文摘
哺乳动物的昼夜节律形成不可或缺的生理系统允许所有代谢过程的同步日常光/暗周期,从而优化其功效。昼夜中断被卷入各种癌症的发病和进展,包括那些引起的乳房。几个昼夜的蛋白质之间的联系Per2和DNA损伤反应存在。异常Per2表达导致的下游影响细胞周期和凋亡目标,暗示Per2的肿瘤抑制作用。由于严重的剂量限制与当前化疗策略相关的副作用,包括阿霉素的使用,需要更有效的辅助疗法增加癌细胞出现了敏感性。因此本研究旨在描述Per2的作用在正常乳腺上皮细胞(MCF-12A)和ER−乳腺癌细胞(mda - mb - 231)也决定在doxorubicin-induced Per2细胞死亡的作用。在这两种细胞系Per2蛋白表达细胞系表现出24小时的昼夜节律。Per2主要定位在细胞质中,核本地化观察胞质荧光强度较低。我们的结果显示Per2沉默有效糖分会让chemoresistant乳腺癌mda - mb - 231细胞对阿霉素的细胞毒性效应。
1。介绍
致癌过程从根本上是复杂和高度变量,没有单一基因改变引起癌症。然而,癌症发展的起始包含一系列的阶段开始,最初司机突变负责tumourigenesis,其次是额外的基因突变的积累,赋予增殖和生存优势(1]。癌细胞就开发了各种精致的机制逃避细胞死亡(2]。因此,当前抗癌策略包括放疗或化疗药物的使用,就像阿霉素(阿霉素),各种实体肿瘤的治疗。然而,除了相关的严重副作用累积剂量依赖性的使用蒽环霉素抗生素如强力霉素,抵抗癌细胞对化疗策略(药物抗性)已经成为一个正在进行的许多癌症患者所面临的复杂的问题。目前人们相信药物抗性占超过90%的失败率与转移性乳腺癌的治疗(MBC) [3]。因此,迫切需要新的治疗方法,这增加这些耐药肿瘤细胞化疗敏感性的策略,出现了。
据世界卫生组织(世卫组织)国际癌症研究机构(IARC)广泛的人类流行病学证据表明,昼夜中断带来的轮班工作最有可能致癌(IARC分类,组2)[4]。此外,证据也表明,昼夜节律的同步可能影响抗肿瘤耐受性和化疗药物的药理功效5]。
昼夜节律是外部表现的内在生物时间测量周期24小时范围内(6]。到目前为止,所有的哺乳动物细胞类型已被证明具有一种内在的生物钟,由自给的和自我转录反馈循环,负责保持细胞内的时间(7]。虽然内部哺乳动物的昼夜节律以世纪(8),这些振荡背后的分子本质最近才被理解。正确的核心功能的昼夜节律基本helix-loop-helix PER-ARNT-SIM (PAS)域蛋白质Bmal1和时钟,这二聚化(9),最终导致他们的阻遏蛋白的表达:时期(Per1、Per2和Per3)和隐花色素(Cry1和Cry2) (10]。翻译/和哭二聚化和与人类酪蛋白激酶1的蛋白质ε对照ε)。这个复杂的把原子核的抑制导致时钟:Bmal1介导转录(11]。
Filipski和他的同事们进行的一项研究表明,中央tumour-bearing生物钟遭到严重破坏,导致小鼠肿瘤生长加快,确认已知的临床结果,保持24小时的昼夜节律患者通常有一个改进的昼夜节律被打乱的预后比(12]。此外,各种各样的临床和在活的有机体内证据表明,当化疗药物的生理时间管理中起关键作用的药理药效和毒性顺铂和阿霉素(13]。因此,进一步调查生物钟的影响明显,破坏细胞DNA损伤反应和癌症易感性是必要的,尤其是对于阐明这个生物钟混乱背后的机制。
此外,细胞周期基因最近被证明是直接调节生物钟(14]。然而,生物钟准确运行独立的细胞周期调控(15]。目前是知之甚少的确切机制如何生物钟调节细胞周期进程。因此本研究旨在提供洞察内在外周生物钟背后的分子性质,以及评估这些时钟的操作是否通过Per2的沉默,一个关键的监管机构参与生物钟的调整,可以提高抗乳腺癌细胞对阿霉素的抗癌的效果。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
乳腺癌mda - mb - 231细胞培养在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)补充10%胎牛血清(FCS)和1%青霉素链霉素(标准生长介质)。非癌变MCF-12A细胞培养在1:1的比例DMEM和火腿的混合物F-12营养补充10%胎牛血清和1%青霉素,链霉素10μg / mL胰岛素(Humulin 30/70), 20 ng / mL表皮生长因子(EGF), 500 ng / mL氢化可的松,100 ng / mL霍乱毒素。细胞被维持在37°C,湿度5%的氛围有限公司2并定期亚文化一旦confluency的70 - 80%。confluency到达80%,细胞分裂和播种新媒体实验。
2.2。治疗
在治疗之前,媒体吸气和细胞单层与温暖的PBS洗两次,确保所有细胞碎片被移除。阿霉素的浓度(2.5μ米)就业选择是基于细胞生存能力,最高浓度产生至少在正常(MCF-12A)细胞毒性作用,同时提高细胞死亡的癌症(mda - mb - 231)细胞。
2.3。Per2 esiRNA击倒的
细胞被镀成6-well板在标准中转染前24小时。Endoribonuclease-prepared核(esiRNA)针对Per2(σ,EHU070571)在无血清媒体包含刚做好的转染试剂(HiPerfect)。混合物被允许在室温下孵化20分钟为了esiRNA: HiPerfect复合物形成。不增长的媒体被添加到生成最终的浓度30海里,这是添加一滴一滴地进入细胞。细胞培养在37°C和5%公司的氛围2湿度对后续治疗前48小时2.5μ阿霉素。
2.4。sds - page及免疫印迹分析
细胞被洗两次冷PBS和细胞溶解在冰上使用修改radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲区(2.5毫米Tris-HCL 1毫米EDTA,二硫苏糖醇1毫米,0.1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF), 1毫米苯甲脒,50 mM氟化钠,4毫克/毫升SBTI, 10毫克/毫升亮抑酶肽,0.1% SDS 0.5%钠脱氧胆酸盐,和1%的NP40,校准,pH值7.4)。完整的细胞溶解产物都用在冰3赫兹,短时间在4°C和离心10分钟8000 RPM。细胞溶解产物随后被分离在4 - 15%聚丙烯酰胺预制凝胶(mini-PROTEAN TGX凝胶,Bio-Rad)钠十二烷基硫酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)对±100 V 90分钟。在完成sds - page、蛋白质被转移到准备聚偏二氟乙烯(PVDF)膜用半干的electrotransfer系统(TransBlot涡轮v1.02 BioRad) 30分钟25 V。膜与朱红色年代彩色可视化蛋白质转移和非特异性结合是防止通过阻断细胞膜在5% (w / v)无脂牛奶Tris-buffered盐水- (TBS) T (1 x TBS, pH值6.8,0.1% Tween-20) 1小时。膜是孵化在4°C隔夜TBS-T稀释anti-rabbit主要抗体(1:1000)针对Per2 (Abcam ab64460)、裂解caspase-3(细胞信号,# 9661),和裂解PARP(细胞信号,# 5625)。膜与TBS-T洗(3×5分钟)在孵化前anti-rabbit免疫球蛋白辣根过氧化物酶共轭二次抗体(1:10000)与温柔的在室温下搅拌1小时。之前洗膜蛋白被发现使用ECL的免疫印迹基质检测设备(皮尔斯,热科学)和蛋白质呈现乐队使用ImageLab 4.0软件Chemi-Doc议员(BioRad)成像系统。暴露的乐队是可视化和量化使用微一个微软件使用数量。乐队为每个特定的蛋白质被量化为密度读数比较控制样本。
2.5。免疫细胞化学
MCF-12A和mda - mb - 231细胞培养在8-well室幻灯片(Thermoscientific) 12 000个细胞/密度。治疗期后,生长介质被和细胞与温暖的PBS洗两次。细胞被固定在冰冷的甲醇和丙酮(1:1)。固定剂混合物被移除和细胞与磷酸盐缓冲盐水冲洗(PBS);非特异性结合被孵化阻止细胞1% BSA / PBS阻塞的解决方案。孵化后,阻塞的解决方案是排水,主要抗体Per2 (Abcam ab64460)在PBS稀释(1:50)添加到细胞和允许孵化一夜之间在4°C。细胞被冲洗PBS和允许孵化Alexa萤石488共轭二次抗体(生命技术)。赫斯特33342年染料(1:200)是另外添加和保存在接触细胞进一步10分钟。接下来,细胞被清洗和安装DAKO荧光安装介质和蔡司共焦显微镜分析。
2.6。MTT试验
MTT细胞进行了可行性分析,评估新陈代谢可行的细胞的百分比。后续esiRNA或强力霉素治疗细胞与温暖磷酸盐缓冲盐水洗(PBS)和孵化MTT(肝癌和0.001 g / mL PBS)为90分钟的氛围37°C, 5%的公司2湿度。MTT甲瓒晶体溶解使用异丙醇:盐酸/ triton - x - 100的解决方案。盘子然后使用KCjunior分析软件在通用微型板块读者(EL800 Bio-Tek仪器Inc .)吸光度值测定波长540 nm。吸光度值都表示为一个百分比的MTT还原与未经处理的控制(100%)。
2.7。细胞周期分析
细胞周期分析是由流式细胞术使用CycleTEST + DNA试剂盒(美国加州,正欲)。后续治疗mda - mb - 231细胞被洗,使胰蛋白酶化,在室温下离心5分钟在300×g。细胞被计算使用血球计和浓度调整为1×106细胞/毫升使用所提供的缓冲溶液。为了准备染色的细胞,细胞悬浮液在400×g离心5分钟在室温下。每个样本在胰蛋白酶缓冲其次是孵化项目孵化胰蛋白酶抑制剂和核糖核酸酶缓冲区,最后在一个冰冷的propidium碘(PI)染色方案。样本分析流式细胞分析仪(BD FACSAria I)的3个小时内添加PI染色方案。至少30 000列表模式为每个样本数据事件被收购了。ModFit LT软件(真实软件,Inc .)我,美国)是用来确定的百分比细胞G0 / G1, G2 / M期。凋亡细胞的比例也使用ModFit LT软件决定。
2.8。G2 / M分析
毕竟治疗mda - mb - 231细胞脱离烧瓶用0.25%胰蛋白酶EDTA(技术)。细胞悬液然后离心机在1500转3分钟。上层清液被移除和颗粒resuspended 1毫升PBS。添加甲醛的最终浓度4%,细胞被固定在37°C 10分钟,之后,细胞被放置在冰。固定剂被细胞离心和上层清液之前被删除。透化作用是通过增加冰冷甲醇(90%)和孵化细胞冷冻保存。孵化缓冲区(0.5 g BSA溶解在100毫升PBS)被添加到细胞,离心清洗两次。Phospho-Aurora(用力推288年)/ Aurora B(刺232年)/极光C(刺198年),Alexa萤石488共轭(细胞信号技术)和Phospho-Histone H3 (Ser10647),Alexa萤石共轭(细胞信号技术)主要抗体被添加到细胞(1:50稀释孵化缓冲区),在室温下培养1小时。离心细胞被洗的孵化缓冲区之前resuspended在0.5毫升PBS和分析流式细胞分析仪(BD FACSAria I)。至少30 000个事件收集和分析使用波长488纳米的激光和502 lp, 520/30BP排放过滤器。
2.9。统计分析
所有统计分析进行了使用GraphPad棱镜5。所有数据是评估使用意味着±SEM。单向方差分析(方差分析)与Bonferroni事后修正以及Mann-Whitney 在适当的地方进行了测试。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。描述Per2在正常乳腺上皮细胞的作用以及在ER−癌症细胞
确定昼夜表达模式的存在的蛋白质含量Per2我们特征的相对蛋白质含量随着时间的推移Per2。标准的细胞培养条件下细胞培养和蛋白质提取物进行了每小时一段25小时下午7时开始和终止第二天下午08时。MCF-12A细胞表现出明显的昼夜模式Per2蛋白表达显著增加Per2蛋白水平在20小时(03 h00)相比基线(0小时= 07 h00)。mda - mb - 231细胞显示相同的节奏Per2表达式模式,与水平显著提高20小时(03 h00)相比基线(0小时= 07 h00),然而,在一个小得多的程度上比观察MCF-12A细胞(图1)。描述的细胞定位Per2, MCF-12A和mda - mb - 231细胞与Per2应用:Alexa萤石488年,赫斯特33342年和可视化通过共焦荧光显微镜。MCF-12A乳腺上皮细胞显示主要Per2定位在细胞质内,与轻微colocalization细胞核,而mda - mb - 231肿瘤细胞显示核colocalization Per2(图更加突出2)。另外两个细胞系显示两个不同的种群Per2荧光强度,暗淡的人口(图2(一个)),以及一个更光明的荧光强烈的人口(图2 (b))。在这两种细胞系指出Per2核本地化是局限于细胞的荧光衰减器的族群。
(一)
(b)
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(b)
3.2。的角色在Doxorubicin-Induced Per2 mda - mb - 231细胞死亡的癌细胞
阿霉素的临床管理涉及到静脉丸注入剂量介于15和90毫克/米2,从而导致等离子体浓度从0.3到5μ米(16]。我们的研究结果表明,24小时治疗5μ米的阿霉素导致显著降低mda - mb - 231细胞的可行性chemoresistant癌细胞(图3),但是当这个浓度下降极限的临床相关的剂量范围内,我们旨在使用低剂量仍落在这个临床相关的范围。基于这些结果,以及2.5的事实μ米落在阿霉素的临床相关的剂量范围内,在这项研究中,我们使用2.5μ所有后续的阿霉素治疗。
(一)
(b)
Per2蛋白表达是沉默与阿霉素为了确定chemoresistant mda - mb - 231强力霉素治疗的癌症细胞可以激活的。沉默效率达到98.5%癌症mda - mb - 231细胞后30 nM esiRNA治疗(图48小时4(一))。MTT检测显示显著减少线粒体仅还原能力与强力霉素治疗后,这是进一步加强与Per2沉默之前,阿霉素治疗(图4 (b))。这些结果进一步支持通过流式细胞术在Per2沉默之前,阿霉素治疗的敏感性显著增加mda - mb - 231细胞癌细胞Dox-induced死亡(图4 (c))。
(一)
(b)
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如细胞周期调控的控制下被认为是生理基因,使用流式细胞仪细胞周期分析评估,以确定Per2沉默的影响细胞通过细胞周期进展的能力。我们的研究结果显示,Per2独自沉默导致G0 / G1细胞周期阻滞而Per2沉默与阿霉素导致逮捕s阶段的细胞周期与细胞凋亡显著增加(图5)。此外,G2 / M过渡分析使用共轭主磷酸化抗体组蛋白H3 (Ser10(刺)和磷酸化极光288年)/ Aurora B(刺232年)/极光C(刺198年)评估,为了区分在间期细胞,早期的有丝分裂,有丝分裂后期。我们的结果显示一个转变,从早期的有丝分裂以及完整的结束阶段有丝分裂削弱单独使用阿霉素治疗以及结合Per2沉默(图6)。
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(d)
评价机制Per2沉默增加mda - mb - 231细胞死亡的癌症细胞,我们评估的乳沟凋亡标记caspase-3 poly-ADP-ribose聚合酶(PARP)和免疫印迹的使用。一旦caspase-3裂解和还存在由上游激活半胱天冬酶级联,凋亡细胞死亡。大幅提高裂解caspase-3(图7(一))和裂解PARP水平观察后Per2独自沉默以及结合强力霉素治疗。已知阿霉素诱导细胞死亡通过caspase-3依赖机制从而增加caspase-3乳沟对应PARP乳沟的增加观察阿霉素治疗后(图7 (b))。
(一)
(b)
4所示。讨论
所有有核细胞已被证明具有内在的生物钟,它被认为在细胞自动时尚、自我维持的节奏明显的振荡在分离细胞培养模型17]。因此,本研究的第一部分旨在阐明有节奏的表达模式的存在的生理Per2蛋白质在正常乳腺上皮细胞系(MCF-12A)和雌激素受体阴性(ER−)细胞株(mda - mb - 231)(图1)。据我们所知,第一次表现出明显的昼夜模式Per2蛋白质表达在正常MCF-12A细胞以及mda - mb - 231 ER -癌细胞的存在。
两个不同的亚种群的细胞表达Per2蛋白观察在正常乳腺上皮细胞MCF-12A和mda - mb - 231乳腺癌细胞腺癌。在荧光衰减器和光明的亚种群,Per2被认为主要位于细胞质内(图2)。Colocalization Per2在细胞核的荧光衰减器的亚种,只看到两个细胞系。这些结果与已知文献的细胞质和核本地化Per2被肾脏呈COS7细胞线(18]。此外,Per2蛋白表达模式的差异在不同人群的mda - mb - 231肿瘤细胞突出外周生物钟的异步本性以及癌细胞群体的异质性(19]。的核本地化Per2只有细胞质蛋白表达下降有关也可能被解释成这一事实Per2细胞质中蛋白质含量开始积累翻译后在昼夜的一天的开始20.]。Per2蛋白质含量达到阈值水平的生理的一天,在那里他们二聚化和积累蛋白质和长江基建哭泣ε;这个复杂的然后把原子核的镇压导致Per2基因转录。一旦压抑,释放胞质Per2由长江基建磷酸化ε,导致其26 s蛋白酶体降解途径,从而导致细胞质Per2减少蛋白质含量和重置的生物钟21]。
Per2基因是一个重要的哺乳动物生物钟系统的监管机构,并在已确定这种基因突变引起广泛的人类癌症包括结肠癌和乳腺癌[22]。此外,昼夜Per2中断与细胞周期紊乱和细胞凋亡,细胞周期的异常明显的节奏表达基因,细胞周期蛋白D1,以及消极的p53调节器,MDM2 [23]。基于这方面的知识,然后,我们专注于Per2作为抗敏感的分子目标强力霉素治疗的乳腺癌细胞。
临床相关,我们表明,低剂量的2.5μ米阿霉素本身并不是很有效诱导细胞死亡的mda - mb - 231细胞,明显的轻微减少MTT还原能力和膜完整性的损失,有效地证明这些癌症细胞的弹性性质(图阿霉素治疗3)。我们的结果也表明,沉默Per2强力霉素治疗之前,对mda - mb - 231肿瘤细胞对阿霉素的细胞毒性效应变得更加敏感,MTT还原能力和膜完整性在这些细胞相比,显著降低阿霉素治疗(图4 (b))。这些结果进一步支持显著增加caspase-3和PARP乳沟联合治疗(图7)。这些结果对别人是有些矛盾的,这显示增加细胞死亡的超表达Per2 MCF-7乳腺癌细胞(9]。这可能部分是由于这一事实凋亡和细胞周期过程显示出旺盛的生理组织中bcl - 2这样的蛋白质的表达模式和伯灵顿是有节奏的生理控制。bcl - 2 /伯灵顿的节奏表达模式已被证明最终影响化疗药物的抗肿瘤疗效和毒性,如多烯紫杉醇,很大程度上依赖于细胞周期的生理阶段(24]。此外,它似乎是合理的,代偿机制的存在是为了抵消Per2蛋白表达减少。Bmal1的积累造成的损失Per2s抑制作用可以解释我们观察到的细胞死亡的增加,过度的Bmal1被证明能增加铂的敏感性在体外和在活的有机体内(25]。
显著增加在G0 / G1期,相应减少在G2 / M细胞周期阶段被认为与Per2沉默,而Per2沉默和强力霉素治疗的结合导致了细胞在s阶段退出细胞周期;这导致显著减少在G2 / M期细胞凋亡(图相应增加5)。G2 / M细胞周期过渡评估,为了进一步获得细胞周期数据,特别是在有丝分裂。组蛋白H3磷酸化的爵士10残留的凝结与染色体在有丝分裂期间(26),而极光激酶的磷酸化(A、B和C)与各种功能在有丝分裂期间,其中包括但不限于有丝分裂纺锤体的形成,染色体分离和胞质分裂27]。这些激酶的功能影响因此跨度从一开始的G2期对有丝分裂的结束。此外,在G2 / M细胞周期过渡组蛋白H3磷酸化是紧密耦合的极光激酶的表达(28]。因此,细胞染色阳性p-Histone H3 (Ser10)和p-Aurora(刺288年)/ Aurora B(刺232年)/极光C(刺198年)表明细胞是真正的有丝分裂和发展在整个细胞周期(有丝分裂后期阶段),而染色阳性的磷酸化极光激酶表明早期有丝分裂细胞。Per2沉默导致明显降低后期有丝分裂以及早期的有丝分裂;然而,减少早期的有丝分裂并不那么严重,与阿霉素治疗(图6)。Per2沉默和阿霉素也导致一个完整的早期和晚期的抑制有丝分裂。我们的结果支持这一概念Per2可能参与调节细胞周期进展,建议在文学,和这种机制可能是由Per2细胞周期蛋白D1和的影响原癌基因表达式[12]。然而,当我们没有评估的表达这些关键G0 / G1细胞周期调控Per2沉默,这仍然有待阐明。
共同遗传调制的结果Per2证明的抗乳腺癌mda - mb - 231细胞对阿霉素治疗有效地废除通过内在的生物钟系统的破坏。45的抑制kDa Per2蛋白质通过有针对性的esiRNA方法,上下文中的Dox-induced细胞死亡,导致细胞周期阻滞的乳腺癌mda - mb - 231细胞,顺便还能增加细胞凋亡。这些发现支持已知的临床数据,强力霉素的药理功效和毒性是深刻的内在协调的昼夜节律(29日),展示其临床相关的影响。
此外,作为异常Per2表达式(30.和阿霉素31日)已被证明诱导细胞衰老的基因毒性压力,我们建议后诱导的凋亡敏感的乳腺癌mda - mb - 231细胞对阿霉素的细胞毒性效应可能在一定程度上由有丝分裂灾难后细胞衰老。然而,背后的潜在机制抗衰老引起的细胞死亡在乳腺癌细胞值得进一步调查。
总之,我们的结果表明有影响力的角色Per2在最重要的生理功效和毒性化学治疗剂用于癌症的治疗。未知的和高度小说大道的生物钟基因,包括Per2辅助癌症目标需要进一步调查。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作是由研究经费来自国家癌症协会研究基金会和南非。