临床验证的一个高度敏感的gc - ms尿常规药物筛选平台和实时报告212药物

文摘

临床毒理学实验室的一个重要作用是为患者提供连续的诊断测试改变精神状态及其他医疗适应症。来满足这些需求,我们开发了一种新的气相色谱分析-质谱法(gc - ms)平台,促进常规筛查和自动报告的212种药品实验室技术人员24小时而无需签署由现场质量spectrometry-trained毒理学家。平台使用一个可编程的温度汽化器(PTV)喷射器大样本体积注入和自由软件自动化的质量谱减反褶积和识别系统(AMDIS)数据和光谱匹配,促进了快速库检索和分析物的识别。方法比较有118患者样本表明,这个平台和数据搜索算法独立提供改善敏感性而建立了gc - ms的平台。进一步检查的作用中使用的内部数据处理软件和数据库建立与新平台证明改进的分析灵敏度的新平台是由于新的气相色谱仪器的技术优势和使用AMDIS与新生成的内部图书馆进行数据处理。

1。介绍

毒素筛选病人,包括处方和/或非法毒品,是一个关键的功能,临床毒理学实验室。在我们医院,我们表现的综合毒性筛选的预发性高的患者人群使用,滥用和过量的处方药,非处方药(OTC),和非法药物使用的组合分析,气相色谱分析-质谱法(gc - ms)。建议临床医生使用这种全面的尿液药物屏幕来评估可能的意外或故意过量或中毒,评估的类型规定和/或非法药物使用的病人,或确定急性药物中毒的原因。分析也用于特定的临床背景调查是否存在特定的药物在病人的尿液开始前医疗过程。

大多数临床毒理学实验室使用的一个或多个各种分析和免疫方法(如液体Chromatography-Tandem质谱(质/ MS) (1- - - - - -4gc - ms (),5,6),和免疫测定(即。,发出)7]筛选病人尿液样本为各种不同的药物。在分析快速和完全自动化,技术是容易严重干扰的分析结构相似药物的家庭成员。因此,免疫测定结果只假定而不是被认为是确认。电子碰撞电离(EI)气,另一方面,是历史的黄金标准方法定性识别和定量尿液中大量的药物,由于其能够有效地分离药物色谱和之后产生的结构独特丰富的质谱,通常是一个特定的药物(8,9]。质/女士选择反应监测或多反应监测模式允许非常具体的定性药物识别和高度敏感药物定量,但它是困难的,在实践中,设计一个有效的全面的屏幕根据大量的转变,因为许多药物由液相色谱没有充分解决。这个问题在一定程度上解决了高分辨率质量分析仪的使用耦合LC (4),但这种方法需要大量的专业知识在试验设计中,一个非常昂贵的质谱仪(~ 5 - 10倍gc - ms仪器),通常专门受过训练的人员的运营商和临床翻译。由于这些原因,因此,我们选择开发一个屏幕高度敏感的EI - ms综合药物用于临床实验室,采用可编程温度蒸发(PTV) [10)进样增加分析物敏感性和自动数据分析算法基于自由software-Automated大规模光谱反褶积和识别系统(AMDIS) [11- - - - - -13)——允许由多面手临床操作技术人员。PTV允许样本引入冷系统,其次是温度斜坡选择性注射溶剂蒸发之前引入到列,而不是直接注入的热氧化环境默认喷射器。反过来,这使得注入大量样本进行增强敏感性。我们有平台使用118患者样本的特征。尽管数据分析策略类似于我们已经证明在代谢组学14,15)和环境应用程序(16),临床验证这种方法没有被报道。我们的方法包含一个有效的常规毒理学应用程序的平台。

2。材料和方法

2.1。实验

2.1.1。化学药品和试剂

药品和试剂购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国),格蕾丝戴维森发现科学(哥伦比亚,医学博士,美国),和PhytoLab GmbH & Co . KG (Vestenbergsgreuth,德国)。

2.1.2。尿液样本

样品使用的方法比较研究应计从剩下的临床标本,储存在−20°C,已经提交给实验室综合药物屏幕之前的gc - ms分析平台。尿液综合药物筛选提交没有防腐剂。标本使用依照当地的机构审查委员会批准的程序。

2.1.3。样品制备

5毫升尿液用移液器吸取到一个13×100毫米一次性玻璃管。,50μL的内部标准(0.35毫克/毫升allobarbital和0.2毫克/毫升甲醇cyheptamide)添加和漩涡。尿液/内部标准混合物被转移到一家ToxiLab(美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)对旋转管和混合5分钟,在2500转离心5分钟。上有机层转移到一个玻璃20毫米×150毫米50培养管μL 0.025 mol / L盐酸被添加,混合物是涡10分钟。管内容被蒸发干燥在40°C水浴下空气流(10分钟)。干提取残渣重组1毫升甲醇和涡简要再溶解提取。样品终于转移到雷管瓶标签2毫升、封顶,转移到autosampler工具。

2.2。气相

2.2.1。仪表

气平台是一个热电电子ISQ与跟踪GC超气相色谱仪,质谱仪TriPlus RSH自动化样品注入器,和一台电脑工作站与X-calibur软件(美国沃尔瑟姆,MA)。GC柱Restek毛细管柱,30米×0.25×0.25毫米IDμm, Restek Rtx-5MS交联键5%二苯基- 95%二甲基聚硅氧烷(Restek Bellefonte, PA)。GC条件如下:PTV离注入模式,3μL注射;交联甲基硅膜厚度330海里;进样口温度增加从最初的65°C 1.5分钟,30年代280°C,然后到300°C 35分钟;氦载气流量1毫升/分钟;和柱温箱温度从150年到300°C编程为14.5°C /分钟,最初为20分钟150°C, 250°C,持续15分钟,然后为5分钟300°C。女士条件如下:电子电离模式,电离能70 eV,离子源温度220°C,毛细管直接接口290°C和全扫描模式m / z33 - 550,1扫描/秒停留时间为0.2。

2.2.2。方法

三个μL的尿液中提取注入溶剂蒸发的PTV班轮60°C,和残渣被转移到毛细管GC列没有分裂,增加到280°C。GC柱洗脱液直接电离和分析全扫描EI-MS。验证实验中,样品在新的平台上运行比较的结果建立了gc - ms平台用于临床实验室(见部分2.2。3)。之前使用的样品制备和提取分析前惠普系统当前的程序相同。

结转使用尿液样本从注入,注入测试药物服用的混合物含有50μg / mL的药物(高样本)。这种混合药物的注射之前,紧随其后的是注入负的尿样。结转使用质谱量化产生的消极的尿液样本注入前后高样本。

2.2.3。参考气:仪器和方法

惠普6890气相色谱仪结合惠普5973 MSD质谱仪。使用惠普ChemStation女士系列(DOS)与惠普G1034C软件版本C03.00(美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)。GC柱Restek毛细管柱,30米×0.25×0.25毫米IDμm, Restek Rtx-5MS Crossbond 5%二苯基- 95%二甲基聚硅氧烷(Restek Bellefonte, PA)。GC条件如下:惠普7683系列自动化示例喷射器,1μL注射;二苯5% - 95%二甲基聚硅氧烷;进样口温度增加从最初的65°C到280°C到300°C;氦载气流量1毫升/分钟;和列温度从100年到310°C编程在30°/分钟,初始时间3分钟,最后一次8分钟。女士条件如下:电子电离模式,电离能70 eV,离子源温度220°C,毛细管直接接口290°C和全扫描模式m / z33 - 550,1扫描/秒停留时间为0.2。

2.3。内部库和数据分析

全扫描数据文件通过gc - ms系统注入纯化合物甲醇溶液中被自动分析大规模光谱反褶积和识别系统(AMDIS) [11- - - - - -13在简单模式。AMDIS-readable图书馆212药物1.0.0.13编译使用Lib2NIST转换器软件版本包含在NIST MS-search软件2.0版本。为此,质谱的212种药物被注射了1毫克/毫升的纯甲醇的药物。最后设置的反褶积和搜索参数来源于一系列的优化实验的结果如下:宽度、12;相邻峰减法,2;敏感性,介质;分辨率,介质;和形状要求,媒介。相对保留时间(RRT)计算每个药物的基础上,保留时间不同药物和内部标准cyheptamide (RT的药物/ RT的内部标准;RRT cyheptamide = 1)。相对保留时间范围的±0.2分钟窗口被分配到每个药物在图书馆占样本保留时间的变化。 RRT matching was accomplished using a simple Microsoft Excel macro developed in-house. Only the drugs whose retention times matched the preset RRT range are considered reportable.

2.4。分析灵敏度

平台的灵敏度分析是评估使用稀释尿液含有多个药品标准的峰值在不同浓度的提取中提到的部分2.1。3和注入气相。最低浓度的药物混合物中检查1 ng / mL。如果药物无法检测到的最低浓度测试,下一个更高浓度的药物进行了分析。通过这种方式,未被发现的药物的浓度增加折叠(1、10、100和1000 ng / mL)直到浓度检测的平台。图1显示的最低浓度的212个药物检测。

2.5。临床相关性

九十九年回顾病人样本用于临床的相关性结果生成的新平台。确定每个病人的药物品种的新平台与药物的数量为每个病人报告的参考平台。两个平台之间的差异被图评审裁决,确凿的分析结果与病人的历史通过寻找药物被管理或者疑似自行根据记录风险的行为。药物被称为积极的新平台,分析标准(部分3.1)得到满足和临床记录支持的存在药物在病人样本。

3所示。结果与讨论

3.1。优化的新气平台

引入一个新的气平台我们的目标在我们的临床毒理学实验室是使非专家多面手运营商运行试验时间,直接生成报告,沟通结果医生不需要验证的博士层次毒理学家和MS-based化合物鉴定经验。因为这个试验的临床样本通常来自患者高尿药浓度过量后,因为平台高度敏感,更重要的是评估的程度injection-to-injection结转首先,如果需要优化GC方法最小化结转(2.2.2中描述)。AMDIS参数进行了优化,进一步确保任何挥之不去的延滞峰或潜在的假阳性被排除在最终报告。

AMDIS提取纯离子色谱从复杂化合物光谱和deconvolutes噪音、形状、峰值和保留时间和随后匹配纯deconvoluted光谱与内部参考图书馆(目标)组成的212的药物。AMDIS使用两个匹配因素(11,12),正向搜索和反向搜索、资格匹配并生成与药物的初步名单。因此AMDIS光谱匹配合格的打可以报道如果rrt匹配预定保留时间范围的内部图书馆。虽然RRT匹配可以由AMDIS使用图书馆的外部标准(商用烷烃的混合物),这种方法会显著干扰当前的质量控制和日常操作程序在我们的实验室中,这可能需要RRT界限被重新定义如果GC列需要缩短。因此,我们选择评估可接受RRT为每个单独的药物相对于一个单一的内部而不是外部标准,这样就不需要费力的外部调整。

使用gc - ms参数,优化数据生成99年回顾患者样本。使用这些数据,AMDIS反褶积设置分辨率和灵敏度第一次优化,最大数量的目标药物的使用较低的最小生成匹配因子(MMF) 60对正向和反向搜索方法。MMF 60,一些低级的延滞峰以及潜在的假阳性药物中发现一些样品。接下来,排除低级的最佳MMF被延滞峰以及报告中任何可能出现的假阳性。为此,一系列mmf(60、70、80、90)检查;表所示的一个例子1一个病人。表1列表的药物使用每个4 mmf检查报告。根据评估的数据集和关联结果与病人的临床和处方的历史,这是观察到,报告生成MMF总计80(或更高版本)中没有可证实的假阳性结果。因此,80年一个MMF用于新的气平台的进一步验证。

3.2。临床验证:回顾性研究

生成的报告是99年回顾患者样本使用gc - ms和AMDIS参数进行了优化。没有证据证明为假阳性测试结果是99年观察到的任何报告和临床数据进行验证。然而,在某些情况下,根据处方药物预计80年历史并没有报道MMF(见,例如,桌子1)。因为分析的主要目标是确保报道的结果是真实的,而不是确定每种药物在病人样本,假阴性结果的程度还没有经过验证。比较药物的数量为每个报道99例由每个平台绘制在图2。图清楚地表明,新平台增强了每个病人的药物数量相对于参考平台。在两个病人才参考平台报告更多的药物(事实上,一个额外的药物)的新平台。对大多数患者来说,新平台报告每个病人更多的药物,而几个患者样本两个平台报道相同数量的药物。图399年患者样本显示,新平台报道,平均6 - 8每个病人药物参考平台报道,平均3 - 5每个病人的药物。

3.3。前瞻性研究

因为相比回顾性研究数据从新鲜和冷冻样品和使用不同的尿液中提取相同的标本,另一个较小的前瞻性临床验证研究使用19日执行新的患者样本。在这项研究中,从患者样本中提取的药物临床分析和整除的提取分析参考平台(临床试验)和新平台(本研究)。生成的新平台,建立了gc - ms数据平台由各自处理软件和库以及跨平台兼容的软件和库的配置。五种不同配置的分析组件被用于这项研究和描述图4随着药物的数量报告每个病人每个可能的分析程序和软件配置。参考平台的数据处理时使用AMDIS,药物的数量略有增加,但无意义的相比,药物的数量报告的使用默认软件进行数据分析。然而,当新的内部图书馆,在结合AMDIS gc - ms仪器分析的数据参考,药物的数量显著增加。当新生成的数据和分析的参考工具都AMDIS结合新的内部图书馆,进一步显著增加每个病人的药物(40%)报告。表2列出了每个报告的药物5平台的配置一个子集(三)的患者样本检查这种方法。越来越多的药物被确定的数据生成的参考平台当AMDIS和新的内部使用图书馆。当数据生成的新气相色谱仪器和标准测试仪器都是处理AMDIS结合新图书馆,新平台持续报道大量的药物。新平台惟一确定的药物在大多数病人标本分析(见表2)。例如,对于病人在表12,新平台唯一标识曲唑酮、吗啡和加巴喷丁在病人的尿液,错过了这三个国家建立了平台。病人处方曲唑酮和加巴喷丁,而他并没有规定吗啡。在这种情况下,病人有非法药物滥用的历史(因此阳性吗啡)提出了诊所的精神状态改变。因此,医生依靠临床管理的实验室结果。可想而知,这些药物可能的存在的知识改变了管理。

回顾性和前瞻性研究的结果清楚地表明,新平台的范围显著增强药物毒理学实验室报告的。基于前瞻性研究的结果,我们发现改善的临床表现新的气平台的部分原因是,数据分析管道但更重要的是新仪器,可能是因为使用的PTV注入(允许增加样本容量和更广泛的药物被气采样)和改进的离子传输提供的新的四极质谱分析器。基于我们的图表审查,没有可证实的或疑似假阳性结果报告的118患者样本处理的新气平台。

的能力与我们的新发现许多药物分析平台已经在复杂的毒理学情况下辅助临床医生。在表3,一个71岁的女病人被送进急诊室改变精神状态。病人住在养老院,共用一个房间与另一个病人有类似的名字。表3显示了病人的药物处方列表,列表的药物发现的新气平台在她的尿液标本,和她的室友的药物处方列表。如表所示,这尿液药物屏幕上发现了一个完全不同的小组相比,她的尿液药物的药物处方。preanalytical错误如样品交换被怀疑在这种情况下,但事实上,冗长的药物名单来源于毒品的gc - ms分析匹配完美面板开给她的室友导致临床团队明确确定,病人的精神状态改变的原因是药物治疗错误的养老院。

4所示。结论

我们已经证明了一个高度敏感的gc - ms平台采用PTV注射进样技术加上一个公共数据分析软件包(AMDIS)可用于常规筛查大量尿液中药物的半自动的时尚。新设计的工作流与纯化合物的新的内部图书馆质谱允许大量的常规分析尿液中药物与优越的敏感性而建立的平台。采用高匹配质量阈值时,平台生成合格(真阳性),点击可以报告以一种无监督的方式由实验室技术员昼夜不需要签署现场博士水准毒理学家。工作流临床验证了泌尿系统药物的定性分析,目前用于常规毒性筛选212尿液中药物。通过使用适当的校准器设计,所述平台和分析方法也可以用于定量分析。

缩写

气相:	气相色谱分析-质谱法
PTV:	可编程温度汽化器
AMDIS:	自动化大规模光谱反褶积和识别系统
场外:	在柜台
质/女士:	液相色谱-光谱/质谱分析
发出:	增加酶免疫测定技术
RRT:	相对保留时间
MMF:	最小匹配因素。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。他们想澄清,商业实体材料中提到的部分只是作为附加信息的来源材料和仪器用于这项研究。他们没有财务或其他利益实体中列出的部分。

承认

作者感谢加里博士野鸭(NIST)的许多讨论和有用的建议在AMDIS在工作流的实现。

补充材料

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