文摘

Ambur镇位于板状根河的银行,被认为是污染最严重的地区在印度和被数以百计的制革厂和皮革产品的单位。本研究旨在评估制革厂排放废水的毒性作用(TE)模型农作物,环保的微生物和人类血液细胞。TE的植物性毒素的影响进行测试洋葱和浮萍属小揭示抑制根系生长和显著减少的数量的叶子,蛋白质和叶绿素含量。此外,TE诱导萎黄病和组织坏死念珠藻属muscorum在低浓度(10%)。TE也对环保的微生物产生负面影响,苏云金杆菌,根瘤菌etli,曲霉属真菌terreus发挥重要作用在植物生长的营养。TE的基因毒性研究人类白细胞显示干扰正常有丝分裂和随后的细胞溶菌作用。也干预正常的复制过程,诱导微核形成健康的白细胞。5%浓度的TE红细胞被发现有毒。从这项研究中TE Ambur板状根河的不利影响在所有三个级别的生物在生态系统即使在低浓度。

1。背景

任意排放未经处理的污水直接或间接进入水生身体可能导致污染水资源。这将影响人类和其他生命系统。在一些地区,环境面临越来越大的压力从固体和液体废物来自皮革行业。制革厂废水中污染物最高排名的所有工业废物(1]。印度是世界上第三大的皮革生产商拥有大约3000制革厂,年处理能力070万吨的隐藏和皮肤(2]。金属通常出现在制革厂废水(铬、铝、锆等)都归类为高/中度急性或慢性毒性作用在有机生命3]。这些是不可避免的副产品的皮革制造过程和造成重大污染,除非治疗前放电。此外,皮革行业主要原因高铬涌入到生物圈造成工业使用总量的40%。从制革工业废水排放处理含有高水平的生化需氧量(BOD)、化学需氧量(COD),电导率,尤其是重金属铬高于允许的水平使其潜在的有毒(4]。

板状根河的主要河流流经Vellore区长度与4710地区(120公里的流域)。巴拉尔河河谷,制革行业最理想的地方之一在印度,Ambur附近,印度。有晒黑的线性增长行业板状根山谷以及废物到河边。皮革鞣革厂直接发布的化学物质使进入板状根河(通常是干燥常流河)和遍历Ambur导致地下水污染从而扰乱生态平衡(5]。

制革厂的废水中铬浓度升高Vellore地区造成了严重的环境问题。根据它的氧化态和浓度、铬可以是有益的或有毒的动物,植物,人类(6]。铬(III)被认为是平衡人类和动物的一个重要组成部分的饮食对预防不利影响葡萄糖和脂类的代谢(7]。高浓度的制革厂废水可以干扰一些代谢过程,因为它能够协调各种有机化合物导致金属酶的抑制系统(8]。制革厂废水中重金属的存在导致毒性作用生物据Siyanbola et al。(2011)9]。制革厂废水中的有毒金属造成致命的影响,基因毒性,诱变,微生物和致癌性,水生生物,植物,动物,和人类(10]。

识别关键的有毒化合物和潜在的有毒化合物的潜力在制革厂废水,各种毒性分析应该执行。本研究评估制革厂废水对微生物的毒性作用(杆菌、根瘤菌和曲霉属真菌)、藻青菌(念珠藻属muscorum),植物(洋葱,浮萍属小),红细胞(RBC)。

2。材料和方法

2.1。研究区和污水收集

高度污染的废水样本收集制革厂废水排放在巴拉尔河流域地理位置为12.78°N纬度78.7°E经度。样本网站是著名的高污染率在过去的25年之前,这个盆地农业领域。在过去的25年,废水从大部分的皮革产业被排入河流,道路,和农业领域。废水样品收集在酸清洗无菌塑料容器5升容量的TE积累的网站。收集到的样本被送到实验室无菌和存储在无菌条件下进行了进一步的实验。

2.2。废水的物理化学性质

收集到的样本分析的物理化学参数,如色彩、pH值、总溶解固体(TDS)和总固体(TS)使用标准的方法。测定BOD(生化需氧量)是由温克勒的碘量滴定的方法(11]和COD(化学需氧量)是决定有机物氧化后强烈tetraoxosulphate VI酸介质由K₂Cr₂O₇在148°C,回滴定法(滴定法)12]。溶解氧(做)孵化之前和之后确定的内容。铬、锌、镍、铅、镁含量估计通过原子吸收分光光度计和被限制测试(http://www.epa.gov/)。火焰分光光度法测定钠和钾含量测定(13]。阿宝₄,没有₂,没有₃和氯离子色谱法测定14]。

2.3。制革厂废水的微生物活动

TE的最低抑制浓度(MIC)为每一个微生物(苏云金杆菌,根瘤菌etli,曲霉属真菌terreus)确定。纯粹的文化苏云金杆菌在Mueller-Hinton肉汤培养,根瘤菌etliPY富裕介质(15,16),而曲霉属真菌terreus在马铃薯葡萄糖肉汤培养基。测试微生物来源于海洋生物技术和Bioproducts实验室,维特大学,Vellore,培养实验前一夜之间在各自的媒体。制革厂废水的抑制区是由Kirby-Bauer以及扩散法(17]。测试微生物镀和不同浓度的制革厂废水被添加到井。抑制的区是48小时后观察孵化。检测麦克风收集到的TE与各自的媒体和100稀释μL TE的不同浓度(0 - 100%)添加到每个的96孔酶标和测试生物接种。这是允许在28°C孵化24 - 72小时,光密度(OD)为595 nm。制革厂废水的最低浓度,抑制微生物的生长被认为是最低抑制浓度(MIC) TE对生物体的测试(18]。蒸馏水是用作控制和实验在一式三份完成。

2.4。使用蓝细菌毒性评估

念珠藻属muscorum蓝藻是用于生物测定。念珠藻属muscorum生长在含瓶200毫升的物品修改Chu-10介质(19]。文化是充气2 - 3次/天。日志中的细胞阶段(4-6-day-old文化)被添加到四个不同的稀释TE (0、25、50, 100%)。样本孵化和细胞被离心收获7 - 8天后在10000 rpm在4°C(30分钟20.]。样本检验对不同生长参数,如总叶绿素含量和蛋白质含量的分光光度和荧光方法。分析了蛋白质含量如前所述[21]。实验进行了一式三份。

2.5。的培养洋葱

健康的洋葱鳞茎的洋葱从当地超市购买,在自来水清洗去除污染在外壳上。后干燥洋葱鳞茎直径(1.5 - 2.2厘米)用自来水彻底冲洗,外层鳞片被移除。老根残余被没有令人不安的根原基。在蒸馏水最初洋葱种植了24小时,然后积极的洋葱根尖细胞分裂受到不同浓度TE(5、10、15、20、25、30、35岁,40岁,45岁,50岁和55%)和控制(蒸馏水)。每个浓度成立于三个复制。每24小时测试解决方案取而代之的是新鲜的。植物收割后48小时评价植物性毒素的效果。根的长度洋葱生长在不同浓度的TE,测量的帮助下一米规模和平均根长度进行了计算。计算最小根抑制电子商务₅₀。

2.6。的培养浮萍属小

新鲜鸭杂草(浮萍属小l .)收集从维特大学园艺和试验在室温下进行。的叶子仔细分离和消毒1%的次氯酸钠溶液。约2克的叶子接种在季度Coic Lessaint解决方案(22,23]随着TE(5%, 10%, 15%,和25%)为96小时。中没有TE担任控制。

2.7。蛋白质的提取

可溶性总蛋白测定根据洛瑞的方法。这是通过收集TE治疗的叶子从每个测试浓度和研磨用杵和臼在5毫升的磷酸钾缓冲。管在12000转离心20分钟。收集得到上清液和总蛋白质含量是由洛瑞估计的方法(21]。

2.8。测定光合色素和可溶性蛋白质

大约150毫克的浮萍属叶子处理不同的TE浓度都均质在冰上3毫升的66毫米磷酸盐缓冲剂(pH值7.2)通过添加10毫米顺序氯化钾。匀浆提取与80%冷丙酮标准化和存储。叶绿素含量测定方法的亚嫩河(1949)(24]。色素提取液的吸光度测量波长的470,537,647,663,730 nm使用紫外可见分光光度计。叶绿素a的内容,类胡萝卜素和叶绿素b,依照实验方程所描述的亚嫩河(1949)(24]。

2.9。使用白细胞基因毒性分析

2.9.1。染色体异常的确定

肝素化外周血中获得一个健康的无烟捐赠用于所有的实验。大约5毫升静脉血样本来自健康供者(O + ve)收集。五瓶含0.5毫升的血液在5毫升的RPMI 1640培养基接种(Himedia、印度)补充20%的胎牛血清,青霉素100单位/毫升,100年μg / mL链霉素,0.5毫克/毫升谷酰胺,6μ克/毫升的植物凝集素(PHA),在无菌条件下被添加。文化瓶在37°C 72小时孵化。文化是动摇每24小时和二氧化碳在24小时发布一次。在48小时的潜伏期,文化对待TE(5%, 10%, 15%, 20%)和孵化未来24小时37°C。积极控制mitomycin-C和控制没有制革厂废水被维护。在中期70小时分裂细胞被捕后加入2滴0.1%秋水仙碱(σ、印度)和进一步孵化2小时。72小时的孵育细胞离心后,上层清液轻轻丢弃,和6毫升prewarmed低渗的溶液(氯化钾0.075)添加到膨胀的细胞。孵化后,内容在2000转离心5分钟和上层的丢弃,治疗两次在不同的固定剂(3:1的比例甲醇:乙酸),和混合。固定后,所有的内容都是离心机和上层的丢弃和洗涤步骤是持续到颗粒变白。幻灯片是准备和保存在干燥孵化器在37°C。 Later, the slides were stained with 10% Giemsa stain and destained with deionised water [25- - - - - -27]。

2.9.2。细胞计数

这些细胞被统计在每个瓶使用血球计用台盼蓝染色的细胞(Himedia、印度)。估计是由得分为每个浓度的细胞复制。

2.9.3。微核检测

微核检测,0.5毫升的血液加入5毫升的rpmi - 1640中补充15%的胎牛血清的边后卫。淋巴细胞培养的五瓶培养72小时37°C。文化是动摇每24小时和二氧化碳被释放了。24小时的实验不同浓度(5%,10%,15%,和20%)添加了制革厂废水和控制(没有制革厂废水)也维持。微核制备细胞松弛素B(σ、印度)被添加到每个瓶的最终浓度4μ文化启蒙(g / mL后44小时后28- - - - - -30.]。孵化的瓶都被另一个24小时37°C和受到短暂冷低渗的氯化钾(0.056%)治疗。微核的幻灯片是由固定在甲醇:乙酸(3:1)和幻灯片进一步使用2%碱性染色染色。光显微镜下观察到的细胞和双核细胞得分。

2.9.4。在体外溶血性试验

在体外溶血性活动被Suthindhiran分析所述,Kannabiran (2009) (31日]。人类从外周血红细胞准备(+)的健康志愿者。大约5毫升的血液被收集在肝素化红细胞悬液管和2%是由洗细胞三次20毫米Tris-HCl包含25毫米氯化钠(pH值7.4)。细胞进一步清洗三次九卷无菌0.9%生理盐水。每次清洗后,细胞在2000转离心5分钟,上层的丢弃。最后的颗粒被稀释到1/9 (v / v)无菌0.9%氯化钠盐溶液然后1/24 (v / v)无菌杜尔贝科的磷酸缓冲盐(pH值7.0)包含0.5毫米硼酸和1毫米氯化钙(32]。测试在96孔板进行了。每个好100μL 0.85%的氯化钠溶液包含10毫米氯化钙添加。这100μL制革厂废水的不同浓度(5%,10%,15%,和20%)是补充道。100年μL 2%的红细胞悬液添加到每个好,室温下孵化了30分钟。内容被离心机和上层清液的吸光度测量在540 nm的试剂空白的废水被盐水代替。20毫升0.1% Triton x - 100年0.85%的生理盐水作为积极的和消极的控制包含蒸馏水。溶血的百分比计算(33),一式三份测定的平均值计算。

3所示。结果

3.1。制革厂废水的物理化学特征

废水的颜色是深棕色的pH值为7.6(表1)。生化需氧量(BOD)和废水的化学需氧量(COD)是526 mg / L和2986 mg / L,分别。溶解氧的废水测定值为36.21 mg / L。废水高总溶解固体(TDS)约为6395 mg / L。数据表中表示2显示值的金属和阴离子废水高于推荐值。废水被发现有铅、铁、铜、锌、锰、砷浓度远高于监管规定美国环境保护署(34]。铬和镍的浓度的废水在最高水平。一般来说,金属废水样品的可用性的趋势。制革厂废水也有高负载的硫酸盐和氯约776 mg / L和187 mg / L,分别。

3.2。制革厂废水对微生物的影响

所有的测试微生物的增长(苏云金杆菌,根瘤菌etli,曲霉属真菌terreusTE)被抑制了。增长中观察到的细菌和真菌的抑制浓度为30%。结果显示浓度依赖性生长抑制和抑制区每个有机体的决心,如图3。蓝藻生物测定表明,TE的浓度增加,叶绿素含量念珠藻属muscorum显著降低如表所示5。在所有参数叶绿素被发现是最敏感的,因为它显示萎黄病之后,组织坏死甚至在低浓度(10%)的TE。

3.3。制革厂废水的效果洋葱和浮萍属小

根生长抑制洋葱一直在观察不同浓度的废水(表吗3)。根的生长Alium cepa抑制了TE即使在低浓度。根长度的减少意味着抑制根系生长。减少根增长约47.3%是观察到的在较低浓度的TE (5%)。根增长百分比减少被发现(52.7,47.2,43.6,38.1,27.2,16.3,9.1,3.6%)当TE的浓度增加(5、10、15、20、25、30、35岁和40)。治疗TE显示显著抑制根系生长和根系生长被观察到洋葱对待制革厂废水浓度超过40%(表3)。欧共体₅₀(废水的浓度导致损失总额的50%)洋葱制革厂废水处理是7.79%。

不同浓度的制革厂废水的叶子的数量的影响浮萍属小(表4)。控制显示增加的数量的叶子后96小时的暴露在制革厂废水,但所有的制革厂废水处理浮萍属小显示的数量显著下降的叶子在同一时期。的叶片的数量浮萍属小对待最低浓度的TE(5%)从42 38(减少9%)而减少暴露引起的最高浓度的TE(20%)减少57%,96小时。控制显示的数量增加了32%。一些废水处理浮萍属小发现失去了自然的绿色,白色显示的死状叶子和萎黄病。

的蛋白质含量和光合色素浮萍属小受到制革厂废水的影响(表吗5)。52岁的蛋白质含量减少μ50 g / mL,μ38岁的g / mLμg / mL, 12μg / mL制革厂废水浓度为5%,10%,15%,和20%,分别。蛋白质含量的降低是制革厂废水的浓度最高(20%)。叶绿素和类胡萝卜素含量也下降大大在所有浓度的制革厂废水除低浓度(5%),显示只有轻微的减少。叶绿素a含量是86%保留TE治疗后5%,但只有9.5%的叶绿素a在场后暴露TE的20%。类胡萝卜素浓度的控制是估计为3.474μ克/毫升。色素含量显示最低的TE浓度减少15% (5%)。TE浓度的增加不断减小的类胡萝卜素含量最高浓度的TE(20%)显示,类胡萝卜素下降90%。然而,叶绿素b含量下降只有在制革厂废水的浓度更高。TE的最高浓度(20%)显示叶绿素b含量下降36%而暴露在低浓度的TE只引起轻微的减少。

3.4。制革厂废水对人类血液细胞的影响

3.4.1。细胞生存能力

可行的细胞的数量被发现6.25×10⁶在控制。逐步减少在细胞数量从5.5×10⁶(TE) 5%到1.8×10⁵(20% TE)观察与接触TE增加。细胞计数显著降低被发现在15%和20%的TE对待文化(表6)。在这些卷的细胞群被发现是控制细胞群的近一半。

3.4.2。染色体畸变

正常的染色体观察控制。然而,在TE治疗细胞染色体,畸变被观察到。在50中期观察计算至少一个删除的染色体处理20%的TE。至少三种类型的结构畸变,即染色体断裂(图1 (b)(图),染色体空白1 (c)(图),染色单体空白1 (d)),观察细胞内处理20% TE。分裂染色体的文化以10%,15%,20%也观察到。

3.4.3。微核检测

从文化获得微核细胞中发现了含有TE的15%和20%。微核靠近细胞核被发现但比核小。在控制微核被发现缺席。微核的出现是细胞损伤的迹象;因此,TE是人类白细胞发现诱导毒性和诱导损伤细胞的浓度为15%和20%,分别为(表6)。

体外溶血性试验。溶血是观察到的文化接受TE和剂量依赖。温和的溶血发现TE但红细胞显著减少人口的5%是观察到10%。积极的控制显示,94%的溶血而制革厂废水。此外,大量的观察溶血TE的15%的污水中大约50%的红细胞的文化诱导细胞死亡人口(图2)。因此,20%以上的制革厂废水对人类红细胞被发现剧毒。

4所示。讨论

整体数据强调抑制和有毒TE对植物的影响,人类血液细胞和微生物。生化需氧量(BOD)的废水值高于推荐的验收标准设定的联邦环境保护局(FEPA) [35]制革厂的废水排放和纺织成水体(50 mg / L)。废水的COD还发现高于美国环境保护署(构成)标准(1000 mg / L)放电的TE地表水(34]。这些高水平的废水的BOD和COD值观察到由于高有机物来自各种化学物质的量用于浸泡,晒黑,posttanning加工皮革。据报道,只有20%的化学物质用于皮革鞣制方法吸收,其余无侧限是浪费从而提高废水的BOD的水平(36]。应该注意的是,高制革厂废水BOD含量甚至可以导致快速消耗溶解氧,如果直接排入地表水。溶解氧值相对较少的样本分析由于有机质的增加。总溶解固体(TDS)高于标准推荐的价值构成(33]。高TDS发现可以归功于强劲的颜色(从死亡的一系列东西被使用在制革厂钢厂),他们可能是主要来源的重金属在河流沉积物重金属浓度较高可能提高悬浮物浓度(37]。任何自由离子浓度增加外部环境以及浓度的其他环境压力将导致渗透调节失衡在鱼类等水生动物。在我们的研究中可观察到高浓度的重金属TE。金属和废水中阴离子的所有值都高于构成标准,可能是由于铬鞣制革过程中所使用的化学物质(34]。其他阴离子也被发现的浓度高于构成标准值(34]。高浓度的硝酸盐和亚硝酸盐的TE可能是因为制革过程中使用的化学物质含有氮元素和蛋白质的含氮量的物质(38]。高水平的硫酸盐废水中可观察到,因为硫酸或产品的使用与制革过程中硫酸钠含量高(39]。

更高浓度的TE导致起源于植物的毒性测试工厂。降低毒性的主要症状包括根长度、叶片萎黄病,抑制种子发芽,和抑郁的生物量4]。收集TE的效果洋葱显示显著减少根长度,减少干重,根直径增加,增加根头发。估计EC₅₀的价值洋葱暴露在TE被发现7.79%几乎类似于Gupta et al .(2011)的结果(40]。根系生长的抑制作用可能是由于抑制根细胞分裂/根伸长或细胞周期的延长根(41]。也观察到,TE治疗导致叶数量大幅下降,叶绿素和蛋白质含量浮萍属轻微。TE的主要毒性可以观察到植物光合色素,光合作用,蛋白质含量(42]。在我们的研究中,TE治疗明显下降蛋白质和色素含量。蛋白和色素含量浮萍属小与越来越集中的TE逐渐减少。已经报道,重金属的存在导致萎黄病,坏死,必要的矿物质的浓度变化在植物43,44)和蓝细菌(45]。减少光合作用可能导致气孔关闭和改变的叶绿体的超微结构。高浓度的钴、铬和铜大大影响铁的浓度、叶绿素叶绿素a和b,蛋白质,植物中过氧化氢酶活性(23]。被称为有毒铬、诱变、致癌、致畸制革厂废水的组成部分,它是一种强氧化剂,导致严重损害细胞膜(46]。铬的毒性的大小可以减少天线的表皮层复杂的叶绿体,最终可以降低叶绿素含量(44]。它也可以导致损伤和蛋白质的变性的外层部分天线降低植物的叶绿素b的内容。铬的压力下,失活的酶参与叶绿素的生物合成途径,最终降低了叶绿素含量作为一个整体(47]。

TE显示毒性测试蓝藻念珠藻属muscorum通过减少总叶绿素含量。毒性可能是由于高水平的铬在TE的存在。铬(VI)减少PSII反应中心的量子产率,从而影响叶绿素含量。铬含量高也会导致DNA损伤,可能导致藻细胞的死亡。TE浓度的增加导致了细胞密度和细胞数量显著减少。暴露在制革厂废水的植物在几个方面影响他们的代谢过程包括经济增长,减少光合作用,叶绿素含量,叶绿体和线粒体退化。

制革厂的废水对人类白细胞被发现有毒。它阻碍了细胞的胞质分裂和细胞有丝分裂指数预计将大幅减少。在这项研究中,即便是低浓度的TE诱导潜在毒性健康人类白细胞。细胞计数白细胞减少近50%至20% TE(表6)。TE干扰正常的有丝分裂,诱导细胞死亡。此外,制革厂废水还发现诱发染色体畸变检测浓度。这些结果可以解释为条件,TE也可能干扰正常的复制过程,还可能诱发突变可能是暂时或永久48]。本研究进一步关注制革厂诱导微核形成的影响健康的白细胞。中可观察到微核细胞暴露于TE的10%和20%。自微核的出现表明细胞损伤,TE可以被认为是有毒的健康人类白细胞即使在很小的浓度。制革厂废水也发现有毒的红血细胞(红血球)5%的最低浓度。溶血是剂量依赖,导致细胞死亡50% 10% TE。这个结果可能解释的基础上,研究了铬的毒性细胞形成制革厂废水的主要成分。这证明红细胞表面暴露甚至小TE的浓度会导致致命的影响(49]。

我们的研究显示,TE是高度有毒的微生物测试(苏云金杆菌,根瘤菌etli,曲霉属真菌terreus)。所有生物体的生长抑制了TE即使在低浓度(5%)。重金属的毒性可能是由于在制革厂污水抑制细菌种类和活动的自然增长。这可能是由于重金属与有机化合物的复杂地层50,51)和重金属积累(52]。

5。结论

的结果,可以得出结论,TE的物理化学参数,即溶解氧和总溶解固体,COD、BOD、镍、镁、氯、钾、亚硝酸盐、硫、铬,是远高于规定的容许极限构成。Ambur出院TE板状根河,是高度有毒的微生物,植物,和人类血液细胞,因为它大大影响微生物的生长,根,蛋白质和叶绿素含量的植物和人类血液细胞的染色体。因此,建议从制革厂污水行业的释放应该做适当的处理和回收后最大可能水平和处理水资源应该最小化。由于实验条件进行了使用稀释废水的形式,它可以解释原油废水是高度有毒的。它还可以作为主要的水和土壤污染物在各自的领域可能大大影响环保的微生物,植物,也是人类。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

支持的研究机构拨款和作者感谢维特大学的管理提供必要的设施。