的影响麒麟菜cottonii在信号通路诱导粘蛋白合成鼠肺长期暴露于颗粒物(PM 10₁₀)煤尘

文摘

本研究旨在调查的影响麒麟菜cottonii(EC)在氧化应激和粘蛋白合成的信号鼠肺长期接触煤尘。煤尘与伴随的口服ethanolic提取物的EC 150 (EC的剂量_150年BW (EC)或300毫克/公斤_300年)相比,接触点₁₀煤尘在剂量的6.25 (CD_6.25),12.5 (CD_12.5),或者25毫克/米³(CD₂₅)(一个小时每天6个月)和nonexposure集团(控制)。丙二醛(MDA)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)α、表皮生长因子受体(EGFR)和MUC5AC水平测定肺。电子商务管理_300年显著(p< 0.05)降低MDA含量组暴露在所有剂量的煤尘相比各自的煤炭dust-exposed nonsupplemented组。虽然没有统计学意义,电子商务降低了EGF和EGFR表达水平CD_12.5和CD₂₅组织和减少了TGF -α,在CD和MUC5AC表达水平₂₅组相比,各自的煤炭dust-exposed nonsupplemented组。EC能够降低氧化应激,也能够减少粘蛋白合成信号,至少部分,通过减少长期接触煤尘的配体。

1。介绍

在健康个体,吸入外国材料成为禁锢在粘液和由黏膜纤毛的清除运输和咳嗽。然而,在许多慢性气道炎症性疾病,过多的粘液产生和清除不足,导致粘液梗阻和感染(1]。

职业和大气吸入煤尘被报道大大有助于一些呼吸系统疾病的发展,包括感染、炎症和重塑的肺2]。几项研究已经发现,煤尘是激进的本身,同时也产生自由基(3),从而增加氧化应激大鼠肺(4,5和人类血液6]。MUC5AC的表达,一个主要的分泌,gel-forming呼吸道黏液,杯状细胞化生及粘液分泌过多密切相关(7]。氧化应激可能在转录和转录后的调节基因的表达水平。通过激活氧化应激调节MUC5AC mRNA表达表皮生长因子受体(8,9),另一种机制,转录后调控10]。

近年来,海洋资源吸引了注意力的新药发展的生物活性化合物和健康食品11]。特别是,海藻是一个非常重要的食品工业和商业价值的资源,用于传统医学(12]。大量种植食用红海藻,麒麟菜cottonii(Kappaphycus alvarezi),在原始水迅速生长在东南亚,可以收获每45天供人类使用。它含有大量的膳食纤维、矿物质、维生素、抗氧化剂,多酚类物质,植物化学物质,蛋白质和不饱和脂肪酸,有药用用途13]。大肠cottonii是其中一个主要栽培海藻物种Tamiang海湾南加里曼丹。先前的研究表明,大肠cottonii最佳antihyperlipidemic和吗在活的有机体内抗氧化活性,显著降低身体体重增加,升高红细胞氧化酶,并降低血浆脂质过氧化作用的高脂肪饮食的老鼠对正常大鼠的值(14]。的polyphenol-rich大肠cottonii通过细胞凋亡诱导肿瘤抑制活动,表达下调内源性雌激素生物合成,改善大鼠的抗氧化状态(15]。

在这项研究中,我们调查了氧化压力的变化,EGF和TGF -的水平α,表皮生长因子受体的表达和MUC5AC鼠肺长期接触点₁₀煤尘。我们假设这种暴露改变了表皮生长因子受体配体及其下游信号和管理大肠cottonii可以显著减少这些影响。

2。材料和方法

2.1。的制备和提取大肠cottonii

大肠cottonii从Tamiang的沿海地区,Kotabaru(南加里曼丹,印度尼西亚)。这个物种没有发现有毒矿物的x射线荧光分析(数据没有显示)。的制备和提取海藻进行根据法德等人的方法。16]。新鲜海藻是彻底用蒸馏水洗净,和他们的浩方和附生植物被删除。然后清理海藻干40°C在黑暗的房间里3天使用一个米勒和磨成细粉。粉是储存在−20°C在密闭容器包装铝箔。然后,粉(200克)是机械搅拌和1000毫升的80% (v / v)乙醇在室温下(RT) 24 h和过滤。残留物被溶解在3000毫升蒸馏水,搅拌RT 8 h。随后,提取被过滤和集中在40 - 70°C负压下1 h,分别。提取炉干在40°C一夜之间产生粉提取,然后储存在−20°C在密闭容器,直到应用程序。

2.2。测定抗氧化活性(清除DPPH自由基的活性)

抗氧化活性是评价diphenylpicrylhydrazyl DPPH自由基清除实验。包含一个稳定的自由基DPPH分子。的一种抗氧化剂,可以贡献一个电子DPPH, DPPH自由基衰变的典型紫色,然后吸光度的变化是使用分光光度计在517海里。分析是根据Brand-Williams描述的方法进行et al。17]。各种浓度(6.25,12.5,25、50和100μEC的g / mL)准备和类似的儿茶素的浓度作为积极的控制。分析混合物含有500μ125年样本提取、LμL(准备DPPH乙醇(1毫米),和375年μL(溶剂(乙醇)。30分钟后孵化25°C, 517海里的吸光度测定。自由基清除活性是从以下方程:,腹肌_控制的吸光度DPPH自由基+溶剂;腹肌_样本的吸光度DPPH提取/儿茶素(18,19]。

2.3。动物

八十名男性纯种白化病老鼠,16周的年龄,体重170 - 200克,被用于这项研究。动物被安置在一个干净的钢丝笼和维护标准的实验室条件下的温度°C和黑暗/光周期12/12 h。标准提供了饮食和水随意。动物适应于实验室条件前一个星期的实验。动物保健和实验程序批准的机构伦理委员会的医学院,Brawijaya大学玛琅,印度尼西亚。

2.4。煤粉制备

煤粉制备所述执行在我们之前的研究20.]。两公斤的总值亚烟煤的煤来自煤炭矿区在南加里曼丹,印度尼西亚,被球磨粉,环机,雷蒙磨在马辰Carsurin煤炭实验室。煤炭粉尘然后用网过滤MicroSieve(生物设计,纽约,纽约,美国)获得粒子直径小于10μ米(点₁₀)。随后,点₁₀煤尘是扫描电子显微镜(SEM)、x射线荧光、和x射线衍射的物理和中央实验室,数学和自然科学学院,大学玛琅,印度尼西亚。

2.5。煤尘接触

八十年雄性Wistar鼠随机分为十组,如图1。一组是一个nonexposure组。三组被暴露于点₁₀煤尘在剂量的6.25 (CD_6.25),12.5 (CD_12.5),或者25毫克/米³(CD₂₅每天6个月)一个小时。六组接触煤尘随之而来的管理麒麟菜cottonii在150 (EC的剂量_150年BW (EC)或300毫克/公斤_300年)。煤尘的浓度决定根据职业暴露在地面上煤矿地区南加里曼丹,印度尼西亚(21)和土耳其(22]。根据以往的研究(EC的剂量16]。

煤尘接触了如我们之前所述研究[20.,21]。曝光室设计和可用在药理实验室,Brawijaya大学医学院。美国商会的主要工作是提供一个环境resuspended点₁₀可以通过大鼠吸入煤尘。室的尺寸是0.5米³和1.5 - 2 L / min气流流动,类似于环境气流。为了防止缺氧和不适,我们还提供氧气供应商会。在实验室Non-exposure组接触过滤空气。

2.6。组织抽样

在治疗结束时,动物被麻醉的安乐死乙醚吸入和通过心脏穿刺抽血。收集肺,称重,用生理盐水洗净。正确的肺组织学检查加工hematoxylin-eosin染色和共焦显微镜(表皮生长因子受体和MUC5AC)。左肺由比色和EGF均相测定MDA, TGF -α通过ELISA技术。所有样本标注和存储在−80°C到分析。

2.7。分析丙二醛

肺MDA水平衡量的修改方法Ohkawa et al。23),基于MDA的反应与硫代巴比土酸(稍后通知)在95°C酸条件(pH值2 - 3),产生一个粉红色的颜料。肺灌注以前自由与冰冷的PBS的血液。然后,肺在氯化钾缓冲区(pH值7.6)均质。匀浆混合2.5卷的10% (w / v)三氯乙酸沉淀的蛋白质。然后离心沉淀,上清液反应,0.67%在沸水浴稍后通知了25分钟。冷却后,彩色产品的吸光度是使用分光光度计在532海里。获得的值比较一系列的MDA四丁铵盐(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)标准的解决方案。

2.8。表皮生长因子受体配体的分析

血清TGF -α用老鼠TGF -α从NovaTeinBio ELISA试剂盒。公司(美国Cambridge, MA)。血清EGF酶联免疫试剂盒购自USCNK,生命科学。有限公司(武汉、湖北,中国)。程序分析是根据详细的装备。

2.9。表皮生长因子受体和MUC5AC的双标记免疫荧光染色

双标记免疫荧光染色的表皮生长因子受体和MUC5AC是修改之前的研究表明24]。石蜡包埋肺部分(10μ米厚)是应用根据制造商的指示(美国圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)。简而言之,肺部分在二甲苯deparaffinized通过分级和脱水乙醇系列。非特异性蛋白质绑定被2%的脱脂奶粉在PBS RT 20分钟,其次是与PBS洗涤。接下来,肺部分与兔子孵化anti-EGFR多克隆(圣克鲁斯生物技术)和鼠标anti-MUC5AC单克隆抗体(DakoCytomation、斯特鲁普、丹麦)在指定的稀释1 h,紧随其后的是洗PBS。主要的抗体绑定被发现与山羊anti-rabbit罗丹明(圣克鲁斯生物技术)和山羊anti-mouse FITC指定(圣克鲁斯生物技术)抗体稀释1 h在黑暗中,紧随其后的是洗PBS。PBS洗所有步骤包括三洗5分钟。表皮生长因子受体和MUC5AC的表达进行了分析通过计算细胞的荧光强度(在任意单位;在五随机大功率AU)显微镜领域。荧光图像记录在共焦激光扫描显微镜(奥林巴斯)。

2.10。统计分析

数据表现为平均数±标准差和群体之间的差异进行了分析使用单向方差分析(方差分析)与SPSS 15.0统计软件包窗口。只有概率值的被认为具有统计学意义,后来受到图基的事后考验。

3所示。结果

3.1。自由基清除活性

欧共体在100集中μg / mL显示弱自由基清除DPPH实验中(20.11%)比儿茶素浓度(86.08%)。这一发现意味着EC只表现出弱的抗氧化作用(表1)。

3.2。肺组织学

几个剂量的煤尘的暴露大鼠肺肺组织学的影响,见图1。CD_6.25诱导肺实质水肿。这种水肿过程减少CD_12.5并成为坏死的CD₂₅。长期接触煤尘肺泡腔的直径增加。此外,大量炎症细胞被发现在所有煤尘接触组。CD₂₅诱导血管舒张和出血。管理电子商务_150年和电子商务_300年能够减少肺泡腔的直径控制类似,但炎症细胞仍存在。此外,这补充也能够最大限度地降低出血性的过程。

3.3。分析丙二醛

几个剂量的煤尘的暴露大鼠肺MDA水平的影响,如图2。有显著()组织MDA含量增加接触煤尘non-exposure相比,各剂量组。电子商务管理_150年显著()降低MDA含量CD_6.25和CD₂₅组相比,各自的煤炭dust-exposed nonsupplemented组。电子商务管理_300年显著()组织MDA含量减少暴露在所有剂量的煤尘相比煤炭dust-exposed non-supplemented组。

3.4。表皮生长因子受体配体的分析水平

几个剂量的煤尘的暴露大鼠肺EGF水平的影响,如图3。有显著()增加EGF水平CD_12.5和CD₂₅组相比,non-exposure组。相比各自的煤炭dust-exposed non-supplemented组、EC的管理_150年和电子商务_300年减少了EGF水平组暴露剂量的煤尘。然而,研究结果未达到统计上的显著水平。

几个剂量的煤尘的暴露大鼠肺TGF -的影响α水平,如图4。有显著()增加TGF -α在CD₂₅组相比non-exposure组。相比,其煤炭dust-exposed non-supplemented集团电子商务的管理_150年无关紧要的TGF -下降α在CD_6.25和CD_12.5组,而电子商务_300年无关紧要的TGF -下降α水平组织暴露剂量的煤尘。

3.5。表皮生长因子受体表达的分析

几个剂量的煤尘的暴露大鼠肺部影响了EGFR表达,如图5。表皮生长因子受体表达明显(在CD)增加_12.5和CD₂₅组相比,non-exposure组。虽然没有统计学意义,EC_150年和电子商务_300年(图7)减少了EGFR水平组暴露在所有剂量的煤尘相比各自的煤炭dust-exposed non-supplemented组。

3.6。分析MUC5AC的表达

几个剂量的煤尘的暴露大鼠肺影响MUC5AC表达式,如图6。CD MUC5AC表达显著增加₂₅组相比non-exposure组,但电子商务_300年也能够减少煤炭dust-exposed MUC5AC表达组(图7)。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们观察到MDA水平显著增加大鼠肺长期接触煤尘。MDA是peroxidized多不饱和脂肪酸的分解产物,广泛的首选检测活性氧反应对脂质过氧化反应(25,26]。脂质损伤的严重程度与氧化剂的浓度在组织,因此脂质修复机制的效率。活性金属和抑制剂的浓度也决定了脂质损伤的严重程度。煤尘氧化还原反应是由无机成分和颗粒物的大小(21]。这项研究显示,电子商务管理的显著()在煤炭dust-exposed组MDA含量下降。这一发现表明,电子商务作为一种抗氧化剂在活的有机体内减少氧化应激在肺接触煤尘。EC的抗氧化机制,至少部分是由于清除自由基活性。

氧化应激可能在转录和转录后调节基因的表达水平(10]。通过激活氧化应激调节MUC5AC mRNA表达表皮生长因子受体(8,9),另一种机制,转录后调控10]。我们发现EGF和TGF -的水平α作为表皮生长因子受体的配体在煤炭dust-exposed组相比显著增加nonexposure集团()。此外,EGFR和MUC5AC的表达也显著高于煤炭dust-exposed组相比non-exposure集团()。这一发现表明,配体、受体和信号MUC5AC的调节慢性接触煤尘。Upregulation所涉及的这些配体金属蛋白酶的活性(27从煤粉),由无机成分。相比各自的煤炭dust-exposed non-supplemented组、EC的管理_150年和电子商务_300年减少了EGF和TGF -α水平组织暴露剂量的煤尘。然而,研究结果未达到统计上的显著水平。共焦显微照片显示,CD₂₅增加MUC5AC表达,但电子商务_300年能够减少它。这一发现表明,电子商务_300年能够调节MUC5AC表达的信号,至少部分,通过减少配体的生产。活性物质的半胱氨酸开关EC是配体生产的一种机制抑制(27]。总的来说,管理大肠cottonii能够扭转改造过程中肺暴露于慢性煤尘,特别是早期肺泡腔过程的缩小肺气肿。

总之,我们发现长期接触煤尘增加氧化应激和信号通路诱导大鼠肺内粘蛋白的合成。ethanolic提取的大肠cottonii能够减少氧化应激和粘蛋白合成信号,至少部分,通过减少配体。

确认

作者欣然承认的研究和技术,印度尼西亚,2012年新浪科研资助的。作者感谢所有技术人员在实验室的药理学和实验室生物医学科学,医学院,Brawijaya大学宝贵的技术援助,尤其是对Ferrida夫人,默哈迈德Abuhari先生,先生Wahyudha Ngatiril女士,和夫人Kurnia苏利耶”协议。作者还要感谢女士Anggun Indah Budiningrum和女士Choirunil Chotimah LSIH他们的技术支持,Brawijaya大学。

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