文摘

Paraoxonase (PON1)是一种钙依赖性酶,这种酶能够水解有机磷抗胆碱酯酶。PON1活性存在于大多数哺乳动物中,以前的研究证实,PON1活性取决于不同的物种。这些研究主要使用有机磷衬底对氧磷、对硫磷杀虫剂的活性代谢物。使用血清PON1从不同的哺乳动物的物种,我们比较的对氧磷水解的水解活性代谢物(的时候)的两个额外的有机磷杀虫剂,甲基对硫磷和毒死蜱。对氧磷水解大于甲基对氧磷,但活性物种之间的水平显示了类似的模式。不管测试的物种中,水解chlorpyrifos-oxon明显大于对氧磷或甲基对氧磷。这些数据表明chlorpyrifos-oxon更好的衬底PON1不管物种。的模式物种差异PON1活性随底物的变化从对氧磷chlorpyrifos-oxon或甲基对氧磷。例如,性别差异观察到在这里和其他地方的文献报道鼠PON1水解的对氧磷时不存在chlorpyrifos-oxon衬底。

1。介绍

有机磷杀虫剂(OP)应用于农业害虫控制的情况下,担任了许多家用杀虫剂活性成分。尽管他们的使用被限制在许多国家,他们仍大量使用在世界许多发展中国家1]。在这些地区,有巨大的潜在农业级的未标记的使用杀虫剂对害虫防治与伴随的风险在房子和谷仓,同伴和农场动物。

这些OP杀虫剂产生毒害神经的行动在害虫通过抑制乙酰胆碱酯酶(切:乙酰胆碱水解酶,EC 3.1.1.7)丝氨酸酯酶,降解广泛分布的神经递质乙酰胆碱(ACh)。显著抑制切活动会导致空调采暖的积累导致中枢神经系统和神经肌肉兴奋过度连接。这可能导致中断正常的生理功能。然而,许多OP杀虫剂是phosphorothionates不是切的非常有效的抑制剂。为了是有毒,phosphorothionates必须转化为活性代谢物或奥克通过细胞色素P450的作用。除了抑制酶切和其他,奥克是paraoxonase nonphysiological衬底1 (PON1;EC 3.1.8.1)水解对氧磷酯酶的分类能力,杀虫剂的活性代谢物对硫磷(2,3]。

用对硝基苯磷酸二乙酯乙酯(对氧磷或E600)作为衬底,奥尔德里奇(2,3)首次报道,不同的差异在其活动中存在的各种物种的血清。使用其他验证这些物种差异对氧磷(4- - - - - -7)和二异丙基phosphorofluoridate (DFP) [6]。在OP杀虫剂类,有大型化学结构的变化。以前在老鼠身上的研究(8,9)和人(10]表明活动差异存在于不同的时候。然而,目前还不清楚如果这些活动差异存在多个物种。本研究比较了从几种哺乳动物物种的血清PON1活性的时候三个结构不同的有机磷杀虫剂,毒死蜱、对硫磷、甲基对硫磷。

2。材料和方法

2.1。组织和生化药剂

兔子,猪,羊,牛,羊,马血清从σ化学公司购买(圣路易斯,密苏里州)。三个不同批次的血清与每个试验进行购买一批不同的血清。雄性和雌性大鼠血清收集评估和认证协会的实验动物Care-accredited Sprague-Dawley-derived鼠殖民地居住在兽医学院,密西西比州立大学。LabDiet啮齿动物食物和自来水是免费在这个温度控制的环境( °C)与12 h暗光周期与灯之间的0700和1900 h。密西西比州立大学动物保健和使用委员会批准了所有程序。分析年级对氧磷、甲基对氧磷和chlorpyrifos-oxon(> 99%)合成(如前所述)(11]。所有其他生化药剂和试剂从σ化学公司(圣路易斯,密苏里州)。

2.2。PON1活动

使用我们的修改(PON1活性测定spectrophotometrically9弗隆的et al。12- - - - - -14]。孵化混合物(1毫升)的血清(5μL / chlorpyrifos-oxon水解和20毫升μL /毫升对氧磷和甲基对氧磷),0.05 M Tris-HCl缓冲区(pH值7.4),要么CaCl 1毫米2(刺激PON1活性)或1毫米EDTA(螯合钙,从而防止PON1活性)。底物的反应是由添加(320μM chlorpyrifos-oxon、5毫米对氧磷或5毫米甲基乙醇对氧磷,最终浓度)和孵化15分钟用颤抖的在37°C。chlorpyrifos-oxon水解的反应是250年的终止μL 2%的十二烷基硫酸钠和吸光度是阅读在315海里。对氧磷和甲基对氧磷水解反应被终止的250μL 2%十二烷基硫酸钠和2%的混合Tris-base在400 nm和吸光度是阅读。差异CaCl2强化和EDTA样本用于纠正non-PON1水解。对于每一个衬底,PON1活动计算nmol产品形成的最小值−1毫克的蛋白质−1。

2.3。统计分析

Shapiro-Wilk测试用于检查正常的残差的方差齐性数据。非正态的分布,PON1活性表明( 进一步分析之前)和数据进行对数转换使用SAS统计软件包[15]。数据分析使用PROC混合过程(16]。模型识别物种之间的显著差异,OP,物种×OP交互。意味着分离是由最显著的差异。的标准是意义 。

3所示。结果

总的来说,有一个显著的影响的物种( , )和OP ( , )。还有一个重要的物种×OP交互( , )。因此,基于物种意味着分离×OP交互。

对氧磷作为底物时,兔血清表现出最高的所有物种活动(表1)。雌性大鼠血清活性显著高于雄性大鼠血清类似于山羊血清。活动在绵羊血清明显低于山羊,但明显高于牛,马,猪血清都统计上相似。

表1
血清paraoxonase 1特定的活动(nmol分钟−1毫克的蛋白质−1)从几个哺乳动物使用不同有机磷作为底物。

chlorpyrifos-oxon作为底物时,兔血清再次表现出最高的活动的所有物种(表1)。时显著低于兔子,活动在雌性和雄性大鼠血清,山羊,羊都是统计相似。低活动观察猪、牛、马的递减顺序和这些统计上的不同。

甲基对氧磷作为底物时,兔血清(表也表现出了最高的活动1)。雌性大鼠血清活性显著高于雄性大鼠血清类似于山羊血清。山羊血清的活动是类似于羊是类似于马和牛。猪最低活动对甲基对氧磷,但在统计学上类似于马和牛。

对底物的亲和力计算基于活动,chlorpyrifos-oxon基质比得多对氧磷和甲基对氧磷物种(表1)。对氧磷是一种基质显著优于甲基对氧磷所有物种除了马,牛和猪,他们的活动水平在统计学上类似的对氧磷和甲基对氧磷。

4所示。讨论

无论奥克作为衬底,兔血清含有更高的OP水解活动。这个大兔血清的水解能力相对于其他物种预计这一点经常被报道在文献[3- - - - - -7]。而缺乏大多数物种信息,兔血清PON1报道钙结合更加紧密和稳定比人类血清PON1 [17]。已经提出这两个特点是部分负责兔血清结合潜在的更大的活动数量(每卷血清酶分子的数量)和定性(催化营业额)差异。它已被证实在人类血清PON1定量和定性差异是影响单核苷酸多态性基因的编码(12,18)和启动子区域(19]。Gaidukov et al。20.)报道,兔子PON1赖氨酸(K) 192年在氨基酸位置相似大小和形状的精氨酸(R)发现在人类PON1异型酶已[21与更快的对氧磷水解。可能部分物种差异可能是由于类似的变化,但许多物种不具有多态性。

使用对氧磷和甲基对氧磷作为基质,雌鼠血清具有更大的水解活性比雄性大鼠血清。这种性别差异对小鼠活动报道(22,23)和大鼠(24,25]。血清PON1是肝脏合成和雌性老鼠和老鼠都有较高水平的PON1 mRNA在肝脏比她们的男性同行26,27),这表明较高的活动仅仅是更高的酶水平的结果。此外,大多数的血清PON1与高密度脂蛋白(HDL),其中包含载脂蛋白-ⅰ(apoA-I)和协会PON1 apoA-I功能稳定酶活性(28]。雌性老鼠拥有更高水平的血清apoA-I和提议,这是一个额外的因素越高血清PON1活性观察女性(24]。这种性别差异在PON1活性报道在一些其他物种(包括人类29日,30.和狒狒31日),在大多数情况下,对氧磷是利用作为衬底。然而,chlorpyrifos-oxon作为底物时,活动已不再存在的性别差异。虽然这是意想不到的,没有性别差异使用chlorpyrifos-oxon作为衬底之前已经报道过在老鼠32]。

缺乏性别差异的基础对底物利用尚不清楚。在人类研究中,软件名et al。33,34)报道,除了PON1有助于与性有关的基因变异在人类PON1活性。在人口研究,有遗传性别差异坐落在PON1 17号染色体与性别差异相关的活动没有任何PON1的催化结构的差异。有可能在啮齿动物中也存在类似的情况,但这是未知的。程,克拉森23)表明,雄激素和男性模式生长激素减少PON1表达式在雄性老鼠的肝脏,最有可能的激活STAT5b可能响应鼠标内的元素PON1启动子区域。此外,补充激素(孕酮和雌二醇)的雌性老鼠21天的水平增加血清PON1活性表明雌激素在女性的更高的活动(35]。在一个在活的有机体内系统,除了雌二醇的细胞试验旨在衡量细胞相关PON1活性导致PON1活性增加,但没有PON1信使rna和蛋白质水平的变化,表明雌激素是增强活动的稳定的催化构象PON1通过诱导蛋白质转译后的修改或通过与PON1[诱发因素相关联36]。后一种情况可以解释性别差异在PON1活性和部分解释substrate-specific性别差异。

如果性别差异PON1的转译后的修改可能会稍微影响催化部位的构象,性和基质差异可能是礼物。对氧磷和chlorpyrifos-oxon在结构上的区别只在他们的离去基团对氧磷有半个对硝基酚和chlorpyrifos-oxon trichloropyridinol。之前与这两个化合物乙酰胆碱酯酶抑制作用的研究表明,不同的离去基团的吸引力是绑定的不同利率的基础酶(37]。PON1似乎存在类似的情况。它已经证明了轻微的离去基团可以大大改变的变化 (底物的催化常数转换产品)PON1 [38]。因此,如何离去基酶可以控制它的方向吸引到其催化活性位点,因此。在这种情况下,改变结构的微小差异的区域吸引离去基团可以改变催化速率。也许这一差异是没有检测到非常好的基质,如chlorpyrifos-oxon的结构有一个优秀的适合酶与离去基团之间。相比之下,只PON1两性之间的差异变得明显时,底物有更好的适合PON1比另一种性别。

总之,在PON1活性物种存在差异,但这些差异并不仅仅是由于PON1更高层次。如果每个物种的酶水平是决定因素,活动对物种的模式会在基质类似。然而,在活动上显著不同的物种基质对氧磷和甲基对氧磷成为chlorpyrifos-oxon作为底物时类似。也有很多研究,提供确凿的证据性别对啮齿动物(PON1活动的影响22,24- - - - - -27]。相比之下,我们的研究结果,观察到这些性别差异与一些可检测基质与别人但不检测,让我们假设的差异可能是由于性别影响催化PON1结构的转译后的修改或其他因素的诱导,PON1在活动中发挥的作用。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

农业和林业实验研究受到了密西西比河站(加)和兽医学院密西西比州立大学。本文,我们没有出版。J12608和环境健康科学中心出版。145年。