文摘
一种神经毒素(NTX)的类型肉毒梭状芽胞杆菌是由一个简单的净化过程使用乳糖凝胶柱。这种纯化毒素的毒性是保留准备至少1年−30°C补充白蛋白0.1%或0.05%白蛋白+ 1%海藻糖。当纯化NTX用于治疗尿失禁患者49引起的难治性特发性或神经源性逼尿肌过度活跃,36个患者在症状有明显改善。这些有利影响也观察到在前列腺增生的情况下。获得的结果与NTX是肉毒杆菌素的相似。NTX的影响引起的三叉神经痛眼眶下的神经收缩(IoNC)在大鼠也进行了研究。三叉神经节神经元从侧IoNC表现出明显加快出现fm4 -比sham-operated侧神经元释放64。皮内注射NTX IoNC IoNC-induced减轻疼痛领域的行为和减少夸大fm4 - 64版本在三叉神经节神经元。
1。介绍
在这个手稿,三个主要主题描述:(1)的结构类型祖毒素,净化类型的神经毒素乳糖凝胶柱根据祖毒素特征;(2)治疗尿失禁患者和前列腺增生与纯化毒素;(3)应用纯化毒素治疗三叉神经痛大鼠模型。介绍包括这三个主题的目的是描述每一段的开头。
2。结构类型的祖毒素,净化类型的神经毒素
肉毒梭状芽胞杆菌菌株产生免疫不同神经毒素(NTX;类型和分子质量(M G)r)约150 kDa。在一种激活,NTXs有裂解位点的三分之一位置N末端共轭s键,可以通过细胞蛋白酶裂解或体内胰蛋白酶补充道。培养液和酸性食物,NTXs与无毒组件,形成大型复合体指定祖毒素(PTXs)。PTXs发现与M三种形式r900 kDa(19的年代,会),500 kDa (16 s、L)和300 kDa (12 s, M);之后,很明显,实际的Mr的L和LL毒素远远大于500和900 kDa,分别(见下文)。M毒素由NTX和无毒的组件没有血凝素(HA)活动(指定无毒non-HA;NTNH),而L和LL毒素是由一个NTX (s),一个NTNH (s)和。产生三种形式的毒素A型流感(M, L,和我),而类型B, C, D M和L产生毒素。在碱性条件下没有胃的果汁、PTXs分离到NTX (s)和无毒的组件,L和LL毒素(指定HA-positive PTXs)分离成一个NTX (s),和一个无毒的组件(复杂)的NTNH (s)和,和M毒素解离成NTX NTNH [1]。
我们发现,(1)将毒素是L的二聚体毒素;(2)解理或删除检测M毒素NTNH的氨基端地区;(3)公顷由三到四子组件指定的农业,2和3 (3 a、3 b);(4)HA1和HA3b绑定到半乳糖和唾液酸,分别出现在红细胞的表面和小肠上皮细胞(2- - - - - -4]。最近,我们还分析了A型的晶体结构和C HA1和C型HA3来描述他们的糖结合位点5- - - - - -7]。此外,通过调查三级结构类型的C和D L毒素与电子显微镜,NTX的摩尔比率:NTNH: (HA1: HA2: HA3)被预测为1:1:(2:1:1,实际的L毒素r计算约750 kDa。将毒素米r因此,估计约1500 kDa的因为它是一个二聚体L毒素,尽管它的三级结构尚不清楚(7,8]。这些数据在图进行了总结1。
(一)
(b)
A和B型PTXs一直用于治疗斜视患者,睑痉挛,眼球震颤,面部痉挛,痉挛性失音,和许多其他肌张力障碍包括颈肌张力障碍,偏头痛(偏头痛),和一些泌尿疾病(9- - - - - -16]。对于这些疗法,PTXs主要是使用,因为他们很容易获得,比NTXs更加稳定。虽然这些治疗是非常有效的,他们可以在一些患者存在严重的问题,anti-PTX包括anti-NTX,有时几个注射后产生的抗体。我们认为使用NTX仅可能比使用PTX因为HA1和HA3b PTX immunoenhancing活动,虽然没有明确的数据对于这个人类的免疫反应性(17]。因此,我们建立了简单的净化程序类型NTX和长期存储类型的NTX−30°C没有减少毒性。
如图1,HA-positive PTXs绑定到半乳糖通过HA1在酸性条件下,与NTX和无毒的组件的接合在碱性条件下水解。因此,只孤立HA-positive PTXs,部分纯化PTXs首先受到一个aminophenyl beta-lactose凝胶柱平衡与10毫米钠磷酸盐缓冲剂(pH值6.0)。从这个专栏,提纯制剂HA-positive PTXs, NTX或HA + NTNH可以通过洗列有不同的缓冲区(图2)。这个过程比先前的协议,使用简单的几种不同的列和条件。此外,NTX乳糖凝胶制备纯化的列显示每毫克蛋白毒性和sds - page分班一样可以同以前的程序。我们还发现NTX毒性可以完全保持至少一年当白蛋白(0.05%)、海藻糖(1%)、和Tween-20(0.01%)被添加到存储解决方案(18]。NTX、白蛋白和海藻糖稀释endotoxin-free等渗氯化钠溶液。最后,这种纯化NTX被用作治疗代理准备尿失禁和前列腺增生和作为三叉神经痛的镇痛在老鼠模型中。
临床应用之前,NTX准备和白蛋白的安全和质量检查使用NTX浓度100倍大于那些用于治疗和白蛋白在50毫克/毫升。细胞毒性评估使用IMR-32(人类,腹部),Neuro-2a(鼠标、脊髓),U937(人类,胸腔积液),NOMO-1(人类,外周血)HT-29(人类,冒号),Caco-2(人类,冒号),海拉(人类、宫颈癌),维罗(非洲绿猴肾)细胞系。诱变试验NTX和白蛋白是由一个艾姆斯测试根据预孵化技术Yahagi et al。19]。朊病毒和内毒素污染是化验Prionics-Check西方工具包(Prionics AG)和鲎变形细胞溶解产物测定(BioWhittaker),分别与艾滋病和肝炎病毒化验了PCR由商业公司(SRL,立川,日本)。此外,两个日本冈山大学的伦理委员会的批准和川崎医学院的临床试验和患者知情同意。
3所示。临床试验
3.1。耐火紧迫性尿失禁
初步研究Schurch患者31日和同事神经源性逼尿肌过度活跃(NDO)表现出显著增加意味着最大膀胱容量(296 - 480毫升,)和平均最大排尿逼尿肌压力明显下降(65 - 35而言不啻2啊,)的病人注射了肉毒杆菌素(主要毒素可能会使用)(14]。十七19例完全大陆,非常满意的过程。有趣的是,基线改善尿动态参数和失禁坚持11 36-week后随访期间患者。克鲁斯和同事最近报道的结果多中心、国际、随机、双盲和安慰剂对照III期临床试验NDO肉毒杆菌的病人。患者接受30 intradetrusor注射200 U ()或300 U (肉毒杆菌素,或安慰剂)。第6周,200 U或300 U肉毒杆菌的数量明显减少尿失禁发作每周(−−21.8和19.4,分别地。),显著增加最大cystometric能力,显著提高生活质量分数与安慰剂相比。病人的平均时间要求再处理都是一样的肉毒杆菌素剂量(42.1周)20.]。
Intradetrusor注射肉毒杆菌有延伸领域的神经源性膀胱患者nonneurogenic排泄和储存障碍(14,15]。Dmochowski和同事获得有利的影响与intradetrusor注射肉毒杆菌双盲,安慰剂对照,随机研究,评估了肉毒杆菌素剂量(即。50、100、150、200和300年的313 U)和安慰剂患者特发性逼尿肌过度活跃(IDO) [16]。经历了尿尿失禁的病人每周至少八集和八个或更多排尿/天是包括在这项研究。主要终点是每周尿紧迫性尿失禁发作在12周。作者观察到的一个显著差异数量的紧迫性尿失禁发作每周在很多时间点对肉毒杆菌素治疗的患者相比,服用安慰剂的病人。
我们小组进行了临床试验使用NTX紧迫性尿失禁患者治疗由NDO或油造成的。总共200 U (NDO), 100 U(伊多为女性),和50 U(伊多为男性)NTX注入膀胱壁的微创门诊使用软性膀胱镜检查技术。所有患者NDO执行清洁间歇导管插入术前治疗。尿动态最大cystometric容量和最大逼尿肌压力进行评估之前和填充cystometry治疗后一个月。主观和客观措施包括孔隙的数量和频率每24小时尿失禁发作之前从为期3天的膀胱日记治疗和1、3和6个月后治疗。总共16个患者脊髓NDO和平均年龄为42.3岁(范围20至75年,2雌性和雄性14日)和33个被罩和平均年龄为71.9岁(范围50到83年,15岁女性和18名男性)治疗(18]。NTX治疗产生的增加意味着最大cystometric能力在基线毫升在一个月毫升(在NDO病人在基线毫升在一个月毫升()我的病人。逼尿肌过度活跃的平均最大逼尿肌压力下降不啻2O在基线不啻2O ()在NDO病人和治疗后一个月不啻2O在基线不啻2O ()在一个月我的病人。每日尿失禁发作的平均数量减少来()在1月(对NDO病人)在3个月。集尿失禁的日常的平均数量减少来()在1月(在3个月),()在6个月时我的病人。十16 NDO病人(62.5%)和15的33个州的患者(45.5%)获得了在1月内完成自制NTX注入。NTX治疗减少了一半的数量为13 NDO患者尿失禁发作(81%)和23(69.7%)我的病人。功效的平均持续时间是3到10个月(平均4个月)NDO患者和4到12个月(平均6个月)我的病人。十33名患者(30.3%)我没有主观的改进。尽管5患者改善cystometric发现,他们没有主观改善由于残余尿量的增加和排尿功能障碍。19(57.5%)的33个被罩患者残余尿量> 100毫升,1个月后治疗和4男性病人需要清洁间歇导管插入术几个星期。没有严重的副作用发生(表1)。
在我们的研究中,NTX注射治疗注射的一个月内取得优秀的成果。的49例,分析了36例报道减少或缺乏失禁。后续对这些病人的分析显示,这些影响单一治疗后持续3到12个月。而最优注入剂量尚未确定,在我们的研究中,50 - 100 U被罩和200 U NDO应该是合适的治疗剂量。这些结果表明,肉毒杆菌NTX几乎相同的活动。
3.2。良性前列腺增生
第一个标示外使用肉毒杆菌素治疗良性前列腺增生(BPH)在人类被玛利亚等人报道2003年(21]。一项随机、安慰剂对照研究中,30岁的男性前列腺肥大症状被随机分配接受生理盐水或200 U肉毒杆菌素,产生临床改善治疗1个月之内。2个月,13个病人在治疗组(87%)和3例在对照组(10%)报告的主观缓解前列腺肥大症状()。在12个月里,国际前列腺症状评分Botox-treated组下降了62%,最大尿流率增加了85%,postvoid残余尿量减少了85%,和前列腺体积减少了61%。prostatic-specific抗原值也降低了38%。没有尿失禁或系统性副作用的报道。在其他报告的肉毒杆菌素治疗前列腺增生,最大尿流率的增加(40 - 121%)和减少在国际前列腺症状评分(48 - 65.5%)是统计学意义(11- - - - - -13]。有一个显著的减少前列腺体积变化从13.3%降至68%。
我们对待10男性患者(平均年龄70.0岁,范围61 - 79年)与不满意回应alpha1-adrenoceptor阻滞剂200 U(前列腺体积> 30毫升)或100 U(前列腺体积< 30毫升)NTX注入前列腺门诊使用微创技术。评估包括尿疗,postvoid残余尿量,前列腺体积,与国际前列腺症状评分,并进行基线和1、3、6和12个月后治疗。前列腺特异性抗原在基线测量,注射后6个月和12个月。7 10个病人指出改进在1个月之内。国际前列腺症状评分下降来()在1月(在3个月),(在注射后12个月。意思是前列腺体积减少来毫升(在3个月)。Postvoid残余尿量改进的3和6个月后治疗。平均前列腺特异性抗原在观察期间(表并没有改变2)。
虽然我们的研究取得了只有一个前列腺体积减少18%,这一结果是类似于通过郭和壮族等。11,12]。肉毒杆菌的效果出现在第一周一个月治疗后,这些好处是维持6到12个月(11- - - - - -13]。在我们的研究中,治疗的有益的结果明显的一周内,持续了12个月。最大的影响是3到9个月和前列腺体积达到最低水平在3到6个月。席尔瓦et al。13)也报告说,前列腺体积逐渐减少在6个月最低水平。治疗效果与注射剂量、毒素扩散在前列腺内,上皮和间质成分的比例,和逼尿肌功能。改善国际前列腺症状评分、最大尿流率,减少前列腺体积,和持续时间的影响对我们的病例几乎与先前的报道为肉毒杆菌(11- - - - - -13]。
4所示。NTX在三叉神经病变的鼠模型中的应用
三叉神经痛的特点是反复发作的,刺痛的面部疼痛(22,23]。三叉神经痛的管理仍然是一个主要挑战与抗癫痫药物治疗目前主要治疗的选择(24,25]。然而,由于一些病人不能容忍这些药物的副作用(如头晕、嗜睡)、更有效和更安全的药物需要治疗三叉神经痛。肉毒杆菌毒素就是这样一个候选人,非盲试验三叉神经痛患者表现出(肉毒杆菌毒素的效果26,27]。动物研究报道,肉毒杆菌毒素注射到外围组织减少腿坐骨神经结扎引起的神经性疼痛或转导28- - - - - -30.]。然而,一个系统的回顾表明,缺乏足够的数据,适当推荐肉毒杆菌毒素作为循证治疗继发性头痛或颅神经痛(31日]。大多数这些临床试验使用商用肉毒杆菌PTXs和没有使用NTX。自NTX目前不清楚真正的影响,继续研究的影响NTX治疗三叉神经痛动物模型是必要的。在这里,我们评估的影响类型的NTX三叉神经痛动物模型。
Kitamura et al。32)报道,大减少头撤军阈值后观察到同侧眼眶下的神经(三叉神经的分支)收缩(IoNC)通过刺激电动·冯·弗雷灯丝。这一结果表明,老鼠触觉异常性疼痛,通常三叉神经痛患者临床和被认为是一个痛苦的反应。同侧注入皮内注射A型NTX (100 pg或10 U)显著增加头部提取阈值与saline-injected三叉神经痛大鼠相比,表明NTX注入降低鼠三叉神经痛。这些结果是一致的与Filipovićet al。33),他还发现thatunilateral注射肉毒杆菌素减少IoNC-induced触诱发痛效果持续超过2周。接下来,我们的镇痛效应类型NTX相比,HA-positive PTXs (L和LL毒素得到的混合使用乳糖凝胶列,如图2)。图3表明,PTX相比,NTX减少疼痛水平长时间。
Kumada et al。34]自由移动的老鼠身上进行了测试,发现A型NTX减毒IoNC-induced热痛觉过敏。这些影响是剂量依赖性(2 - 200 pg),在100年和200年pg统计学意义()。厂外(脖子)注入类型NTX没有缓解热痛觉过敏和coinjection类型与NTX中和抗体在眼眶下的神经支配预防缓解热痛觉过敏。这些结果强烈表明,皮内注射A型NTX在眼眶下的神经支配减轻IoNC-induced热痛觉过敏。
类型的详细机制NTX效果在三叉神经痛动物模型尚不清楚。一些研究表明,肉毒杆菌毒素进行轴突运输。公诉et al。35)报道,在注射A型NTX鼠须肌肉,裂解synaptosomal-associated蛋白质25 kDa (SNAP-25)出现在面部核,表明毒素沿轴突和接受神经transcytosis迁移。Matak et al。36]发现肉毒杆菌截断SNAP-25髓背角(脊髓三叉神经核)是明显的外围治疗后3天。Filipovićet al。33)报道,单方面的肉毒杆菌注射reduced-IoNC诱导双边硬脑膜的外渗而Kitamura et al。32)观察到神经元隔绝三叉神经节侧眼眶下的神经收缩表现出显著更快出现fm4 - 64年分离染料释放三叉神经节神经元与神经元在侧虚假的手术。皮内注射A型NTX在眼眶下的神经支配的面积减少了夸大fm4 - 64染料释放从这些大鼠三叉神经节神经元。
在这个手稿,我们表明,A型NTX纯化与乳糖凝胶柱可用于临床,商用PTXs一样有效。最近,准备一个NTX型和B型PTX(可能L毒素)已经商业化。生产anti-NTX Ab在反复注射的病人以及毒素的功效必须被监控。通常,B型毒素没有完全激活但胰蛋白酶处理后可以激活。我们的程序适用于净化完全激活B型与部分纯化毒素B型PTXs第一个完全被胰蛋白酶激活前加载乳糖凝胶柱上。L毒素列绑定后,胰蛋白酶冲毁,充分激活L毒素或NTX可以获得类似于A型毒素(图2)[37]。我们还发现B型的毒性NTX可以长时间保持在30°C−白蛋白增加0.05%。我们计划评估充分激活B型NTX将来临床使用。
缩写
| NTX: | 神经毒素 |
| PTX: | 祖毒素 |
| 哈: | 血凝素 |
| NTNH: | 无毒non-HA |
| NDO: | 神经源性逼尿肌过度活跃 |
| 我: | 特发性逼尿肌过度活跃 |
| IoNC: | 眼眶下的神经收缩。 |