文摘

甲基汞引起的神经毒性(MeHg)是有据可查;然而,脊髓发育神经毒性仍不完全清楚。在这里,我们调查是否MeHg影响脊髓层次发展。鸡胚在E3上治疗蛋中蛋0.1μg MeHg / 50μL在E10生理盐水和分析。因此,我们使用反进行免疫染色γ-H2A。X识别DNA双链断裂和antiphosphohistone H3, anti-p21, anti-cyclin E识别细胞增殖和细胞周期蛋白。同时,识别神经细胞,我们使用anti-NeuN和反βIII-tubulin抗体。MeHg治疗后,我们观察到增加γ-H2A。X来响应DNA损伤。MeHg引起细胞增殖和减少脊髓层的厚度。此外,我们证实MeHg诱导增加p21-positive细胞的数量,但没有改变细胞周期蛋白雌激素阳性细胞。数量相当高的TUNEL-positive细胞表明DNA碎片被观察到在MeHg-treated胚胎。关于神经分化,MeHg诱导NeuN表达减少,没有改变的表达βIII-tubulin。这些结果表明,蛋中蛋MeHg暴露改变脊髓发展通过干扰细胞增殖和死亡,也干涉早期神经元分化。

1。介绍

水银是一种金属已知毒性发生的自然和环境中的anthropogenically1,2]。甲基汞(MeHg)是一种有机化学形式的汞被广泛研究由于其神经毒性效应在人类和动物模型,特别是当发生产前(3- - - - - -6]。

MeHg能够穿过血脑屏障,这是不成熟的胚胎和胎儿,导致胎儿大脑的脆弱性增加有机汞的毒性作用(7- - - - - -9]。此外,MeHg往往积聚在胎儿因为他们无法排泄这种金属(10]。

中枢神经系统(CNS)的发展是缓慢而渐进的,包括神经元和神经胶质细胞的分化和迁移组织组成大脑和脊髓的细胞层。因此,开发引起的中枢神经系统损伤MeHg可能导致不可逆转的形态和生理障碍,妥协产后运动协调,学习、记忆功能(3,11- - - - - -14]。

MeHg暴露的影响中枢神经系统有关,尤其是成年人,神经化学变化,包括干扰钙和谷氨酸稳态(15,16)、活性氧生成和氧化应激在哺乳动物的大脑17- - - - - -19]。此外,线粒体功能障碍伴有凋亡蛋白的表达也被确认为一种影响MeHg-induced神经毒性(20.- - - - - -22]。

虽然MeHg引起的神经毒性是有据可查的,发育神经毒性仍不完全清楚。先前的工作表明,蛋中蛋MeHg暴露导致行为障碍,如异常运动和低勘探活动,以及形态学和生物化学变化,包括改变小脑皮质的组织层和抗氧化酶活性的增加的小脑MeHg-exposed小鸡(23]。在这项研究中,我们提供了一个新的方法来探索发展MeHg引起的神经毒性,使用鸡胚作为模型。本研究的目的是探讨影响MeHg脊髓的细胞层,主要集中于细胞增殖和细胞周期。脊髓被选中,是因为它的三层的细胞组织不太复杂的大脑和小脑相比,这使得它更容易描述中枢神经系统细胞动力学,因此发育神经毒性。此外,缺乏知识关于脊髓发育MeHg引起的神经毒性的是因为这种金属引起研究最多的障碍主要与大脑和小脑。

2。材料和方法

2.1。卵子和胚胎

受精卵的背带家从一个商业孵化器(泰森食品巴西Ltda。、巴西)。蛋重(g)和转移到孵化器在37.5 - -38.0°C,湿度65.0%。产前急性MeHg暴露在胚胎第三天(E3),也就是说,20 HH舞台系列(24]。胚胎接受单剂量为0.1μg氯化甲基汞二世(美国Sigma-Aldrich)稀释50μL(生理盐水注射到蛋黄素血管附近的卵黄囊。未经处理的控制胚胎只有50μL(生理盐水。本研究中使用的剂量的MeHg决定根据亨氏et al。25,26)和一项研究的基础上,由卡瓦略et al。23]。治疗后,每个鸡蛋都回到了孵化器,每天监测和胚胎蛋中蛋胚胎第十天(E10),也就是说,36 HH。E10,胚胎被冷却麻醉为15 - 20分钟4°C,从蛋壳中删除,并在生理盐水洗。所有实验动物研究根据伦理委员会大学联邦德圣卡塔琳娜州,巴西弗洛(批准号355 / CEUA / UFSC)。

2.2。常规显微技术和脊髓的形态测量学

整个胚胎E10 (每组三个独立实验胚胎)固定在4%甲醛和主干区域解剖,嵌入在石蜡,切成串行横向部分(6μ米)。部分是沾hematoxylin-eosin(他)来分析脊髓形态和确定室管膜细胞的分布和形态,地幔和边缘层。室管膜的厚度、地幔和边缘层是使用的形态学测量的目镜(美国奥林巴斯)(200 x)在脊髓的中线区域。

2.3。Autometallography方法

我们评估汞沉积autometallography (AMG)方法,脱蜡部分在沉浸在AMG开发人员解决方案(阿拉伯胶60%、10%柠檬酸钾缓冲,30%对苯二酚,和0.5%硝酸银)在黑暗中60分钟。接下来,脊髓部分(每组三个独立实验胚胎)是用自来水洗净,用苏木精复染色。汞沉积被评估为棕色染色的细胞,这代表了周围的银汞沉积(27],列为缺席(−),轻微的(+),中等(+ +),和强烈的(+ + +)由一个侦探是盲目的治疗任务根据穆勒et al。28]。

2.4。免疫组织化学

评价急性MeHg产前暴露的影响,我们首先寻找增殖,细胞周期、DNA损伤脊髓使用抗体兔子anti-phosphohistone H3免疫球蛋白g (1: 250;美国北部),兔子anti-cyclin E免疫球蛋白(圣克鲁斯生物技术1:100年,美国),鼠标anti-p21免疫球蛋白(圣克鲁斯生物技术1:100年,美国),和兔抗γ-H2A。X免疫球蛋白g(1: 50,圣克鲁斯生物技术,美国)。接下来,我们研究了神经元分化使用抗体鼠标anti-neuronal核NeuN免疫球蛋白(Chemicon国际1:100年,美国)和鼠标反β三世微管蛋白免疫球蛋白(Promega 1: 100年,美国)每组三个独立实验胚胎)。内源性过氧化物酶活性与过氧化氢0.3%甲醇停止。部分是用0.1磷酸盐(PBS) pH值7.4 + 0.3% Triton x - 100然后堵塞5%胎牛血清的边后卫在PBS。一夜之间被孵化的部分在4°C主要抗体,用PBS洗净,然后孵化90分钟在室温下与peroxidase-conjugated二级抗体anti-rabbit免疫球蛋白(σ1:400年,美国)和biotin-conjugated抗体,包括anti-rabbit免疫球蛋白(σ1:200年,美国)和anti-mouse免疫球蛋白(σ1:200年,美国)。接下来,部分在0.1 PBS,洗和抗体结合位点是显示3、3′-diaminobenzidine (DAB)(美国Sigma-Aldrich)。免疫荧光,Alexa萤石488山羊anti-mouse免疫球蛋白g(1: 200年,生活技术,美国)和Alexa萤石568山羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 100年,生活技术,美国)。接下来,部分与4,孵化6-diamidino-2-phenylindole盐酸盐(DAPI)(美国Sigma-Aldrich)在室温下3分钟。消极的控制免疫组织化学反应以同样的方式治疗,除了主要的抗体被替换成0.1 PBS。

2.5。TUNEL分析

我们使用TdT-mediated dUTP尼克结束标记(TUNEL)染色确定凋亡细胞脱蜡脊髓部分(每组三个独立实验胚胎)。TUNEL染色进行TdT-FragEL DNA碎片检测设备(美国Calbiochem)根据制造商的指示。在细胞核中TUNEL-stained细胞显示深棕色沉淀。

2.6。定量分析

量化免疫反应性的细胞(phosphohistone H3和NeuN)和TUNEL-positive细胞,使用M-42 stereological分析测试系统(英国Tonbridge韦贝尔2号)(200 x)。数值密度单位面积(NA)的细胞决定根据Mandarim-de-Lacerda [29日]。五个随机领域脊髓被数的每个部分(3节/胚胎,7每组三个独立实验胚胎)。为了量化-H2A。X-positive细胞荧光数字图像的像素的集成密度确定使用图像J软件(NIH)形象。比例尺确定,测量集成密度的像素在3599 .77点确定μ米²框架。

2.7。流式细胞术

解剖和解脱的脊髓均质连续提交洗0.1 PBS pH值7.8 (每组三个独立实验胚胎)。然后,细胞分离用0.25%胰蛋白酶为15分钟37°C搅拌下,加入5%的边后卫。随后,样本在640×g离心10分钟和上层清液收集(30.),孵化主要抗体兔子anti-cyclin E免疫球蛋白(圣克鲁斯生物技术1:1000年,美国),鼠标anti-p21免疫球蛋白(圣克鲁斯生物技术1:1000年,美国),和鼠标反βPromega三世微管蛋白免疫球蛋白g(1: 1000年,美国)1 h,然后孵化45分钟568二级抗体Alexa萤石anti-rabbit免疫球蛋白和Alexa萤石488 anti-mouse免疫球蛋白g(1: 1000年,生活技术,美国)。每个抗体在每个分析分别进行治疗。以前,运行无污点的细胞进行确定的大门。此外,propidium碘用于改进感兴趣的大门。因此,从点阴谋与20000事件和考虑的参数(SSC-A)和向前散射散射(FSC-A),盖茨与1800事件被确定。FACSCanto二流式细胞分析仪(BD生物科学、加拿大)是用于分析。中给出的值是绝对计数。

2.8。统计分析

定量数据分析使用Statistica 10.0为Windows。MeHg-treated之间的差异和未经处理的控制胚胎被学生未配对的评估t以及。所有数据都表示为均值±SEM,被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。在脊髓汞沉积

AMG方法被用来显示一个注入0.1μg MeHg到卵黄囊可能达到胚胎脊髓。正如所料,汞沉积在MeHg-treated胚胎但是没有观察到明显的控制胚胎。MeHg沉积是公认的在三个脊髓层,和更大的强度的沉积被发现(图室管膜和地幔层1)。

3.2。脊髓形态学和形态测量学

考虑到水星成立于胚胎组织,我们评估脊髓的一般特征。类似的功能室管膜细胞的形态和分布,地幔和边缘层MeHg-treated之间的观察和控制胚胎(图2)。然而,MeHg治疗显著降低厚度引起的地幔层()相比,控制胚胎(,)。同样的效果观察的边际MeHg-treated胚胎层()相比,控制(,)。室管膜层的厚度才MeHg治疗后不会改变之间的控制()和MeHg-treated胚胎(,)。

3.3。汞对增殖和细胞周期的影响

的基础上的大小造成的脊髓MeHg曝光,下一步是评估增殖和细胞周期,这是必不可少的发展进步。几个增殖细胞中观察到所有的胚胎,而且,治疗后,MeHg引起这些细胞的数量减少单位面积。室管膜层,增殖细胞的钠显著低于MeHg-treated胚胎细胞(13.75 /毫米²(55.01±7.3)相比,控制细胞/毫米²±13.7,)。在地幔层,最多的控制(60.17中可观察到细胞增殖细胞/毫米²(21.82±10.4)相比MeHg-treated胚胎细胞/毫米²±8.6,)。没有观察到显著差异之间的边缘层控制细胞(32.64 /毫米²(20.5±10.2)和MeHg-treated胚胎细胞/毫米²±10.5)(图3)。

此外,我们检查了p21蛋白和细胞周期素E,扮演着重要的角色在细胞周期的进展。MeHg p21-positive的绝对数量的增加引起的脊髓细胞对胚胎细胞(473.33±62.40)相比,控件(17.47±100.67细胞,)。然而,没有观察到变化在细胞周期蛋白雌激素阳性细胞的数量MeHg-treated控制胚胎细胞(102.7±15.2),(55.28±145.0细胞,)。图4显示immunolocalization和p21和细胞周期蛋白雌激素阳性细胞百分比MeHg-treated和控制胚胎。

3.4。DNA损伤和细胞凋亡

为了验证如果MeHg引起DNA损伤,的表达γ-H2A。X蛋白在DNA双链断裂是检查。治疗后,MeHg造成的表达增加-H2A。X(53岁,834.14μ米²)相比,控制胚胎(34岁μ米²,)。这些反γ-H2A。X-positive细胞被发现之间的过渡区主要的室管膜层和地幔MeHg-treated胚胎(图5)。

对DNA损伤的增加,我们调查MeHg治疗后细胞凋亡的发生。凋亡细胞中观察到的脊髓控制和MeHg-treated胚胎。明显高TUNEL-positive NA细胞中观察到的地幔层MeHg-treated胚胎细胞(12.73 /毫米²(3.82±3.6)相比,控制细胞/毫米²±2.1,)。然而,没有发现显著差异在控制细胞(3.09 /毫米之间²(2.05±1.5)和MeHg-treated胚胎细胞/毫米²±1.2)在边缘层。此外,没有TUNEL-positive细胞中观察到的室管膜层控制或MeHg-treated胚胎(图6)。

3.5。汞对神经细胞分化的影响

我们调查是否MeHg妥协脊髓神经元分化发展中,考虑到的主要影响MeHg观察主要在地幔层,发生强烈的细胞分化。免疫荧光使用反βIII-tubulin抗体显示这种蛋白质的表达在地幔和边缘层E10。观察治疗后,没有变化的表达βIII-tubulin之间的控制细胞(424.0±40.91),MeHg-treated胚胎(1.85±517.33细胞,)(图7)。此外,当我们分析NeuN的表达,在postmitotic神经元和/或在神经元分化,显著减少的NA NeuN-positive细胞中观察到的地幔层MeHg-treated胚胎细胞(14.32 /毫米²(64.55±4.1)相比,控制细胞/毫米²±5.5,)(图8)。

4所示。讨论

MeHg的神经毒性是一个众所周知的现象,本研究新数据有助于改善当前的理解一个后胚胎细胞反应蛋中蛋注入0.1μg MeHg。虽然这个剂量并不影响整体形态的脊髓,这里展示了它与脊髓层厚度的减少,以及早期损伤细胞周期蛋白和神经分化。

事实上,蛋中蛋毒性研究开发是一个很好的模型,因为胚胎发展缺乏母性因素的情况下,这可能会影响试验结果。金属注射卵黄囊是有效的神经发育毒性,这些分析进行验证与醋酸铅和MeHg[在我们先前的研究23,28,31日]。此外,实验设计也很重要,尤其是建立曝光时间。初步测试(数据未显示)使用一个比这里的7天采用较短的曝光时间不够MeHg合并的胚胎。此外,考虑到曝光时间,治疗的选择和分析年龄也同样重要。

在这项研究中,我们接触的胚胎在早期发展阶段的中枢神经系统(E3),神经管闭合后不久。在这个阶段,神经管由一个nondifferentiated神经上皮。然后,了解MeHg的神经发育毒性,细胞分析在E10,当脊髓的层是杰出的,由神经元和神经胶质细胞分化。使用时间曝光和差距分析计算为了评估脆弱性的时期的胚胎,然后评估MeHg必不可少的细胞机制的影响,固有的发展脊髓。

我们的研究结果表明,MeHg导致层的厚度的减少,反映了这种金属在脊髓组织的神经毒性。卡瓦略et al。23)展示了MeHg的淀积层鸡胚的小脑和浦肯野还显示形态变化层产后第一周。MeHg中毒研究表明MeHg的影响在人类和动物中枢神经系统的细胞结构层,影响性格和神经元的数量,以及大脑和小脑的大小(6,7,32- - - - - -35]。

关于对中枢神经系统的形态学层的影响,我们测试的假设MeHg导致细胞增殖障碍,发展的一个重要机制。然后,我们分析更具体一些蛋白参与细胞周期,以便更好地理解MeHg毒性的细胞基础。我们的数据显示,激增的数量显著减少神经细胞室管膜和地幔层。神经细胞增殖受到MeHg,证明了在体外和在活的有机体内化验(14,35,36]。这也是证明MeHg影响扩散在所有地区发展中中枢神经系统,如脊髓非洲爪蟾蜍光滑的和鲐鱼类(37,38),以及在小鼠大脑和小脑34,39,40]。

认为MeHg妥协的细胞增殖是探索经典作品集中在有丝分裂抑制相关的中断G1和G2的进展7,34,39]。数据的表达调控分子参与细胞周期检查点,p21和细胞周期蛋白等,已经展示了主要在大脑(14和海马35和大脑皮层40,41]。p21蛋白过程中扮演着重要的角色在细胞周期阻滞,以应对DNA损伤的抑制复制的起始阶段。正如预期的那样,我们的研究结果表明p21的表达增加后的室管膜层和地幔MeHg曝光。Ou et al。42和佛斯特曼等。43]也观察到这种行为的p21 MeHg治疗后神经细胞。然而,这里我们发现协会减少细胞增殖增加p21表达在发展中脊髓。综上所述,这些数据表明细胞损伤引起的MeHg和这个有机金属引起的细胞周期G1的逮捕。有趣的是,关于细胞周期素E和p21的互动作用,减少细胞周期素E预计MeHg治疗后,可以由伯克et al。14),Falluel-Morel et al。35许,et al。40]。事实上,细胞周期素E MeHg已被确定为一个目标,减少大脑发育的表达式。另一方面,我们的数据表明,MeHg并未改变细胞周期素E鸡胚脊髓的表达式。

p21的upregulation是必需的,以应对DNA损伤。事实上,使用γ——H2A。X作为DNA损伤的标志,我们验证了DNA双链断裂的发生在MeHg-treated胚胎脊髓,展示了基因毒性效应的金属。DNA损伤可能导致胞内信号序列有助于upregulation p21,和未修理的损害可能会导致细胞凋亡的信号。在这里,我们发现MeHg凋亡,认识到DNA碎片。观察凋亡细胞主要在地幔层,同一层的地方γ-H2A。X-positive细胞被发现。这种组合的数据强化了论点的毒性MeHg似乎激活细胞程序性死亡或凋亡的信号级联两个成人(44- - - - - -46)和发展中中枢神经系统(6,14,22,35,38]。此外,我们建议减少核扩散和增加细胞凋亡之间的关系可以作为一个原因的减少脊髓层的厚度。此外,这种损害可以进步在胚胎发育期间,以及在童年和成年阶段。

考虑到地幔层似乎更受MeHg和神经元也承认在胚胎时期评估这一层,我们调查是否MeHg干涉的表达β微管蛋白三世,分化神经元的一个标志。尽管我们的期望,不妥协这个蛋白质使用的剂量。但是,当我们分析NeuN的表达,特异性神经元核蛋白质,这是公认的在postmitotic神经元和/或神经分化,我们观察到在这种蛋白质的表达明显降低。我们的研究结果表明,MeHg影响不同神经元的成熟,在同一胚胎阶段。这可以解释说,考虑到组织脊髓层在开发期间,分化和迁移的细胞需要不同的节奏。因此,在相同的胚胎阶段,我们发现神经发生的早期和晚期阶段。一般来说,我们的研究结果提供了新的见解的尝试有助于更好地理解复杂的细胞基础MeHg神经毒性,在发展中脊髓。

5。结论

在脊髓MeHg行为的基础发展是不完全的描述。从毒理学的角度来看,这些结果是非常重要的,因为他们第一次显示蛋中蛋MeHg暴露改变脊髓发展导致DNA双链断裂,也令人不安的增殖和细胞死亡的机制,不同干涉早期和晚期神经形成阶段。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Evelise m . Nazari和亚拉·m·r·穆勒的贡献同样工作。