贝奈斯k c O ' reilly et al .,“机械培养条件影响基因表达:gravity-induced变化对航天飞机,“生理基因组学,3卷,不。3、163 - 173年,2000页。视图:谷歌学术搜索
35. j . h . Kaysen w·c·坎贝尔,r . r .北京et al .,“选择新创基因和蛋白表达在肾上皮细胞培养在旋转血管壁切应力的依赖,”膜生物学》杂志上,卷168,不。1,第89 - 77页,1999。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. c . Sukasem m . Chamnanphon: Koomdee et al .,“高血浆依法韦伦浓度和CYP2B6多态性在泰国hiv - 1感染,”药物代谢与药物动力学,28卷,不。5,391 - 397年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
37. c . Sukasem t·r·他p Prapaithong et al .,“遗传标记与依法韦伦等离子体浓度有关的CYP2B6泰国在hiv - 1感染的成年人,“英国临床药理学杂志》上,卷74,不。6,1005 - 1012年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. m . rohrbach说道,a . Kirchhof g . Geisslinger, j . Lotsch“焦磷酸测序™的筛查基因多态性在细胞色素P450 2 b6潜在的临床意义,”药物基因组学,7卷,不。7,995 - 1002年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. n . Yuce-Artun g .高丝,h . s . Suzen”等位基因和基因型频率的CYP2B6土耳其人口,”分子生物学报告第41卷。。6,3891 - 3896年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. n . Yuce-Artun b . Baskak e . t . Ozel-Kizil et al .,“CYP2B6和CYP2C19多态性对舍曲林新陈代谢的影响在抑郁症患者中,“国际临床药学杂志》上,38卷,不。2、388 - 394年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. m . Martignoni通用Groothuis, r d。坎特,“物种差异老鼠,鼠,狗,猴子和人类CYP-mediated药物代谢,抑制和诱导,“专家意见在药物代谢和毒理学,卷2,不。6,875 - 894年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. c . Sukasem和s . Sungkanuparph”CYP2B6测试和依法韦伦帮助艾滋病患者接受治疗吗?”药物基因组学,14卷,不。9日,第1001 - 999页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
43. S.-F。周,y . m . Di,大肠陈et al .,“个性化医疗临床药物基因学和潜在应用,”目前的药物代谢,9卷,不。8,738 - 784年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2017蒂莫西·g·哈蒙德和冬青h . Birdsall。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。