文摘
氰化物是一个无处不在的化学环境中,与许多中毒事件;然而,对其潜在的有毒影响发展。本研究的目的是评估的影响产妇接触氰化钾(KCN)怀孕期间对母猪和后代。24怀孕母猪被分配成四组口头接受不同剂量的KCN(0.0, 2.0, 4.0,和6.0毫克/公斤体重)从怀孕21天。KCN-treated母猪显示组织学病变在中枢神经系统中,甲状腺滤泡增大,甲状腺上皮增厚,胶体再吸收变化,肾小管上皮细胞空泡变性。母猪处理4.0毫克/公斤KCN显示死亡人数的增加仔猪在出生时。断奶仔猪从所有KCN-treated组显示组织学病变甲状腺功能类似的发现在他们的母亲。怀孕母猪氰化物的接触从而引起毒性作用在两个母亲和小猪。我们建议猪可以作为一种有用的动物模型来评估神经,goitrogenic,氰化物中毒和生殖的影响。
1。介绍
氰化物是一个无处不在的化学环境和与许多有关人类和动物的中毒事件。氰化物可以发布的工业过程包括金属加工、电镀、塑料和化学合成1- - - - - -3]。只考虑美国,它是生产300000 t的这种物质,一年,喂养电镀、纸、塑料和黄金的开采4]。这种离子也出现在烟草烟雾(5),和烟雾吸入在火灾(氰化物中毒的常见原因6]。一些药物的药用价值,如苦杏仁苷和硝普酸可以释放氰化物(7]。此外,许多植物对人类和动物饲料等木薯sp。(木薯),亚麻属植物sp。莲花sp。种豆科,高粱sp,包含发布氰化物生氰苷。这种物质的浓度可高达100 - 800毫克/公斤的植物原料(3,8]。
急性氰化物中毒的机理是众所周知的;它通过线粒体细胞色素c的失活和发生中断的有氧呼吸,导致致命的细胞缺氧,细胞毒性缺氧9]。然而,考虑到环境中的常数氰化物的存在,最重要的不利影响这种化合物目前被认为是由于慢性毒性。因此,有必要仔细评估的潜在毒性长时间暴露于氰化物。
事实上,疾病已被归因于长期接触低浓度氰化物。在人类中,慢性和自发的退化性疾病,如痉挛性下肢轻瘫或“konzo”[10)和热带运动失调的神经病变(11,12),已与木薯高消费。此外,长时间接触氰化物与帕金森病有关和认知障碍(13,14]。
吸烟和木薯消费已经涉及tobacco-alcohol弱视等眼部疾病的发病机理15,16),眼球后的神经病变的恶性贫血17),利伯氏世袭视神经病变(18,19),西印度弱视(20.,21),牙买加视神经病变(22),热带弱视(23),和古巴视神经病变(24]。
此外,人类和动物的胰腺和热带糖尿病与摄入生氰植物(25,26木薯[],特别是27]。
实验研究在狗、山羊和老鼠显示慢性氰化物接触导致受损的身体生长,甲状腺肿,损伤中枢神经系统(CNS) [28- - - - - -30.]。此外,我们已经核实,氰化物生长猪的长期管理促进神经毒性,肝毒素的,足以危害肾脏的影响(31日]。
尽管有研究报道了在各种动物慢性氰化物中毒,对其潜在的毒性作用的发展。胎儿畸形与产妇食用生氰植物动物如猪、马、羊、和牛32- - - - - -36)以及在人类(37,38]。此外,山羊在我们实验室进行的研究表明,产妇氰化物接触与胎儿堕胎和缩颌(39]。我们验证这些发现在研究老鼠,幼崽从大坝对待不同剂量的氰化物和/或硫氰酸(产生的活性代谢物生物转化的氰化物)表现出相似的毒性作用,其中一些观察只在断奶(40]。
我们之前已经证明猪是一种有用的动物模型评估慢性氰化物毒性(31日),和其他人发现,适合生殖毒理学研究[41,42]。本研究的目的是评估毒性作用,在这两个水坝和他们的后代,产妇接触氰化钾(KCN)怀孕期间在猪。
2。材料和方法
本研究进行了圣保罗大学(USP)试验站,Pirassununga, SP、巴西(S21°58′, W47°27′)。程序是USP动物伦理委员会批准,和所有动物保健和处理是由有经验的人员在兽医的监督下。
2.1。动物饲养和实验设计
Landrace-Large白母猪,240天的人,是培育一个男猪的品种。所有女性都为阴性抗体假狂犬病和感染弯曲杆菌sp。鸟型分支杆菌,布鲁氏菌是,钩端螺旋体sp。
繁殖的日子被定义为妊娠期第一天(GD1)和妊娠经超声(美国)设备(扫描仪100兽医,派医疗)GD21。确认之后,女性开始接受实验的口粮。怀孕母猪被随机分配到四个治疗组(每组实验的开始)和服用不同剂量的KCN(德国默克公司),在毫克每千克体重(毫克/公斤),如下:0 (KCN0组),2.0 (KCN2组),4.0 (KCN4组)和6.0 (KCN6组)。
本研究的目的是评估embryotoxic氰化物使用猪作为生物模型的影响。鉴于胚胎植入在猪育种和结束后开始在13天18天(43],KCN从GD21管理到分娩(大约怀孕114天)一天两次,7点之间一半剂量和07:30时,另一半之间的剂量下午18:00,与10 g的淀粉混合饼干在单独的低谷。对照组只接受饼干。水和食物是免费的。在妊娠期间,大坝是每周称重。
2.2。生化和荷尔蒙的评估
收集血液样本通过颈静脉穿刺使用肝素化注射器在21日,五十,80,110天的妊娠。血清冷冻和储存在−10°C到分析。商业套件(CELM、巴西)用于测定白蛋白、血糖、尿素、肌酐、天冬氨酸转氨酶(AST)和γ谷氨酰转肽酶(GGT)水平使用自动生化系统(sba - 200 CELM)。甲状腺素的血浆的浓度(T4)和三碘甲状腺氨酸(T3)测量GD110使用商业未及工具包(Coat-A-Count西门子)。
2.3。在母猪超声评价和病理研究
超声评价进行GD45、GD55 GD65在每个怀孕猪测量胎儿以下参数:crown-rump长度(CRL),胸直径(TD)、腹部(广告),直径和二顶的直径(桶)。
GD110,怀孕母猪从每组是安乐死;羊水是收集进行化学分析。片段的中枢神经系统,甲状腺、肺、胰腺、肝脏、肾脏和收集和缓冲福尔马林固定在10%,嵌入在石蜡,切成5μm部分,通过苏木精和伊红染色(他)。
2.4。评估在小猪
立即在出生时,每个新生儿的体重和性别都被记录下来。每个新生儿然后仔细检查异常(总值44]。两个新生的猪,从每个母亲,男性和女性被安乐死收集碎片的中枢神经系统,甲状腺腺体,肺、胰腺、肝脏和肾脏。从出生(PND1)三个月的年龄(PND120),每个小猪每周体重和体重增加计算。的绝对重量和体重增加仔猪按性别分别进行了分析。血液样本每个小猪出生后被立即通过颈静脉穿刺和7日,14日,21日,45天的生活相同的生化参数评估的评估他们的母亲。
最后实验周期(PND120),小猪被安乐死。片段的中枢神经系统、甲状腺、胰腺、肝脏、肾脏收集和缓冲福尔马林固定在10%,嵌入在石蜡,切成5μm部分,通过苏木精和伊红染色(他)。
2.5。分析方法
硫氰酸盐含量的金边债券服用在GD21血清,GD50, GD80,和GD110羊水GD110到初乳分娩后立即使用了小矮星的方法通过分光光度法和下降15),修改特定于我们的研究。简单地说,0.2毫升的生物材料被添加到1.8毫升的10%三氯乙酸溶液和在10000转离心20分钟。接下来,0.5毫升的上层清液整除与0.25毫升的1 M盐酸酸化。样本混合后添加以下试剂:50μL饱和溴水,100年μL(三氧化二砷(20 g / L在0.1 N氢氧化钠),0.9毫升的吡啶(10毫升的12 N HCl, 60毫升的吡啶,去离子水和40毫升),和p-PDA试剂(2 g 1 L的0.5 M盐酸;3:1,准备立即使用前)。reddish-pink复杂,形成阅读在540 nm 15分钟后分光光度计(Micronal B382 Micronal, S.A.巴西)对一个空白样品。硫氰酸水平样本准备读根据标准曲线与已知浓度的硫氰酸(25 - 300μmol / L)。数据表示为μLmol / L。
分析方法的线性测试浓度的25岁,50岁,75年,100年,200年和300年μmol / L为每个浓度的硫氰酸10个样本。斜率确定系数为0.9911,0.0008097,和设在拦截在0.005267。intralaboratory精度,所表达的变异系数,interday内获得通过分析100年标准样品硫氰酸盐的水平μmol / L在水中,池的血清样本,初乳,和羊水,加工五次在两个不同的日子。变异系数的范围从1.3到5.8% interday内部和2.1至4.8%。从95.5到98.3,硫氰酸复苏血清;初乳94.5到96.6;和羊水98.8到98.2添加到标准溶液浓度的硫氰酸100年和200年μ分别mol / L。
2.6。统计分析
体重数据,血清生化,超声波测量,和硫氰酸血清水平进行了分析使用一个混合线性模型为每个治疗(Proc混合)。动物被嵌套在治疗,随着时间的推移被重复测量的变量。动物被认为是一个随机的因素模型。
血清激素水平,出生体重,初乳中硫氰酸盐含量进行了分析统计,单向方差分析(方差分析)其次是Dunnett测试。死亡的频率使用确切概率法分析了小猪,每次治疗相比,控制。
数据报告为±SEM方法,分析了使用SAS软件(版本9.2;SAS研究所卡里,NC)。在所有情况下,显著差异的概率是α= 0.05。
校准和硫氰酸盐的浓度曲线不同的生物体液和时间,治疗后,采取使用GraphPad棱镜5:00 (GraphPad 2007)。
3所示。结果
怀孕母猪没有显示临床实验期间急性氰化物中毒的迹象。所有的治疗在整个研究大坝幸存下来。没有显著区别控制和KCN-treated母猪身体体重增加(表1,)。
胎儿死亡是由超声诊断评估三个雌性KCN4组和一个怀孕的女性从KCN6组21至45天的妊娠。女性怀孕失败退出实验,取而代之的是怀孕的女性。
怀孕期间收集的血清生化分析显示,波动的多个参数,但这些参数保持在正常范围为所有猪(数据未显示)。同样,没有T的变化3(控制0.039±0.005,0.033±0.001 KCN2, KCN4 0.034±0.002,和KCN6 0.034±0.002)和T4(控制0.84±0.4,0.9±0.3 KCN2, KCN4 0.79±0.1,和KCN6 0.93±0.2)水平被发现怀孕的第110天。另一方面,等离子体在GD50硫氰酸盐含量增加,GD80, GD110女性从所有治疗组(图1,)。初乳中硫氰酸盐的浓度增加在所有大坝处理氰化物(图1,)。每组羊水评估从一个女性显示增加硫氰酸剂量反应的方式(KCN0 20.5水平μ51.1 mol / L, KCN2μ55.9 mol / L, KCN4μ65.7 mol / L, KCN6μmol / L)。
(一)
(b)
超声评估GD45、GD55 GD65证明形态学尺寸没有明显的变化(CRL, TD,广告,和桶)每组的胎儿(数据没有显示)。
在GD110组织病理学评估安乐死怀孕母猪,更多的浦肯野细胞与嗜酸性胞浆被发现在所有实验母猪,而观察到的浦肯野细胞空泡变性只母猪从KCN6组(图2)。控制母猪相比,实验母猪甲状腺滤泡增大,立方滤泡上皮增厚和重吸收液泡在胶体(图3)。此外,肾小管上皮细胞空泡变性的母猪从所有组织暴露于KCN(图4)。
有显著增加()死亡人数小猪KCN4组相比KCN0组(表1)。小猪在出生时的体重是影响(表1,)的治疗。
仔猪血清的生化分析收集显示波动的不同参数,但这些参数保持在正常范围为猪(数据未显示)。在PND120,没有治疗效果整体体重的男性或女性的小猪(表1)。没有观察到安乐死新生儿组织病理学损伤。PND120,小猪在所有实验群体有相似的组织病理学变化他们的母亲,包括甲状腺滤泡细胞增大和上皮增厚和液泡化(图3)。
4所示。讨论
选择管理KCN口头旨在模拟自然暴露在这个物种的主要路线。这里使用的剂量的KCN是基于数据从早前在我们实验室进行的研究对男性growing-finishing猪(31日),动物显示慢性暴露于氰化物的毒性作用,但没有表现出任何临床症状的急性毒性(例如,呼吸困难,抽搐发作)。同样,没有怀孕的女性在这个研究显示,临床症状的急性氰化物中毒期间KCN管理。
鉴于氰化物可以妥协的苦味食品消费在研究[45)、淀粉饼干已知高度的猪被选出的氰化物。这个过程保证所有女性摄入的目标剂量氰化物迅速(通常在不到2分钟)在每个管理。在之前怀孕母猪的毒性动力学的研究,我们核实,口腔接触KCN后,硫氰酸血清水平增加3小时,6小时后达到顶峰,并保持长达21小时升高(46]。因此,我们认为,每天两次氰化物管理将确保高血清水平的稳步硫氰酸,独立于怀孕的阶段。
虽然一些研究发现之间的联系减少体重和长时间暴露于氰化物在人类和动物47- - - - - -49),我们没有发现这个参数减少的怀孕母猪KCN。这个结果与我们之前的工作进行growing-finishing猪(31日]。同样,研究评估氰化物怀孕期间暴露在山羊39)和大鼠(40)没有发现体重增加的差异之间的控制和实验动物组。以同样的方式,Tewe和马纳(50)没有发现体重变化怀孕猪美联储木薯含有高浓度的氰化物。
虽然没有观察到生物化学变化在怀孕女性暴露于KCN,这些母猪的组织病理学表现显示肾脏和肝脏损伤。病变在我们的研究中所观察到的类似以前被描述在对其他物种的研究长期暴露于氰化物(30.,51,52),以及在猪31日]。还有待决定如果这些病变的结果直接从氰化物毒性,硫氰酸,或两者兼而有之。
研究清楚地表明,中枢神经系统是一个重要的目标在长时间暴露于氰化物在人类53和动物54- - - - - -56]。在人类中,它被描述导致一些疾病,如痉挛性下肢轻瘫(也称为“konzo”)、帕金森氏症、认知障碍和眼部疾病11,13,14,16,24,57]。
猪是一个新兴的模型系统研究人类中枢神经系统(58]。在我们实验室的一项研究,氰化物是猪同期增长管理评估,我们发现浦肯野细胞退化和损失的小脑白质组织对待KCN [31日]。类似的病变,在这项研究中被发现母猪暴露于氰化物。这些发现加强我们断言猪应该作为动物模型,以更好地理解神经毒性的机制(s)氰化物和/或其主要代谢物。
热带胰腺糖尿病慢性氰化物接触有关通过食用木薯在男人的25),复制狗吃木薯研究[59]。然而,研究注射氰化物对不同动物物种(29日,60),包括猪(31日),无法复制这些致糖尿病的影响,尽管动物有胰岛细胞功能类似于人类(61年]。鉴于怀孕本身具有致糖尿病的效果由于降低胰岛素敏感性的组织和合成胰岛素需求增加62年,63年),从理论上讲,怀孕母猪对氰化物接触更容易患糖尿病。因此,我们推测,我们的研究将会提供所需的所有条件再现热带猪胰腺的糖尿病。然而,我们没有发现任何变化的参数选择评估氰化物的致糖尿病的影响(即。、血糖水平和组织病理学)。正如我们先前表明,怀孕的大鼠暴露于氰化物水平都较高的血糖和胰岛变性(40),怀孕的老鼠可能是一个更好的动物模型评估pancreotoxic氰化物的影响。
研究发现低剂量的相关性慢性氰化物摄入量与母马流产的发生率更高(32)、羊(36),和山羊39]。慢性氰化物摄入低剂量的烟同样一直与自然流产的女性(64年),尽管目前尚不清楚这一发现是由于氰化物而不是香烟中发现其他有毒化合物。
较高的胎儿死亡、死胎协助出生,在母猪和小猪木乃伊被发现暴露于氰化物在这项研究。最常见的感染导致巴西(生殖疾病的原因弯曲杆菌sp。鸟型分支杆菌,布鲁氏菌是,钩端螺旋体sp)被排除在这些动物。很多原因可以断定解释这些发现,但它是最有可能的一个合理的考虑KCN。因此我们认为猪是一种很好的动物模型系统研究氰化物的角色和/或其主要代谢物与吸烟有关堕胎的女性。在我们的研究中,我们没有发现畸形新生儿猪,是不可能得出结论如果超声评价猪可以早期发现的有价值的畸形子宫内。”
羊膜穿刺术在这项研究显示高水平的硫氰酸怀孕母猪的羊水。Dencker et al。65年)和施瓦茨(66年)表明,阴离子物质,如弱酸氰尿酸,可以积聚在胚胎和胎儿。这可能是由于pH梯度在母亲的血浆中,酸性比胎儿血浆的pH值。因此研究观察到胎儿的“监禁”氰化物生物(67年]。此外,众所周知,这种酶rhodanese存在于胎盘和胎儿68年]。因此,它是可能的,“逮捕”氰化物可以转化为其主要代谢产物,导致胎儿间接硫氰酸盐的毒性。支持这个假说是另外一项研究,氰化物和硫氰酸管理怀孕的老鼠,和两个物质被发现促进胎儿的毒性作用[40]。
协议被用来评估发育毒性在先前的研究有一定的局限性69年]。这样的一个限制是产后缺乏监控发展的后代,这会导致错误结论的发育毒性物质在考试。事实上,de Sousa et al。40)评估产前接触氰化物在老鼠和发现,改变只在断奶在幼崽被检测到。我们的研究支持这些发现,我们发现某些有毒氰化物的影响只在断奶仔猪。
5。结论
总之,怀孕母猪暴露于氰化物在母亲和小猪有毒性。然而,后代观察姗姗来迟的毒性作用。因此,本文提供的数据强化了假设一个互补断奶后评估新生儿发育毒性研究的一个必要组成部分。此外,我们表明,猪可以作为一种有用的动物模型研究神经,goitrogenic,生殖毒性的氰化物。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。