文摘

在体外研究表明,从山竹果提取物(藤黄属植物mangostanaLinn)作为抗氧化剂和cytoprotective代理对抗氧化损伤。叫倒捻子素的保护作用主要的氧杂蒽酮的山竹果的果皮,在细胞的帕金森病(PD)模型,并没有被调查。本研究旨在探讨alpha-mangostin能否保护从MPP SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞⁺全身的细胞凋亡。在MPP alpha-mangostin的影响⁺全身的细胞死亡和细胞生存能力评估分析,核DNA染色形态学、流式细胞术对凋亡细胞和活性氧(ROS)生产、定量实时PCR p53的表达,伯灵顿,和bcl - 2,免疫印迹分析caspase-3分开。伴随治疗alpha-mangostin减毒MPP的效果⁺对细胞生存和凋亡细胞死亡。Alpha-mangostin减少活性氧引起的MPP形成⁺。伯灵顿/ bcl - 2表达比率和p53的表达显著降低细胞cocultured alpha-mangostin和边际产量⁺。cotreated细胞明显下降激活caspase-3与MPP相比⁺单独治疗。我们的数据表明,cytoprotection对MPP alpha-mangostin⁺全身的细胞凋亡可能与减少ROS有关生产、调节平衡的职业,凋亡基因(caspase-3激活和抑制。

1。介绍

帕金森病(PD)是一种神经退行性疾病的特点是进步在黑质致密部多巴胺能神经元的变性,导致随后的基底神经节功能电路。PD的分子发病机制被认为是与线粒体功能障碍有关,氧化应激,激活凋亡级联的1]。合成复合1-methyl-4-phenyl-1, 2、3、6-tetrahydropyridine注射(MPTP药物)诱发人类通过其代谢物MPP的永久性震颤麻痹⁺(1-methyl-4-phenylpyridinium) [2,3]。MPP⁺已被证明导致PD-like病理动物和细胞模型中通过选择性和有效抑制线粒体电子传递链的复杂1 (4,5]。MPP⁺全身的神经细胞死亡是由损伤的线粒体膜电位和线粒体渗透性转换孔开放6,7]。海拔的活性氧(ROS)水平也一直参与MPP⁺全身的细胞毒性(8- - - - - -10]。的激活凋亡级联可能在MPP中发挥作用⁺全身的细胞死亡通过改变线粒体膜透性和控制释放细胞色素从线粒体11,12]。通过释放细胞色素Caspase-3激活已被证明与MPP吗⁺全身的细胞凋亡(9,13,14]。一旦激活,caspase-3将诱发核DNA凝聚和分裂,最终,细胞凋亡(15]。

大量的抗氧化剂,如氧杂蒽酮,被证明对脆弱的神经元保护作用在氧化应激条件下(16- - - - - -18]。山竹果的果壳(藤黄属植物mangostanaLinn),热带水果,已被证实能发挥抗氧化作用。水果船体包含各种氧杂蒽酮衍生品包括alpha-mangostin。Alpha-mangostin显示诱导心肌再灌注损伤的保护作用衰减氧化应激(19]。神经活动alpha-mangostin对H₂O₂证实了全身的氧化应激NG108-15神经母细胞瘤细胞(20.]。这个氧杂蒽酮改善iodoacetate-induced小脑颗粒神经元的细胞死亡在初级文化通过减少活性氧的形成(21]。Alpha-mangostin也减弱引起的神经毒性的β-淀粉样蛋白寡聚物在初选SK-N-SH神经母细胞瘤细胞和大鼠大脑皮质神经元(22,23]。alpha-mangostin可能是介导的抗氧化性质的调节对谷胱甘肽过氧化物酶的活性的影响(24]。尽管alpha-mangostin报道具有潜在的神经保护特性,没有足够的信息对其保护作用在帕金森病细胞模型。本研究旨在探讨alpha-mangostin能否保护从MPP SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞⁺全身的细胞凋亡和可能的潜在机制。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

SH-SY5Y人类神经母细胞瘤细胞培养在1:1的混合物杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)和营养混合物火腿heat-inactivated F12培养基,并配以10%胎牛血清的边后卫,丙酮酸钠1毫米,0.1毫米不重要的氨基酸,1.5 g / L碳酸氢钠,青霉素100单位/毫升和100μ克/毫升链霉素。所有的媒体和补充剂是从Gibco购买(盖瑟斯堡,医学博士,美国)。细胞被维持在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂。在这项实验中,细胞亚文化和镀到适当的文化板块。细胞的数量是亚文化评估在相差显微镜下基于台盼蓝染料的排斥。培养细胞是维持2天让坚持的盘子。此后,细胞治疗α倒捻子素(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),边际产量⁺(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),或组合α倒捻子素和MPP⁺根据实验设计。

2.2。测量细胞的生存能力

SH-SY5Y细胞被播种到96孔板的密度8×10³细胞/在200μL介质和孵化37°C下5%的股份有限公司₂在湿润孵化器2天。在暴露于MPP⁺(1000μ米),α倒捻子素(10μ米),或两者的结合为24小时,细胞生存能力是衡量MTT (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2、溴化5-diphenyltetrazolium)比色测定(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。这种方法是基于减少利乐环MTT的线粒体线粒体与NADH脱氢酶活跃,产生一个蓝甲瓒产品,可以测量spectrophotometrically。孵化后,20μL (MTT(5毫克/毫升)被添加到每个好,细胞培养4小时,然后中被删除了,100μL DMSO (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)被添加到每个溶解甲瓒。颜色反应测量与参考在690 nm波长570 nm使用VERSAmax可调标与SoftMax Pro软件(分子器件、桑尼维尔,美国)。

2.3。核DNA染色

SH-SY5Y细胞被播种在盖玻片和4%多聚甲醛固定在0.01 M PBS (pH值7.4)在室温下20分钟,然后用PBS冲洗三次。与PBS洗后,这些细胞被染色1毫克/毫升赫斯特33258年(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在PBS 20分钟在室温下然后再洗。盖玻片被安装在幻灯片DABCO安装介质。赫斯特33258 (bisbenzimide)优先结合三联体腺嘌呤和胸腺嘧啶碱基对的小沟外的双螺旋结构,它允许一个观察凋亡细胞的细胞核的形态学变化。核形态是激光扫描共焦显微镜下检查(奥林巴斯FV1000,奥林巴斯、东京、日本)和激发波长556 nm和发射波长573 nm)。

2.4。流仪检测凋亡细胞

SH-SY5Y细胞被播种到6-well盘子12×10的密度⁴细胞/在2毫升的介质,然后孵化在37°C下5%的股份有限公司₂在湿润孵化器为24小时。在暴露于MPP⁺(1000μ米),α倒捻子素(10μ米),或者MPP的结合⁺(1000μ米)和α倒捻子素(10μ米)24小时,细胞使胰蛋白酶化和离心机在2500 rpm, 4°C 5分钟。颗粒被两次与冷PBS和resuspended浓度1×10⁶细胞/毫升。凋亡细胞被发现使用一个FITC annexin-V /死细胞凋亡工具包(分子探针,尤金,或者美国)。细胞培养与5μL (FITC annexin-V和1μL 100年μg / mL propidium碘(PI)在室温下15分钟。进行了分析与FACSCalibur凋亡细胞流式细胞分析仪(BD生物科学,圣何塞、钙、美国),测量荧光发射在530 nm (FL1)和> 575海里(FL3)。早期凋亡(annexin-V-positive和PI-negative)和晚期凋亡(annexin-V-positive和PI-positive)细胞在细胞死亡包括决定。

2.5。流仪检测细胞内ROS

ROS的产生是由测量荧光强度cell-permeable发出的荧光染料,dihydrorhodamine 123 (DHR123)和dihydroethidium(她),从英杰公司购买(尤金,或者美国)。DHR123是荧光氧化罗丹明- 123细胞内过氧化氢和过氧亚硝基,虽然她被超氧化物阴离子氧化ethidium。SH-SY5Y细胞被播种在6-well板12×10的密度⁴细胞/好,孵化37°C下5%的股份有限公司₂在48小时内的湿润孵化器。在暴露于MPP⁺(1000μ米),α倒捻子素(10μ米)或MPP的结合⁺(1000μ米)和α倒捻子素(10μ米)48小时,细胞被洗两次,汉克斯缓冲盐溶液(哈佛商学院)和使胰蛋白酶化0.25%胰蛋白酶/ EDTA和离心机在2000 rpm 7分钟。孵化15球μM DHR123和10μ米她20分钟37°C在黑暗中。之后,细胞被洗细胞固定在1%多聚甲醛和之前与哈佛商学院的平均荧光强度(MFI)绿色(DHR FL1)或红色(FL2她)荧光测定使用FACSCalibur流式细胞分析仪。

2.6。定量实时聚合酶链反应分析

SH-SY5Y细胞被播种到6-well盘子12×10的密度⁴细胞/好,孵化37°C下5%的股份有限公司₂在湿润孵化器24 h。在暴露于MPP⁺(1000μ米),α倒捻子素(10μ米)或MPP的结合⁺(1000μ米)和α倒捻子素(10μ米)24小时,细胞使胰蛋白酶化和离心机在2500 rpm, 4°C 5分钟。总信使rna提取使用巴黎从球团设备根据供应商的指令。RNA的数量和纯度测定光密度测量在OD A260 / A280比率为1.8或以上使用Nanodrop 2000分光光度计(热费希尔科学Inc .威尔明顿,美国)。0.5运行证实了RNA的完整性μ1%琼脂糖凝胶g的RNA样品。后,1的互补脱氧核糖核酸合成μ使用Masterscript rt - pcr系统g的RNA(美国马里兰州盖瑟斯堡5 ',),根据制造商的指示和储存在−20°C到化验。KAPA SYBR快速qPCR工具包(美国KAPA生物系统公司、沃本MA)被用于实时PCR量化。20μL实时PCR反应混合物包含20 ng cDNA模板,10μL 1 x KAPA SYBR快速qPCR大师混合,正向和反向引物200海里,PCR-grade水。β肌动蛋白基因被用作参考。引物的序列中存在如下:p53:意义,5′-GGAGGTTGTGAGGCGCTGG-3′;反义5′-CACGCACCTCAAAGCTGTTC-3′;伯灵顿:意义,5′-CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG-3′;反义5′-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT-3′;bcl - 2:意义,5′-CATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3′;反义5′-GCCGGTTCAGGTACTCAGTCA-3′;β肌动蛋白:意义,5′-TGCAGAGGATGATTGCTGAC-3′;反义5′-GAGGACTCCAGCCACAAAGA-3′。应用生物系统公司的反应是在执行7500实时PCR系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA) PCR循环条件如下:3分钟酶激活在95°C, 40 3秒循环初始变性在95°C和退火/扩展58°C 32秒。融化曲线分析进行验证后每个引物的特异性PCR扩增特异性。阈值周期(Ct)用于比较Ct决心和数量方法。目标基因的相对数量是估计的方法。所有数据分析了ABI 7500软件,2.0版。

2.7。免疫印迹分析Caspase-3分开

SH-SY5Y细胞被镀成6-well盘子12×10的密度⁴细胞/好,一夜之间孵化。在暴露于MPP⁺(1000μ米),α倒捻子素(10μ米)或MPP的结合⁺(1000μ米)和α倒捻子素(10μ米)24小时5%以下有限公司₂在37°C,湿润孵化器细胞使胰蛋白酶化0.25%胰蛋白酶/ EDTA和离心机在4000 rpm, 4°C 5分钟。球是用冷洗净PBS, resuspended和孵化冰30分钟。然后细胞被漩涡离心机在15000 rpm 15分钟4°C。上层清液收集和总蛋白浓度测定用BCA蛋白质分析。等量的30μg蛋白从每个实验小组SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离了15%。膜被5%的脱脂牛奶2小时,用TBST缓冲区,和孵化1:1000稀释的裂解caspase-3主要抗体(细胞信号技术,丹佛,妈,美国)或1:5000稀释的单克隆β肌动蛋白主要抗体(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)一夜之间在4°C。洗后,膜是孵化1:10000稀释HRP-conjugated山羊多克隆anti-rabbit免疫球蛋白(Abcam,剑桥,英国)的二次抗体裂解caspase-3和1:5000年HRP-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白(美国或表达载体,尤金)作为二级抗体β肌动蛋白在室温下2小时前被开发使用ECL '免疫印迹检测(通用电气医疗集团,白金汉郡,英国)。膜与反责备β肌动蛋白抗体控制相同加载的蛋白质。信号强度测定微使用Image-J软件(马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院、美国)。

2.8。统计分析

所有的实验进行了一式三份()。统计分析与单向方差分析测试了事后分析(图基的多重比较检验)使用GraphPad棱镜5软件Windows (GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。所有值都作为平均值±标准平均误差(平均±SEM)为每个组。被认为是统计显著。

3所示。结果

3.1。Alpha-Mangostin对MPP的影响⁺全身的可行性在SH-SY5Y细胞损失

探讨alpha-mangostin对神经细胞的影响生存能力,我们对待SH-SY5Y细胞与不同浓度的alpha-mangostin 24小时与MTT试验检测细胞活力。暴露SH-SY5Y细胞alpha-mangostin诱导减少细胞浓度的方式生存。细胞生存能力明显降低细胞治疗10时μm alpha-mangostin 24小时,而与控制(;数据1和2)。治疗20至40岁的女性μm alpha-mangostin导致损失的细胞生存能力50%以上(;图1)。当SH-SY5Y细胞暴露在-10年2.5μm alpha-mangostin 1000年的存在μm MPP⁺48小时,co-treated细胞有显著提高细胞浓度的方式生存,与1000年相比治疗μm MPP⁺单(图3)。基于这些结果,10μm alpha-mangostin利用在以后的实验。

3.2。Alpha-Mangostin对MPP的影响⁺全身的细胞凋亡在SH-SY5Y细胞

凋亡细胞被量化和πannexin-V双重染色使用流式细胞仪。的annexin-V⁻/π⁻人口主要由正常的健康的细胞,而annexin-V⁺/π⁻细胞被认为是细胞凋亡的早期阶段,和annexin-V⁺/π⁺细胞被那些认为是坏死(图/凋亡晚期阶段4(一))。在暴露于1000年μm MPP⁺24小时,凋亡细胞的比例增加(;图4 (b))。Cotreatment 10μm alpha-mangostin 1000年的存在μm MPP⁺24小时显著减轻细胞凋亡相比那些MPP处理⁺()。核细胞凋亡的形态学特征进一步研究使用赫斯特33258染色。浓缩或分散核被认为是凋亡细胞核。治疗10μm alpha-mangostin减少凋亡细胞核(图的数量5)。Alpha-mangostin显著减少凋亡细胞核MPP相比的百分比⁺单独处理(;图5 (e))。

3.3。Alpha-Mangostin对MPP的影响⁺全身的海拔在细胞内ROS水平

评估是否ROS发挥重要作用在MPP alpha-mangostin的衰减效应⁺全身的细胞凋亡在SH-SY5Y细胞,细胞暴露于1000年μm MPP⁺和10μm alpha-mangostin嗯MPP + 1000⁺6小时,细胞内ROS生产被评估为她和DHR123荧光流式细胞仪的使用。结果表明,cotreatment 10μm alpha-mangostin 1000年的存在μm MPP⁺显著降低细胞内ROS水平的平均荧光强度(MFI)她(;图6(一))和DHR123 (;图6 (b)),与MPP相比⁺单独治疗。

3.4。Alpha-Mangostin对伯灵顿的影响、bcl - 2和p53在MPP mRNA的表达⁺对待SH-SH5Y细胞

伯灵顿的mRNA的表达和bcl - 2研究了使用实时定量rt - pcr分析。1000年伯灵顿表达显著增加μm MPP⁺处理细胞,而控制细胞(图7(一))。Cotreatment 10μalpha-mangostin和1000μm MPP⁺24小时显著减少了伯灵顿的表情,与MPP相比⁺单独处理()。治疗1000μm MPP⁺显著降低bcl - 2表达,而cotreatment 10μm alpha-mangostin bcl - 2表达明显增加(;图7 (b))。因此,伯灵顿/ bcl - 2表达1000年SH-SY5Y细胞处理显著增加μm MPP⁺24小时(;图7 (c)),而伯灵顿/ bcl - 2表达显著降低细胞cocultured 10μalpha-mangostin和1000μm MPP⁺()。伯灵顿的上游调控和bcl - 2被调查。p53 mRNA的表达在1000年显著增加μm MPP⁺对待SH-SY5Y细胞后24小时暴露相比,未曝光的细胞(;图7 (d))。Cotreatment 10μalpha-mangostin和1000μm MPP⁺显著降低在MPP p53表达与细胞培养相比⁺独自一人()。

3.5。Alpha-Mangostin效应在MPP Caspase-3激活蛋白⁺对待SH-SH5Y细胞

调查的影响alpha-mangostin caspase-3蛋白质,细胞凋亡的关键刽子手,免疫印迹分析。激活caspase-3需要蛋白质的乳沟Asp175进入激活p17 p19碎片。24小时处理后与1000年SH-SY5Y细胞μm MPP⁺,显著增加激活caspase-3蛋白质检测相比,在控制细胞水平(图8)。当SH-SY5Y细胞暴露在10μm alpha-mangostin 1000年的存在μm MPP⁺,cotreated细胞明显下降激活caspase-3 MPP相比⁺单独处理()。

4所示。讨论

目前的研究,首次证明了alpha-mangostin救助在多巴胺能细胞凋亡SH-SY5Y MPP处理细胞⁺帕金森疾病的细胞模型。结果表明cytoprotection对MPP alpha-mangostin⁺全身的细胞凋亡可能与减少ROS有关生产、调节平衡的职业,凋亡基因(caspase-3激活和抑制。

MPP⁺是一种神经毒素用于生成帕金森病的动物和细胞模型。多项研究表明,边际产量⁺对细胞的氧化应激。MPP⁺被证明能增加活性氧在神经母细胞瘤细胞9,25,26)和诱导超氧化物阴离子(通过抑制线粒体)生产复杂的我10,27]。的存在对MPP超氧化物歧化酶等抗氧化酶保护⁺中毒性神经细胞系(28和多巴胺神经元的主要文化29日]。先前的研究表明,alpha-mangostin减少活性氧的形成(21,24,30.]。在目前的研究中,她和DHR123被用来评估神经母细胞瘤细胞的活性氧产量。她广泛用于监控生产超氧化物,最具体的染料保留良好的细胞(31日,32]。超氧化物自由基是最早的自由基生成的MPP的结果⁺曝光。我们的研究结果表明,alpha-mangostin减毒MPP的氧化效果⁺通过减少过氧化物生产。超氧化物阴离子被细胞内超氧化物歧化酶转化为过氧化氢(H₂O₂)。DHR123用于检测过氧化氢和过氧亚硝基(ONOO⁻)[32]。在体外,alpha-mangostin ONOO的有力清道夫⁻和(33]。我们的DHR123氧化试验表明,治疗alpha-mangostin也减少了生产的H₂O₂和ONOO⁻MPP引起的⁺。

一些研究支持活性氧中间体的细胞凋亡信号的作用。ROS升高细胞发生细胞凋亡(34)和抗氧化剂可以保护神经细胞免受各种各样的凋亡诱导细胞凋亡代理(35]。活性氧激活caspase-3和caspase-3-like蛋白酶在不同细胞类型包括神经元细胞,导致核凝结和DNA碎片(36,37]。ROS也诱导细胞凋亡,可能是通过减少bcl - 2的表达,一种凋亡分子(9,38]。bcl - 2和伯灵顿可能控制线粒体渗透性转换孔,可以影响细胞色素c的通道和其他凋亡诱导因素触发激活半胱天冬酶级联,导致细胞凋亡的9]。山竹果提取物已被证明对一个保护SK-N-SH神经母细胞瘤细胞βcaspase-3活动全身的增加(22]。在这里,我们表明,alpha-mangostin caspase-3激活减少,降低Bax mRNA的表达,增加bcl - 2 mRNA表达MPP引起的⁺在多巴胺能SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞。

先前研究cisplatin-induced凋亡死亡表明alpha-mangostin变弱的增加顺铂引起的p53表达(39]。p53、bcl - 2家族成员之间的关系已经建立(40]。Proapoptotic伯灵顿,直接由p53、bcl - 2可以克服的凋亡效应,而p53可直接抑制bcl - 2。在目前的研究中,治疗1000μm MPP⁺显著增加p53的表达。因此,增加p53诱导伯灵顿bcl - 2表达和抑制表达,导致SH-SY5Y细胞的凋亡。我们的研究结果表明,alpha-mangostin可能减少边际产量的影响⁺伯灵顿和bcl - 2表达的衰减p53表达。

Caspase-3已被证明是参与凋亡的事件发生在mitochondrial-dependent通路,与核有关的凝结和DNA劈理(41]。Caspase-3也从内部到外部诱发磷脂酰丝氨酸外化传单的质膜42]。磷脂酰丝氨酸暴露在外部传单的质膜可以绑定annexin-V和广泛观察到细胞凋亡(43]。支持我们的DNA染色和π/ annexin-V双重染色alpha-mangostin的作用在防止核变化和MPP引起的磷脂酰丝氨酸外化⁺治疗SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞。

Alpha-mangostin最丰富的生物活性之间是一种抗氧化剂氧杂蒽酮的山竹果果皮,长期以来一直用于传统医学治疗腹泻,痢疾,感染伤口,和慢性溃疡30.]。它有一个广泛的生物活性,如抗氧化、抗炎、anticancerogenic和antihistaminergic效果(39,44- - - - - -47]。Alpha-mangostin有保护作用对心肌梗死再灌注损伤大鼠;这种效果与低水平的脂质过氧化,减少蛋白质羰基化反应和保护谷胱甘肽含量高(19,48]。最近,alpha-mangostin已被证明能够抑制和分解β-淀粉样蛋白聚合,这可能导致其衰减的影响β-淀粉样蛋白oligomers-induced神经毒性在阿尔茨海默氏症的细胞模型23]。

5。结论

本研究表明,alpha-mangostin保护对MPP SH-SY5Y细胞⁺全身的细胞凋亡。底层机制可以归因于其抗氧化性能,从而调节凋亡过程。结果表明,alpha-mangostin可能具有神经保护效应在PD的细胞模型。Alpha-mangostin是一种脂溶性小分子可能通过血脑屏障(49]。因此,它可能是一个有前途的治疗PD的候选人。然而,在活的有机体内研究应该探索临床数据。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究是Mahidol大学的研究框架下,支持的部分资金来自理学院,Mahidol大学。