文摘

考虑到宽,正面报道的活性氧在缺血性脑损伤中的作用,寻找抗氧化药物在草药是逻辑。在这项研究中,的保护作用黄芩litwinowiiBornm。和它们。对细胞生存能力和培养的PC12细胞中活性氧的生产进行了血清/ glucose-deprivation-induced细胞死亡。后细胞在一夜之间被播种,然后他们被剥夺了血清葡萄糖/ 24 h。细胞与不同浓度的治疗美国litwinowii提取(7.75 -250μg / mL)。细胞生存能力量化了MTT测定,细胞内活性氧的生产被流式细胞仪测量。血清/ glucose-deprivation诱导显著细胞死亡后24小时( < 0.001)。治疗美国litwinowii-250 (7.75μg / mL)降低血清/葡萄糖deprivation-induced 24小时后在PC12细胞中细胞毒性。显著增加细胞内活性氧的生产被认为后血清/葡萄糖剥夺( < 0.001)。美国litwinowii(62年和125年μg / mL, < 0.01)治疗逆转缺血后的活性氧产量增加的侮辱。这表明美国litwinowii提取保护PC12细胞抗氧化剂对血清/ glucose-deprivation-induced细胞死亡的机制,这表明潜在的治疗应用美国litwinowii在管理脑缺血和神经退行性疾病。

1。介绍

尽管相当大的中风药物治疗的进展,缺血性和神经退行性细胞死亡仍然是一个主要问题。作为底层patho-physiology decrementation葡萄糖,O2和其他微量元素对神经元,血清/葡萄糖剥夺(SGD)可以作为一个合适的模型来评估中风过程和药物疗法的影响讨论Moley和Mueckler1]。PC12鼠嗜铬细胞瘤细胞系已被广泛用作代表体外模型分析不同生化变化在神经组织讨论其他地方(2),从而使一个好的模型来分析SGD条件根据Woronowicz et al。3]。

黄芩是唇形科的一个子集,它有抗氧化效果如前所述,马丁和Dušek [4]。

每年数以百万计的患者会从缺血性侮辱到不同器官,其中已经发现几乎所有遭受不利影响的活性氧(ROS)。相比之下,有特定的物质称为抗氧化剂能够清除和中和这些活性氧;最重要的酶(如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶)。还有其他非免费激进的物质,具有大量的氧气reactivitymainly由于高能债券(如过氧化氢、时、单子叶植物脂质氢过氧化物和环氧化合物和次氯酸)的术语ROS拥抱几类物质以外的自由基。ROS生产特别大规模的再灌注后由于不受控制的内部线粒体代谢、花生四烯酸代谢,产生类二十烷酸脂氧合酶途径生产。环氧酶是一个重要的球员这些有害的瀑布。还有其他过氧化物化合物释放的炎症再灌注后白细胞增加混乱。大量的氧气和由此产生的ATP产量的增加是紧随其后的是其快速退化和活性氧代谢产物的生产黄嘌呤氧化酶途径。这个途径获得更多的重要性在缺血由于黄嘌呤脱氢酶对黄嘌呤氧化酶的转换。也有激活的一氧化氮合酶(NOS)在细胞内钙增加2 +生产不负责后续转换成一个高度活性代谢物ONOO−在再灌注损伤,增加其复杂性(5,6]。ONOO−破坏蛋白质、核酸和膜磷脂。细胞膜内多不饱和脂肪酸(欧米伽)尤为敏感,自由基氧化主要是因为他们的高活性共价键。

脂质过氧化反应级联结果生产酒精过氧化氢过氧化和类似物的脂肪酸与铁反应之后2 +,然后产生有毒乙醛代谢产物如crolein。这些反应最终导致膜流动性下降,改变了跨膜酶和受体系统,最后的胎膜破裂。影响蛋白质是更重要的,这包括增加羰基化合物,降低含巯基的组,二硫键,增加了共价胺债券nitrolation酪氨酸、色氨酸崩溃,第四和第三配置的最终破坏蛋白质。氧化应激后基因表达改变大量的mrna转录,随后翻译使核转录因子k B (NFκB),它本身会改变许多其他基因(如环氧酶、诱导一氧化氮和金属蛋白酶、细胞间连接分子和细胞因子)。整体的比例增加神经元死亡后通过坏死或凋亡ROS的生成。

神经元更敏感比其他组织葡萄糖剥夺,因为他们缺乏糖原存储。传感器的类型电动机赤字取决于的解剖位置的侮辱,所以显示巨大的多样性由于神经解剖学的地区的复杂性7]。今天有越来越感兴趣对调查的可能性草药疗法在预防和治疗缺血性退行性神经细胞死亡。美国litwinowii根是一个传统的草药,据报道,有抗氧化作用[4]。本研究试图阐明的保护作用美国litwinowii根提取物和抗氧化剂的好处这一根扭转ROS增加和细胞毒性和研究活性氧的作用生产GSD-induced PC12细胞毒性。

2。材料和方法

2.1。试剂

4,5-Dimethylthiazol-2-yl 2 5-diphenyl四唑(MTT), 2, 7-dichlorofluorescin二乙酸(DCFH-DA)和杜尔贝科的磷酸盐(PBS)购买的σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。Glucose-high杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) Glucose-free DMEM,胎牛血清的边后卫,青霉素和链霉素买来Gibco(大岛,纽约)。二甲基sulfooxide (DMSO)从默克公司购买。的根源美国litwinowii收集在它的自然栖息地Pivejan Hosseinabad谷(2100米高),马什哈德西南65公里的一个村庄,Khorasan哈省,伊朗,验证了·马什哈德大学植物标本。凭证标本的标本存放在学院制药、马什哈德大学医学科学。

2.2。的制备美国litwinowiiMethanolic根提取物

美国litwinowiimethanolic根提取物制备如前所述,Tayarani-Najaran et al。8]。干燥根粉(100克)美国litwinowii用甲醇提取( 4 × 0 。 5 L),然后被集中在50°C下减压干燥。

2.3。细胞培养

PC12细胞获得巴斯德研究所(德黑兰,伊朗)。细胞被维持在37°C在湿润的气氛中包含5%股份有限公司(90%)2。细胞培养在高葡萄糖杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) (4.5 g / L的葡萄糖)和10% (v / v)胎牛血清,青霉素100单位/毫升和100μ克/毫升链霉素。

实验的PC12细胞在一夜之间被播种,然后受到血清/葡萄糖不足24小时通过更换培养基glucose-free DMEM补充与100 U /毫升青霉素、链霉素和100 U /毫升。PC-12细胞然后进行预处理(2 h)美国litwinowii提取(7.75 -250μg / mL)和受血清/葡萄糖剥夺(西班牙)24 h。MTT测定,细胞被播种在5000 /到96 -文化板块。活性氧产量的测定,细胞被播种在100 000 / 24-well板上。对于每个浓度和时间课程学习,有一个控制样本仍然未经处理和接收相同体积的介质。

2.4。细胞生存能力

细胞的生存能力是决定使用修改后的3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyl四唑(MTT)试验9]。简单地说,他们被播种(104细胞/)到平底96 -文化板块。去除介质后,MTT方法在PBS(5毫克/毫升)增加了1.5 h产生的有色甲,这是随着DMSO (100μL)。吸收测量在570海里(620 nm作为参考)。

2.5。测量细胞内的激进的氧物种

激进的测定细胞内氧物种(ROS)水平与少量修改(完成如前所述10,11]。总之,在18 h后缺血性侮辱,PC12细胞孵育10μ在37°C M DCFH-DA在黑暗中30分钟。的荧光2′,7′二氯荧光素(DCF),氧化DCFH-DA的产物,很兴奋在480 nm,流式细胞术检测到530海里。温度保持在37°C在整个实验过程。

2.6。统计数据

单向方差分析(方差分析)是用于数据分析。所有的结果都表示为的意思 ± 扫描电镜。 < 0 。 0 5 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。美国litwinowii提取保护PC12细胞对血清葡萄糖/ Deprivation-Induced细胞毒性

结果表明,血清/葡萄糖剥夺可以减少细胞培养的PC12细胞的生存能力相比,时间的方式来控制(图1)。接触血清/葡萄糖剥夺6日18日和24小时细胞生存能力下降41.7±2.37%,33.5±1.53%,分别为18.8±3.52% ( < 0 。 0 0 1 )。24小时血清/葡萄糖剥夺当时选择在所有后续实验诱导PC12细胞损伤。这项研究的结果表明,SGD有破坏性影响细胞,形态和通过MTT试验。这导致了细胞的可行性不足20%;然而,通过添加美国liwinowii根提取物,这种破坏性的过程明显逆转为62.5和125μ克/毫升(图1)。


图1
的保护作用美国litwinowii血清/葡萄糖deprivation-induced PC12细胞的细胞毒性。PC12细胞进行预处理美国litwinowii-250 (7.75μ2 h g / mL),然后被暴露于血清/葡萄糖剥夺一个额外的24 h和各自的初始浓度美国litwinowii。的孵化high-glucose介质在整个治疗期间作为对照组,治疗只有血清/ glucose-free媒介24小时仅作为血清/葡萄糖剥夺组。表达的细胞生存能力的百分比(%)的控制采用MTT测定值。数据呈现方式 ± 三个独立实验的SEM ( = 3 )。*:P值< 0.001时相对于对照组;组合:P相对于SGD值< 0.01;†††:P相对于SGD值< 0.001。

预处理与美国litwinowii提取(7.75 -250μg / mL)在不同浓度显著减毒SGD-induced在PC12细胞毒性。因此,浓度在62.5和125μg / mL可以被视为保护(图2)。没有明显毒性作用当PC12细胞被孵化美国litwinowii提取(7.75 -250μg / mL)(数据没有显示)。








图2
与DCFH-DA染色流式细胞仪测量ROS生产培养PC12细胞对照组,血清/葡萄糖剥夺组,和预处理美国litwinowii(15 - 250μg / mL) +接触血清/葡萄糖剥夺。预处理组,PC12细胞暴露在血清/葡萄糖剥夺的美国litwinowii(15 - 250μ只有24 h g / mL)。ROS生产评估根据光纤荧光强度的变化,DCFH-DA的氧化产品。数据呈现方式 ± 三个独立实验的SEM ( = 3 )。*:P值< 0.001时相对于对照组;__:P相对于SGD值< 0.05。

如图2越少,毒性被认为与125年预处理后的PC12细胞μ克/毫升美国litwinowii提取。也有不利影响,享年250岁μg / mL,这揭示了启蒙的细胞毒性在这样一个浓度。

3.2。的影响美国litwinowii提取血清/葡萄糖Deprivation-Induced海拔在PC12细胞中活性氧的生产

分子探针DCFH-DA用于监测细胞内ROS水平的改变与流式细胞术。阐明提取物的抗氧化作用,细胞暴露在压力条件处理后美国litwinowii提取(31 - 250μg / mL)和荧光强度测量。

ROS生产测量暴露后的PC12细胞血清/葡萄糖不足24小时有或没有的预处理美国litwinowii提取(31 - 250μg / mL)。如图2、血清/葡萄糖不足24小时可以显著提高DCF-positive细胞的数量说明海拔ROS相比生产控制。流式细胞术分析是由WinMDI软件。纵轴是荧光强度,细胞ROS含量成正比,而横轴区分细胞计数。图2表明预处理与相同浓度,从而增加细胞的可行性美国litwinowii提取(62.5和125μg / mL),导致显著的衰减ROS SGD(图后生产2)。

4所示。讨论

考虑到高的经济和社会负担的缺血性脑损伤和神经退行性疾病,研究其原因和预防是至关重要的。在现代医学中,停止缺血性损伤的最重要的手段是通过药物治疗,在合成或草药形式。显然,研究草药在治疗和预防疾病的手段,他们的行为会导致积极的结果。美国litwinowii伊朗是一个流行的草。Tayarani-Najaran et al .,在研究其apoptogenic特性对癌症细胞系最近证明(8];然而,研究其抗氧化效果和影响神经细胞株尚未进行。PC12细胞系研究了以前神经缺血模型,但这些研究进行了合成药物或其他草药。有研究ROS生产后高血糖的压力在PC12细胞系,但研究藏红花提取潜在的有益剂(11,12]。ROS生产氧化损伤的影响以及抗氧化剂治疗的作用是由几项研究评估(13,14]。抗氧化药物治疗已经大大利用患者的缺血性脑损伤,已成功在很大程度上讨论Gilgun-Sherki et al。15]。这是第一个研究的保护作用美国litwinowiiPC12细胞系。

在这项研究中,最初的积极和消极影响美国litwinowiiMTT测定根中提取的。有一个减少治疗后细胞死亡与特定数量的浓度培养条件PC12细胞提取的。这表明有一个活性物质与保护潜在的礼物美国litwinowii根提取物。

急性颅内血管的阻塞限制血液流向大脑区域供应。流的大小减少间接血流量的函数,这取决于个人的血管解剖学和闭塞的地方。脑血流量下降到零导致死亡的脑组织内的4到10分钟;值< 16毫升/每分钟100 g组织引起梗塞在一小时内;和值< 20毫升/每分钟100 g组织引起缺血无梗塞,除非延长几个小时或几天。如果血流量恢复大量细胞死亡之前,病人可能经历只有短暂的症状,也就是说,短暂性脑缺血发作。周围组织的核心区域梗死缺血但可逆功能失调,称为缺血半影。半影可能通过使用perfusion-diffusion成像和核磁共振成像。缺血半影遗嘱最终梗塞流,如果没有变化,因此挽救缺血半影血管再生治疗的目标。这个半影乐观地对药物治疗的反应,包括抗氧化剂治疗。 Pharmacotherapy also provides opportunity for the patient to be prepared for revascularization surgery, thus, relenting on time.

根据刘,活性氧产量的增加也可能负责SGD-induced细胞毒性(16]。同意这些调查结果,我们发现,细胞内ROS SGD后产量显著增加。发现爱已提到ROS调解的损伤后发生短暂性脑缺血和梗塞的界限不明的地区造成的永久性缺血(17),被认为是可能的候选人阐明急性中枢神经系统损伤的发病机制,成为一个重要的治疗目标讨论其他地方(18- - - - - -20.]。在这项研究中,治疗美国litwinowii被证明有效地阻止SGD-induced ROS生产,表明细胞内ROS生成的抑制作用可能参与的神经保护效应美国litwinowii在缺血性细胞损伤从而证实其抗氧化作用。

到目前为止,两个主要的研究一直在进行美国litwinowii,评估其抗肿瘤作用及其抗氧化性能。在这项研究中Tayarani-Najaran等人的二氯甲烷总提取物美国litwinowii据报道,细胞毒性效应对人胃腺癌(AGS),人类宫颈癌癌细胞系(海拉),和人类乳腺癌细胞系(MCF-7)和大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)行(8]。在另一项研究中,CH2Cl2一部分methanolic美国litwinowii根提取物被发现通过凋亡诱导细胞凋亡通路在人类早幼粒细胞白血病细胞21]。小个人提取成分的研究美国litwinowii(例如,汉黄芩素和neobaicalein)被证明是apoptogenic海拉细胞(22]。Neobaicalein黄酮类隔绝美国litwinowii还发现针对线粒体凋亡通路在白血病细胞系。在当前的研究中,这种植物的抗氧化性能进行评估,它已被证明美国litwinowii既有antitumoral和抗氧化特性。

有多种成分在提取总这样一个串行隔离的化合物和个人分析每个可以最终确定确切的化学物质负责这样的效果。汉黄芩素和黄芩甙元是这种植物的许多成分,到目前为止已被隔离。分析每个可能铺平道路的走向清晰的发现真实的有效成分。之后,将会有一个需要评估药物的药效学其次是药代动力学分析,最终导致药物开发。

汉黄芩素、黄芩黄素和黄芩苷黄芩属都显示拥有ROS清除活动。这些化合物也造成损耗的人类肝癌细胞株中谷胱甘肽含量,因此人们认为这些化合物的抗癌活性还可能涉及到prooxidant机制(23]。羟基的数量替换主体结构的类黄酮影响抗氧化和copper-initiated prooxidant活动。通常,更多的羟基替换骨干类黄酮的结构,较强的抗氧化剂和prooxidant活动。类黄酮与多个羟基替换显示antiperoxyl激进活动甚至强于Trolox, 生育酚模拟(24]。更高浓度的可能的原因美国liwinowii失去保护作用与血清/葡萄糖剥夺PC12细胞可能是由于更高浓度的prooxidant化合物的提取。

最后,目前的研究表明美国litwinowii治疗改善SGD-induced细胞培养的PC12细胞毒性,和它的保护作用可能是介导的抑制细胞内ROS生产。这项研究的神经保护作用美国litwinowii表明其可能应用在临床预防和治疗常见的神经的侮辱。

确认

作者要感谢博士h . Nasirli协助流式细胞术。这项工作是由格兰特(不支持。88406)从研究事务马什哈德医科大学的医学博士论文的一部分。