甲苯噻嗪的药物滥用及其对活性物种的生成的影响,在人类脐静脉内皮细胞的DNA损伤

文摘

人类甲苯噻嗪(XYL)滥用成瘾已收到极大的兴趣由于其潜在的毒性作用对吸毒者和需要了解的作用机制与潜在的健康影响。XYL是一种α- 2受体激动剂限制兽医应用程序,没有人类的医学应用。我们以前的工作表明,XYL及其结合可卡因(COC)和/或6-monoacetylmorphine (6-MAM)通过凋亡诱导细胞死亡的机制。本研究的目的是确定的影响的一代甲苯噻嗪活性氧(ROS)和活性氮物种(RNS)以及内皮细胞DNA损伤。人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)处理XYL (60μCOC(160米)μ6-MAM(160米)μ50米),喜树碱(积极的控制,μ米),XYL / COC (50μ米),XYL / 6-MAM (50μ米),XYL / COC / 6-MAM (40μ米)的24小时。一代的细胞内ROS、RNS和使用荧光测定DNA碎片进行了分析。结果表明,XYL 6-MAM增加活性氧的水平;没有观察到感应RNS的生产。这些药物的组合显示显著增加DNA碎片在G2 / M期,而XYL COC, 6-MAM,没有结合,提供更高的DNA碎片在G0 / G1期。这些发现支持这些药物及其组合改变重要的生化事件与HUVEC的凋亡的作用机制。

1。介绍

药物滥用的习惯性地掺入其他物质来提高或降低最终产品的影响以及增加药物的价值当在街上卖1]。报道了这方面的证据掺假费城法医办公室,说明检测XYL与芬太尼,2006年4月至2006年8月,在后期样品相关药物中毒(2]。这种组合是剧毒,因为这两种药物抑制中枢神经系统。XYL与可乐定的α2受体激动剂的作用机制,导致心动过缓和瞬态高血压低血压紧随其后。去甲肾上腺素释放的阻塞引起镇静和减少心输出量(2,3]。同时芬太尼,这是类似于海洛因(她,阿片类药物),在它的作用机制(μ)受体激动剂,使镇静,低血压,抑郁症和呼吸2,4,5]。XYL的药理作用和她的混合物可以诱发抑郁症严重的中枢神经系统和呼吸系统,被认为是一个致命的组合。的组合,XYL和COC可以诱导瘾君子使用高剂量,因为COC最初产生中枢神经系统兴奋,推迟XYL和她的影响(6,7]。XYL海洛因掺杂物或替代品的使用增加了自2004年以来在波多黎各和其他国家报告(8- - - - - -13]。

静脉途径是主要的给药途径为海洛因或XYL吸毒者,被强烈的涉及人类中毒案件在美国(2,3,10,12,14- - - - - -16]。在这种情况下,有人建议,一旦XYL获得进入血管系统,它分布在血液灌注靶器官如心脏、肺、肝脏和肾(17]。进入身体,海洛因或二乙酰吗啡立即脱去乙酰基进入血液,生产6-MAM (6-monoacetylmorphine、海洛因代谢物)。6-MAM很容易穿过血脑屏障,最终产生铁道部脱去乙酰基,进而是受体激动剂。在这个分布,血管内皮细胞接触XYL可以体验毒性作用。类似的分布预测发生在结合COC和6-MAM(海洛因代谢物)。内皮细胞是参与血液和组织之间的交换的代谢物。除了他们的角色在血液内稳态和伤口愈合18,19],他们扮演着重要的角色在调节人体正常生理和病理生理学。几种药物的滥用,如XYL COC,和她,可能是针对他们的内皮细胞毒性和打扰它们的功能。

生理过程,包括血管张力调节,促有丝分裂的信号,并且宿主防御需要参与活性氧和氮物种(ROS / RNS) (20.]。尽管如此,不成比例的ROS / RNS生产可能会影响细胞信号等生化过程,蛋白质,脂类物质DNA和可能损害,因此打断正常的功能。这些活性物种(ROS / RNS)包括生物系统相关物种的多样性,如超氧化物阴离子、过氧化氢、氢氧自由基和过氧亚硝基21- - - - - -23]。这些物种的几个非常被动,而另一些则更稳定。细胞内活性氧的生产/ RNS可能不完整的过程,如酶系统的产品(例如,NADPH氧化酶类(NOX1))和氧气减少电子传递链(22,23]。这些活性物种在免疫系统的重要作用,参与信号转导途径,内部或细胞外信号分子和转录调控21]。肠上皮细胞等免疫细胞也产生ROS / RNS,大量的超氧化物阴离子是由NOX1,甲状腺氧化酶(DUOX2),和黄嘌呤氧化酶(6]。因此持续高水平的ROS / RNS可能引发严重的氧化应激,产生损伤的组织,这可能诱发疾病,如风湿性疾病、动脉粥样硬化和糖尿病(5]。炎症和增加ROS水平也与心血管疾病的发病机制24]。

我们之前的研究表明XYL使用单独或结合COC和/或6-MAM减少EA.hy926细胞增殖和诱导细胞凋亡(HUVEC) [25]。细胞凋亡过程可以由氮气和氧气反应物种的增加产量。最近的研究还指出,高剂量的吗啡诱导细胞凋亡是通过RNS和ROS介导的通路(26]。目前的研究调查的关系这些药物生产活性物种。我们旨在确定存在的DNA碎片,ROS和RNS生产,与XYL EA.hy926细胞治疗,COC, 6-MAM及其组合。

2。材料和方法

2.1。股票的解决方案和试剂

试验药物股票的解决方案准备3毫米的乙醇浓度为70%,从西格玛奥德里奇(圣路易斯,密苏里州)。股票的解决方案是在无菌玻璃小瓶和储存在4°C。积极的控制,一个已知的细胞凋亡诱导物,喜树碱,可卡因,和甲苯噻嗪从西格玛奥德里奇获得;海洛因代谢物(6-monoacetylmorphine)获得Cerilliant公司(圆石头,德克萨斯州)。试剂氢氧化钠(氢氧化钠),2′,7′二氯荧光素二乙酸(DCFH-DA),和2,3-diaminonaphthalene(丹)从西格玛奥德里奇(圣路易斯,密苏里州)。股票的解决方案DCFH-DA准备在10毫米的浓度二甲亚砜(DMSO)生物技术等级,从西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州股票的解决方案是在无菌玻璃小瓶和储存在4°C。DNA碎片化试剂,4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI),是来自Chemometec (Allerød、丹麦)。

2.2。仪表

伯爵夫人自动细胞计数(表达载体,卡尔斯巴德,加州)是用于细胞量化。分析了DNA碎片使用NucleoCounter nc - 3000血细胞计数分析(Chemometec、Allerød、丹麦)的仪器。使用fluorostar ROS和RNS活化分析最适条件(BMG, Ortenberg,德国)荧光读者。

2.3。细胞培养

本研究中使用的细胞系人类脐静脉内皮细胞株Ea.hy926,请Cora-Jean s Edgell博士提供的,从北卡罗莱纳大学教堂山分校(UNC)。细胞在DMEM培养基培养(写明ATCC,马纳萨斯,弗吉尼亚州)与10%胎牛血清(写明ATCC,马纳萨斯,弗吉尼亚州)27,28]。这些文化都是维持在37°C和5%的公司₂(29日]。细胞生存能力决定了伯爵夫人自动细胞计数;一旦达到细胞融合他们的亚文化,在24小时内处理。

2.4。细胞治疗

EA.hy926细胞是亚文化和保持在一个密度每3.5毫升的细胞培养基+添加剂在25厘米²烧瓶,以确保稳定的代谢状态和指数增长。与药物治疗方案及其组合准备新鲜培养基稀释。细胞受到24小时车辆(阴性对照组,160l)和药物测试近似IC₅₀(之前的计算26):XYL (60COC(160米)6-MAM(160米)米)、喜树碱(阳性对照组,50米),XYL / COC (50米),XYL / 6-MAM (50米),XYL / COC / 6-MAM (40米)。6-MAM受雇而不是她,因为一旦在血液中的她立即转换为6-MAM。

2.5。代的活性氧

使用2 ROS生成进行了测定,7-dichlorofluorescein二乙酸(DCFH-DA),所述Gutierrez-Praena et al。(2012)和公园et al。(2007)30.,31日]。ROS的产生是24小时治疗后评估在96 -微型板块。当DCFH-DA扩散穿过细胞膜,细胞内酯酶水解nonfluorescent化合物(DCFH),在活性氧存在极其迅速氧化荧光DCF,活性氧产量成比例。药物治疗后,细胞被收获,与200年孵化l (20M DCFH-DA在介质为30分钟37°C,用磷酸缓冲盐(PBS)洗净,resuspended在200年PBS的l。细胞被转移到96孔酶标和分析。DCFH-DA荧光探针转化为DCF (32)揭示了活性氧水平绿色荧光的发射波长535 nm和激发波长为485 nm)使用fluorostar最适条件(BMG, Ortenberg,德国)荧光读者。(百分比,%)结果显示为负控制标准化。

2.6。代的活性氮物种

分析了代RNS的实现2,3-diaminonaphthalene(丹)根据Misko等方法执行。克莱因亨茨(1993)和用et al。(2003)33,34与一些细微的修改。总之,丹是盐酸溶解在0.62 N浓度为0.05毫克/毫升。药物治疗后,并将回收的上层清液离心机在2000 g 2分钟。85年这些上层清液(整除l)放入96 -孔板(一式三份),结合丹(10l)和孵化15分钟37°C。15分钟后,5l (2.8 N氢氧化钠被添加到每个。样品进行了分析使用在360纳米荧光激发和发射在440 nm fluorostar最适条件(BMG, Ortenberg,德国)荧光读者。

2.7。DNA碎片分析

确定使用的DNA碎片作为细胞凋亡的药物毒性评价指标。这个试验措施细胞DNA包含小于1当量(Sub-G1) DNA降解后引发的内切酶(35]。药物治疗后细胞收获和执行先前描述的条件下,与70%乙醇固定,孵化24小时在4°C, 500沾l (1g / ml DAPI和孵化5分钟,根据制造商的规格,并分析了通过图像分析NucleoCounter nc - 3000仪器。

2.8。统计分析

评估意义中观察到的变化在细胞暴露在测试药物,单向方差分析与图基事后测试执行,被认为是重要的。这与图垫棱镜软件进行统计分析(版本5.03)。结果提出了的意思6 - 9复制的SD,从2到3实验。

3所示。结果

3.1。氧化应激化验的结果

当EA.hy926细胞暴露在XYL与6-MAM以前描述浓度,ROS含量显著提高(图1),与对照组相比。另外ROS含量XYL对待文化积极的控制(喜树碱)相比显著增强。喜树碱是一种已知的细胞凋亡诱导物,拓扑异构酶I和II抑制剂,DNA插层剂,氧化应激诱导物(36- - - - - -42]。相比之下文化对待COC提出减少代ROS相比,积极控制。此外EA.hy926细胞暴露于XYL结合COC和/或6-MAM,显示ROS含量明显减少,与阴性对照组相比(图1)。

3.2。RNS测定分析的结果

评估测试药物对RNS总产量的影响,其中包括亚硝酸盐和硝酸盐的物种,是使用丹执行分析(34]。结果表明,EA.hy926细胞暴露于XYL, COC, 6-MAM及其组合显示没有明显的一代的RNS(图2相比),与消极的控制。显然RNS内容积极控制相比显著降低(喜树碱)。自未发现显著变化的RNS生产、量化的硝酸盐和亚硝酸盐释放内皮细胞并没有执行。

3.3。DNA碎片化验的结果

当EA.hy926细胞暴露在XYL、COC和6-MAM及其组合在前面描述的浓度,不同阶段之间的DNA碎片内容G0 / G1, G2 / M被观察到。G0 / G1期显示DNA碎片显著差异(暴露于XYL结合COC)细胞。细胞暴露于XYL、COC和6-MAM提出更高的显著差异()。细胞治疗XYL与6-MAM呈现明显的DNA碎片水平()。细胞治疗XYL与6-MAM呈现明显的DNA碎片水平()。细胞治疗相结合的三种药物没有显著差异(ns,)(数据3(一个)和3 (b))。细胞治疗XYL呈现在G2 / M期无显著差异(ns)的DNA碎片。与此同时细胞治疗当天呈现显著差异()的DNA碎片与阴性对照组相比。

4所示。讨论

我们的研究揭示了影响XYL、COC 6-MAM及其组合的氧化物种代EA.hy926细胞治疗。接触XYL与6-MAM实验注明生产ROS浓度显著高于消极的控制和与积极的控制(喜树碱)。吗啡(铁道部)也可以通过增加细胞凋亡ROS的产生和细胞内氧化应激在肝细胞,巨噬细胞,肾小球系膜细胞(43- - - - - -48]。ROS典型的细胞凋亡机制涉及受体激活,线粒体功能障碍,因此半胱天冬酶激活蛋白bcl - 2家族等。之前研究显示HUVEC对待铁道部提出了线粒体膜电位的损失(MMP),触发凋亡过程中(49]。增强代超氧化物阴离子通过铁道部在高剂量,损害血管内皮功能,也确定了。活性氧的生产被广泛承认是负责一个重大影响内皮功能障碍(50]。这个条件相关的疾病,如高血压、糖尿病、血管炎、老化、系统性和皮肤损伤17,51- - - - - -53]。屏障功能也受到ROS和RNS的影响,它促进内皮细胞单层通透性的增加(54]。

这项工作表明,XYL与COC的结合和/或EA.hy926 6-MAM具有抗氧化作用,因为细胞接受这种药物组合提出了减少ROS形成相比,消极的控制。减少氧化应激在这些药物组合的存在表明,这些分子可能一次“清道夫”效应相结合(中和自由基的能力)。先前的研究证明了海洛因、铁道部、COC,抑制脂质过氧化作用及其组合在线粒体分离大鼠大脑,呈现“清道夫”效应(55]。这个拾荒者效应可能是由于抑制NADPH氧化酶、CYP450的最大来源之一自由基和脂氧合酶(56]。我们的结果与先前的研究一致。

COC,此外本研究表明XYL 6-MAM,和他们的组合没有影响一代RNS生产或一氧化氮(no)版本,这意味着RNS的基准面EA.hy926没有打扰。COC效应相关研究报道明显降低没有释放的牛冠状动脉内皮细胞(BCAECs) [57];然而这种效应并没有观察到在这个研究。之前的研究对于吗啡效应决定,以至于没有发布在HUVEC高剂量等10⁵纳米(1毫米)20.,21]。他们的研究结果显示增加生产,然后降低MMP在HUVEC铁道部对待。(在这个剂量吗啡)刺激没有生成,导致MMP的减少,因此细胞凋亡。我们的研究使用较低浓度处理6-MAM(前体的吗啡代谢物)160M(0.16毫米),诱导RNS生产没有被观察到。文献综述表明,吩噻嗪或XYL尚未涉及EA.hy926 RNS生产的感应细胞,巨噬细胞、单核细胞(58]。没有感应RNS生产表明,另一个途径可能参与EA.hy926细胞死亡XYL处理时,COC, 6-MAM,他们的组合。

DNA碎片测定和关联到每个细胞周期阶段。在G1期细胞进入细胞周期,紧随其后的是DNA复制在S期(59]。在G2期,两个进程发生:DNA修复和准备有丝分裂(M)。有丝分裂期后,两个路线;细胞可以进入G1或G0(不活跃的阶段)。细胞周期检查点仔细调节进入细胞周期的每个阶段(46,47]。DNA损伤检查点在G1期细胞周期发生晚,抑制进入S期,在G2,避免通过有丝分裂。一个家庭的蛋白质激酶调节检查点控制系统。DNA损伤是引起下游影响线粒体膜的去极化和激活的效应还存在是最可能的事件表明细胞死亡的凋亡通路(59,60]。DNA碎片在G2 / M期细胞凋亡有关,DNA加合物的形成,细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk)和蛋白质磷酸酶Cdc25C(原癌基因)抑制[59- - - - - -62年]。等调查已经证明DNA有害DNA拓扑异构酶I和II抑制剂,烷基化化合物,或辐射可能引发p34cdc2激酶活性的抑制。这些代理之一是阿霉素(阿霉素),其作用机理产生逮捕在G2 / M期,DNA损伤的频率增加,抑制p34cdc2激酶。也已经发现,DNA双链断裂和p34ı2抑制激酶活性,由阿霉素引起的,是相关(61年]。

这符合观察到影响EA.hy926细胞接受XYL, COC,和6-MAM XYL结合COC,显示重要的DNA碎片在G0 / G1期。同时细胞接受这些药物的结合提出了重要的DNA碎片在G2 / M期。DNA碎片在这两个阶段,G0 / G1和G2 / M,凋亡相关过程(59,61年,63年- - - - - -65年]。

5。结论

本研究报告主要XYL及其结合COC的毒性作用和/或6-MAM EA.hy926细胞系,人类脐静脉内皮细胞。我们的结果表明,影响XYL与6-MAM类似喜树碱引起的(积极的控制),当他们的ROS归纳比较。药物组合的影响引起的类似COC孤独,像拾荒者。关于感应RNS的生产,所有药物及其组合显示没有影响。同时分析的DNA碎片影响被观察到两组(细胞周期阶段)。细胞治疗XYL、COC 6-MAM ()和XYL结合COC ()提出了更高的DNA碎片在G0 / G1期相比,消极的控制。细胞治疗XYL与6-MAM也呈现显著差异()。药物组合提出更高的DNA碎片在G2 / M期相比,消极的控制。这些研究结果表明,两种不同的机制存在,相互作用不同的细胞周期检查点。

总之,诱导活性氧的生产可能与DNA在细胞分裂和细胞凋亡过程处理甲苯噻嗪和6-monoacetylmorphine而ROS和RNS生产不相关的DNA碎片或细胞凋亡过程中细胞治疗可卡因和三种药物的组合。这表明存在两种机制的行动,一个可卡因作为清道夫,但导致DNA损伤的另一个未知的途径。可卡因结合XYL和/或6-MAM增强清道夫的效果没有抑制DNA碎片。这些交互仍然未知,应该详细研究。这是第一个研究XYL影响人类内皮细胞由于使用这种物质的药物滥用。XYL只有被批准为兽医应用程序,从而对人类细胞的影响尚不清楚。参考相关研究的缺乏XYL对人类的影响使得结果的相关困难。

理解甲苯噻嗪引起的毒性机制,结合快速度球类运动(可卡因和海洛因的混合物)对内皮细胞允许我们想象可能的多种不利影响。这些发现有助于理解用户的潜在的健康影响甲苯噻嗪(独自)及其结合可卡因和/或6-monoacetylmorphine(海洛因代谢物)。卫生专业人员可以开发特定的治疗可能解决这个特定的组织损伤和它的后果。此外,医生可以提防这些影响和潜在的可以推荐这解毒治疗可用于吸毒者人口;管理可能涉及高灌注器官如肝脏和肾脏功能障碍。这些新见解的细胞影响这些药物可以使临床医生更新程序处理甲苯噻嗪及其组合的影响。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突的存在。

确认

作者感谢Coral-Jean s Edgell博士的EA.hy926细胞系的慷慨的捐赠。也谢谢史蒂夫Oglesbee博士,主任组织文化设施(TCF)和尼克Shalosky(高级TCF专家),北卡罗莱纳大学教堂山分校科技发展办公室(定单计划),Lineberger综合癌症中心,31 - 318 Lineberger CB7295, 450西开教堂山,数控。他们欣赏尼克Shalosky Ea.hy926指导特定的细胞培养的细胞系。这个研究项目的部分实现Luz Silva-Torres博士论文论文。这个项目是支持由国家研究资源中心(5 p20gm103 RR016470-12)和国家综合医学科学研究所(8 P20 GM103475-12)来自美国国立卫生研究院。

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