条件培养基修复海马神经元对海人酸诱导会:一个在体外研究

文摘

干细胞疗法正在关注作为神经退行性疾病的一种很有前途的治疗选择。移植细胞的功能功效是一个有争议的问题,最近的共识是,细胞和功能恢复可能是因为“围观者”移植细胞的影响。在目前的研究中,我们调查的神经保护效应条件培养液(CM)来自人类胚胎肾细胞(HEK)在海人酸(KA)诱导海马退化模型系统在体外条件。海马细胞系被暴露在KA (200µ米)24小时(病变组)然而,在治疗组中,海马细胞系被暴露在KA结合HEK-CM (KA + HEK-CM)。我们观察到KA接触细胞导致大量神经元的损失。有趣的是,HEK-CM cotreatment完全减毒excitotoxic KA的影响。在HEK-CM cotreatment组织细胞生存能力~ 85 - 95%而不是47%仅在卡组。进一步调查表明,治疗HEK-CM刺激内源性细胞生存因素,如脑衍生神经营养因子(BDNF)和bcl - 2抗凋亡因子,揭示了可能的神经保护机制。我们的研究结果表明,HEK-CM保护海马神经元免受会通过刺激宿主内源性细胞生存机制。

1。介绍

谷氨酸介导的会是一个常见的神经元死亡的机制在神经退行性疾病如阿尔茨海默病(1,2]。目前,没有明显的治疗神经退行性疾病和药物实际上只提供救济和症状不缓解疾病的进展。因此,迫切需要开发替代性的治疗策略,可以防止进行性神经损失中观察到神经退行性条件。在这个角度看,几项研究已经显示的有利影响细胞疗法在预防神经损失和扭转行为障碍在神经退行性病变动物模型(3- - - - - -6]。然而,移植细胞的功能疗效仍然是一个有争议的问题和畸胎瘤的形成和免疫排斥的可能性在细胞疗法的主要障碍。然而,普遍的观点是宿主组织再生可能是嫁接所赋予的“围观者”效应细胞释放各种营养因素,反过来,激活宿主内源性修复机制(7,8]。在这种背景下,条件培养液(CM)从细胞培养获得包含一个数组的神经营养因子和细胞因子有可能治疗神经疾病和神经退行性疾病(9- - - - - -11]。

人类胚胎肾细胞系(HEK)广泛用于病毒转染治疗蛋白的研究和生产制药公司。HEK细胞包括高的好处在体外扩张和容易维护和异构的细胞包括神经元(12]。重要的是,HEK条件培养液(HEK-CM)富含一些生长因子(13,14]。然而,到目前为止,HEK-CM的神经保护能力本身对会没有评估。在目前的研究中,我们调查的神经保护效应HEK-CM对海人酸(KA)诱导的神经退化在体外模型系统。我们的研究结果显示,HEK-CM带来显著的神经保护对KA诱导会通过刺激宿主的修复机制通过upregulation BDNF和bcl - 2细胞的生存因素。

2。材料和方法

2.1。H3和HEK-Cell文化

产后第一天的H3海马细胞系生成海马ts A58转基因小鼠(15)是用于这项研究。这个细胞株是一个慷慨的礼物博士Mitradas恐慌,国家生物科学中心,印度班加罗尔。H3细胞系的特征(16)和像neurofilament-L表达神经元标记所示,微管相关protein-2,巢蛋白。的H3在高葡萄糖DMEM培养基培养细胞(美国加州表达载体,卡尔斯巴德)含10%胎牛血清(的边后卫)(Hyclone,热科学,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国),1%谷氨酰胺(表达载体,卡尔斯巴德,加州,美国),和1% penicillin-streptomycin(美国加州表达载体,卡尔斯巴德)和维护公司的5%₂。同样,HEK 293 - t细胞(一种慷慨的礼物Anujith Kumar博士,再生医学学院印度麦利普大学、印度)被用于获取条件培养基。HEK 293 - t细胞生长在高葡萄糖DMEM培养基与10%的边后卫,1%谷氨酰胺,1%不重要的氨基酸(表达载体,卡尔斯巴德,加州,美国),和1% penicillin-streptomycin和维护公司的5%₂240年(赫拉电池有限公司₂孵化器,热科学,美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。confluency预备役70 - 80%,HEK 293 - t培养基收集指定为条件培养液(CM)整除,储存在−80°C,直到进一步使用(赫拉冻结,热科学、卡尔斯巴德,加利福尼亚,美国)。

2.2。神经退化和HEK-CM治疗

海人酸(KA;Tocris,英国布里斯托尔)是用作excitotoxin在目前的研究。海人酸溶解在0.1 M磷酸缓冲溶液(PBS)的浓度为1毫克/毫升。诱导的神经退化、H3文化被暴露在KA剂量从50μM - 200μ24小时。基于剂量标准化研究中,我们观察到200μM ~ 60%引起的KA细胞损失,因此我们选择这个剂量目前研究。H3在96孔板的细胞被镀(2000细胞/),confluency达到80%,细胞暴露在新鲜培养基含有200μ米卡(KA病变组)24小时。的条件培养液治疗组(KA + CM组),包含200年的培养基是HEK-CM取代μ米卡和孵化24小时。作为控制的一个幌子,H3细胞培养基是取代HEK-CM (CM组)和同等体积的无菌添加了PBS代替KA。正常对照组(NC)没有接受任何治疗。

2.3。形态学评估

研究HEK-CM治疗对H3细胞的形态学的影响,数字化图像不同治疗组的细胞培养H3被捕三个不重叠的领域使用相差显微镜(尼康Eclipse TE 200年代、Chiyoda-Ku、日本)和定性研究了细胞形态结构改变细胞体,探明,细胞相互连接。

2.4。细胞密度量化

H3细胞不同治疗组与核染色荧光染料染色4′,6-diamidino-2-phenylindole盐酸盐(DAPI)稀释在无菌0.1 PBS和孵化在室温下5分钟。孵化后,这些细胞被洗了三次PBS和数字化图像捕获使用荧光显微镜(Chiyoda-Ku尼康Eclipse TE 200年代,日本)加上Q-Imaging相机。q capture Pro 6.0软件被用来获取图像和DAPI的数量⁺细胞是量化使用图像J软件(美国国家卫生研究院的1.46版本)。

2.5。流仪分析细胞凋亡

的凋亡效应HEK-CM被流仪评估。简而言之,H3细胞(2×10⁶细胞)和PBS洗清除残骸和trypsinised trypsin-EDTA 0.25%解决方案(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)。Trypsinised细胞离心机在1800 rpm(贺利氏Microfuge,热科学,卡尔斯巴德,加利福尼亚,美国)5分钟,上层清液吸气和900年μL 95%的冰冷的乙醇添加到小球在一滴一滴地方式来避免细胞聚集。细胞在4°C和95%乙醇固定24小时跟着几个洗PBS和1(50毫升的染色的解决方案μL(碘化propidium股票的解决方案(1毫克/毫升)和50μL核糖核酸酶的一个股票的解决方案(1毫升/ mg))被添加到每个样本在黑暗和孵化37°C 30分钟。孵化后,流式细胞仪(美国加州BD流式细胞仪口径,BD生物科学)进行了数据分析利用BD细胞追求Pro, 5.2版本;BD生物科学,加州,美国。

2.6。免疫细胞化学

了解神经保护的分子机制,细胞从不同的治疗组和4%多聚甲醛固定15分钟在4°C。细胞被洗两次与0.1 PBS和permeabilized triton - x - 100为0.1%在室温下15分钟。在PBS几个洗之后,细胞被孵化的阻断缓冲区(3%牛血清白蛋白在PBS) 30分钟在室温和与主要孵化单克隆抗体脑衍生神经营养因子(BDNF) (1: 200;杂种细胞发育研究银行,美国爱荷华州)一夜之间在4°C。第二天,细胞被洗了几次在二级抗体0.1 PBS和兔子anti-mouse共轭Alexa萤石568(生活技术,美国)稀释的抗体稀释剂添加比例1:200和孵化在室温下1 - 2小时。0.1 PBS的细胞被洗两次5分钟每一滴不变色安装中添加覆盖下滑,用于显微分析。脑源性神经营养因子的免疫染色与负控制并行执行,也就是说,没有主要的抗体。显微图像捕获和纠正的量化总细胞荧光(CTCF) [17]进行了使用图像软件(美国国家卫生研究院的1.46版本),表示为褶皱变化对正常控制。

为了进一步阐明HEK-CM的可能机制保护神经元免受会,中和抗体对脑源性神经营养因子添加到HEK-CM (HEK + CM与anti-BDNF组)和细胞生存能力被MTT法评估。对这一点,H3细胞培养96年井镀和confluency大约80%的增长。随后,细胞治疗与HEK-CM (CM组),海人酸(KA组),红藻氨酸和HEK-CM (KA + CM组),红藻氨酸和HEK-CM anti-BDNF (HEK + CM与anti-BDNF组)24小时5%股份有限公司₂孵化器。后,细胞被洗在PBS和孵化MTT试剂(5毫克/毫升,西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)为4个小时,直到一个紫色沉淀形成。接下来,沉淀溶解了10μL(二甲亚砜(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国),光密度测量使用维克多在560海里³multilabel板读者(美国珀金埃尔默)。作为一个空白的控制,三个井只有培养基+ MTT使用。

2.7。逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)

作为BDNF bcl - 2诱导凋亡等因素的表达,我们估计的mRNA表达bcl - 2 H3细胞后不同治疗方法。估计bcl - 2 mRNA的表达,RNA提取(试剂盒,表达载体的生活技术,美国)和纯度/ RNA浓度估计使用纳米降nd - 1000分光光度计(美国特拉华州威尔明顿Nanodrop Technologies Inc。)。利用RNA,互补脱氧核糖核酸合成和PCR扩增(GeneAmp PCR系统9700,应用生物系统公司,促进城市,加利福尼亚,美国)按照标准协议进行了40周期使用成本则高达55 -°C退火温度。G3PHD作为内部控制。以下引物被用于这项研究:G3PDH(转发:5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′,相反:5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′), bcl - 2(转发:5′CACCTGTGGTCCACCTGAC3′,相反:5′ACGCTCTCCACACACATGAC3′)。放大PCR产品被α成像仪凝胶凝胶电泳和可视化文档系统(α成像仪凝胶文档,αInnotech,圣莱安德罗,加利福尼亚,美国)。

2.8。统计分析

三个独立的实验进行了一式三份的细胞密度分析、免疫细胞化学和MTT试验。两个独立的实验进行了流式细胞分析仪和rt - pcr分析。所有数据都表现为±SEM手段。统计不同治疗组之间比较,方差分析的一种方法随后Newman-Keuls多重比较测试和使用被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。HEK-CM治疗提高了H3细胞的形态

调查对KA HEK-CM诱导的神经保护效应会引起,H3细胞暴露在KA (200μ米)或结合HEK-CM (KA +厘米)为24小时。后,细胞培养图像获得三个不重叠的领域和H3细胞的形态学特征进行定量分析。海人酸接触H3细胞导致神经突显著减少,细胞密度(图1)。另一方面,暴露HEK-CM正常控制和KA细胞治疗显示健康细胞的身体和增强的神经过程。

3.2。HEK-CM治疗保存细胞密度

量化可行的细胞的数量在不同的治疗组,H3细胞和核染色染料DAPI和显微图像被抓获并使用图像J软件量化。量化的DAPI⁺从不同的治疗组显示KA细胞暴露导致显著的细胞损失(;数据2(一个)和2 (b))的细胞密度与正常对照组相比,()。相反,暴露的KA HEK-CM完全保护神经元免受KA诱导会和KA细胞密度明显高于+ CM组(;,数据2(一个)和2 (b))相比单独KA组()。HEK-CM介质本身不会降低细胞密度CM组中细胞密度(;数据2(一个)和2 (b))与正常对照组。

3.3。凋亡的潜在HEK-CM

接下来,我们确定在不同的治疗组凋亡细胞的比例流量仪分析。KA 24小时组,显著增加凋亡细胞的比例(83%)与NC组(;图3)。另一方面,当细胞cotreated KA和HEK-CM,显著的凋亡效应是观察和凋亡细胞比例降低50%相比KA 24小时组(;图3)表明HEK-CM保护对会引起神经元凋亡机制。

3.4。HEK-CM增强宿主的BDNF水平

脑衍生神经营养因子(BDNF)中扮演一个重要的角色在神经元生存、增殖,神经突的生长。为了获得机械的见解HEK-CM潜在的神经保护,我们分析BDNF的表达宿主细胞从不同的治疗组(H3细胞)。各治疗组细胞BDNF免疫细胞化学处理和荧光强度测量使用Image-J软件和表达为纠正总细胞荧光(CTCF) [17]。KA曝光后,有一个1.7倍下降BDNF表达幸存的H3细胞比正常对照组(;数据4(一)和4 (b))。HEK-CM增强H3细胞BDNF表达厘米和KA + CM组。BDNF表达高出2.4倍的KA + CM组相比单独KA集团(;数据4(一)和4 (b))。同样,有1.4倍BDNF表达增加CM组与正常对照组相比。然而,这不是统计学意义(数据4(一)和4 (b))。

此外,BDNF在HEK-CM神经保护的贡献决定通过添加BDNF HEK-CM中和抗体和细胞生存能力被MTT试验评估。我们的数据恢复,神经保护潜在的很大一部分HEK-CM BDNF在HEK-CM中和时减少(图4 (c))。中和的BDNF HEK-CM显著降低潜在的神经保护HEK-CM从96%到60% (;图4 (c))。有趣的是,尽管灭活的BDNF HEK-CM中和抗体,我们还观察到神经保护~ 40% (;图4 (c))与anti-BDNF HEK + CM组相比单独KA组表明可能有其他生长因子在HEK-CM也可能导致观察到的神经保护作用。

3.5。HEK治疗增加了bcl - 2 mRNA水平

脑源性神经营养因子对其神经保护通过bcl - 2 upregulation抗凋亡等因素的影响,我们研究了内源性凋亡因子的表达和bcl - 2 mRNA水平通过rt - pcr方法。我们的研究结果表明,接触HEK-CM正常控制以及KA + CM组导致突出upregulation bcl - 2表达的mRNA水平(图5)。相比之下,我们不能发现任何bcl - 2表达和正常对照组治疗的KA(图5)。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们表明,源于HEK细胞条件培养液可以保护海马神经元对海人酸诱导会引起。我们进一步表明,神经保护由CM是由于内源性细胞生存因素的刺激BDNF和bcl - 2在宿主细胞凋亡因素。神经元损失的根本原因在神经退行性疾病主要是由于高的浓度的谷氨酸释放的退化的神经元的持续激活谷氨酸受体神经元病变周围附近(18]。Hyperactivation谷氨酸受体导致钙稳态扰动,改变线粒体潜力,激活下游细胞死亡通路(1,19,20.]。在神经退行性条件下,两个已知的细胞死亡通路,即坏死和凋亡,激活其中坏死细胞死亡发生在初始损伤和凋亡细胞死亡导致进行性神经损失通常观察到在许多神经退行性疾病。在目前的研究中,我们使用了一个在体外海马神经退化模型,让有毒剂量的谷氨酸模拟红藻氨酸(21H3海马细胞。海人酸暴露剂量的200μ米24小时的持续时间显著降低细胞的生存能力,同时增加在剩余的H3细胞凋亡。相反,神经损失由KA完全当H3细胞与HEK-CM cotreated获救。先前的研究已经表明,coculturing神经元细胞与骨髓间充质干细胞衍生(BM-MSC)可以保护神经元免受会通过改变谷氨酸受体的表达(22)通过信息接触,增强神经元生存(23]。有趣的是,最近的一份报告Voulgari-Kokota et al ., (22]表明,预处理与条件培养液来源于骨髓msc (BM-MSC-CM)可以防止视网膜神经节神经元谷氨酸介导的会。同样,预处理BM-MSC-CM也被报道保护老鼠胚胎神经元免受staurosporine /β淀粉样蛋白肽诱导神经元死亡[24]。在后来的研究中,观察BM-MSC-CM介导神经保护BM-MSC-CM时使用剂量的30 - 50%,而100%的BM-MSC-CM暴露导致神经元凋亡升高。此外,观察神经保护只在预防组而BM-MSC-CM cotreatment没有保护神经元免受staurosporine /β淀粉样蛋白肽诱导细胞死亡。有趣的是,后处理条件培养液来源于脂肪msc还可以防止PC-12神经细胞谷氨酸介导的会(25]。在目前的研究中,我们观察到cotreatment HEK-CM提供重要的神经保护对KA引起会引起说明条件培养液的神经保护能力取决于使用的条件培养基的来源和神经毒素诱导神经退化。

cytotherapy领域的,几个假说被提出解释细胞的可能机制和功能复苏后细胞移植,包括移植细胞的分化成当地表型(26,27),移植细胞宿主细胞融合(28),分泌的生长因子和细胞因子诱导宿主内源性修复机制(8]。检查参与组成分泌腺其中,介导组织再生近年来吸引了更多的关注[5,9- - - - - -11]。此外,几项研究已经显示显著的功能恢复,尽管可怜的移植细胞的移植,从而支持了移植细胞释放或刺激的表达各种内源性细胞功能恢复的生存因素(29日]。符合这一点,我们也观察到HEK-CM本身能诱导宿主细胞的生存因素,比如BDNF的表达。HEK-CM治疗后,有2.4 - 1.4倍提高BDNF表达KA和non-KA治疗组治疗,分别,这表明厘米可以刺激内源性细胞生存因素的表达在正常和退行性条件。脑衍生神经营养因子赋予神经保护通过激活的细胞生存信号,最终导致upregulation bcl - 2抗凋亡等因素。在我们目前的研究中,我们观察到CM治疗导致增强宿主bcl - 2 mRNA的表达在KA治疗以及non-KA治疗组。支持我们的研究结果,最近的一项研究使用厘米源自adipose-MSCs报道,厘米本身可以发挥显著的神经保护对谷氨酸毒性增强的神经营养因子水平和激活细胞生存途径(PI3-K / Akt),最终导致upregulation抑制剂相关的凋亡因素像bcl - 2 x染色体和细胞凋亡的25]。此外,不太可能存在一个生长因子如BDNF可能带来完整的神经保护。作为HEK-CM拥有其他生长因子协同的方式可能是在保护神经元免受红藻氨酸诱导细胞死亡。进一步的研究是必要的来识别各种生长因子在HEK-CM和解剖出个体生长因子的贡献的神经保护作用。

5。结论

在目前的研究中,使用一个在体外海马神经退化模型,我们报告条件培养基本身可以保护神经元免受会通过增强宿主内源性细胞生存机制,因此强调没有细胞细胞疗法的可能性。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究是由再生医学学院印度麦利普大学,卡纳塔克邦,印度。作者要感谢博士Jyothi Prasanna, Anujith Kumar博士,女士Shagufta Parveen, Preethi女士Shikha Sharma女士夫妇Soumya Jhanavi的建设性意见和持续支持这项研究。

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