文摘

硫柳汞在水溶液和生成氯化乙基被广泛用作防腐剂。我们已经调查了毒理学的硫柳汞在正常人类的星形胶质细胞,特别重视线粒体功能和生成特定的氧化剂。我们发现氯化乙基不仅抑制线粒体呼吸导致稳态膜电位的下降,但也与这些现象增加并发过氧化物的形成,过氧化氢和芬顿/ Haber-Weiss氢氧自由基生成。这些氧化剂增加细胞醛/酮的水平。此外,我们找到一个氧化剂受损的线粒体DNA的水平提高了5倍基地和增加mtDNA伤口和blunt-ended减免的水平。高度受损的线粒体具有非常低的膜电位,增加超氧化物/过氧化氢生产,广泛受损mtDNA和蛋白质。这些线粒体似乎经历了一次渗透过渡,一个观察Caspase-3活动支持的五倍增加硫柳汞治疗后观察。

1。介绍

1.1。硫柳汞、氯化乙基

硫柳汞是一种防腐剂,广泛应用于医疗产品,包括作为防腐剂在疫苗,免疫球蛋白制剂,皮肤试验抗原,抗蛇毒血清,眼和鼻产品,和纹身油墨,是由49.6%的氯化乙基重量(1]。硫柳汞暴露很多的广泛使用对其潜在的毒性作用,尤其和新生儿。我们报告的一系列实验结果使用普通人类的星形胶质细胞培养(NHA)暴露于硫柳汞研究化合物对星形胶质细胞线粒体的影响。

1.2。氧化应激和大脑

大脑利用20%的氧气消耗的身体但构成身体的只有2%的质量2]。大约5%的氧气消耗减少可能出现的过氧化物(3]。绝大多数细胞中产生的过氧化物来自分子氧的反应与黄素或醌自由基,这是部分生成期间呼吸在线粒体呼吸链复合物(4]。的活性氧(ROS)生产急剧增加,增加线粒体膜电位(3]。在细胞超氧化物半衰期很短的迅速歧化酶通过胞质Cu-Zn超氧化物歧化酶(SOD)或Mn-SOD在线粒体基质中,分子氧和过氧化氢生产。因此,过氧化氢过氧化物的生成总是伴随着生产,所以打开了氢氧自由基(HO的可能性^•)一代通过芬顿/ Haber-Weiss化学(5]。芬顿金属,包括铁和铜,促进生产^•从超氧化物/过氧化氢和自由,unchelated过渡金属细胞内水平非常低,通常都存储在一个氧化状态。通常情况下,这些金属紧密地绑定到各种metallochaperones,如三价铁螯合剂铁蛋白。

1.3。病患在人类抗氧化剂

星形胶质细胞是大脑的主要支持细胞和他们的一个关键特性是他们能够成为“活性”传染性病原体和使用化学武器,移植伊诺产生高水平的一氧化氮和NADPH氧化酶生成过氧化物、过氧化氢、过氧硝酸盐和其他氧化每个物种(见[6内)和引用)。的类型和水平的抗氧化酶NHA相当不同于其他细胞类型和不同酶的水平抗氧化酶的变化当NHA从“稳定”过渡到“活性”状态。在许多细胞类型的主要防御过氧化应激是selenol包含酶包括谷胱甘肽氧化酵素(GPx)和硫氧还蛋白还原酶(TrxR)。GPx可检测水平不存在在人类“惰性”星形胶质细胞在正常的大脑7]和GPx似乎只出现在高水平的“活性”星形胶质细胞(8,9]。TrxR水平在正常人类大脑也低,但明显升高老年痴呆症患者的大脑中,特别是在淀粉样斑块的“活性”存在星形胶质细胞(10]。它已经表明,在培养NHA TrxR表达式是在严格监管下,增加与基底的水平很低,细胞因子和生长因子的控制下11]。

抗氧化蛋白,包括线粒体的酶类V,是一个重要的类过氧化物/过氧亚硝基解毒酶对有机汞敏感(12]。像selenol-based抗氧化酶,这些thiol-based抗氧化蛋白只在非常低的水平在人类星形胶质细胞(13]。

有很多证据表明,过氧化氢酶,而不是半胱氨酸或selenocysteine-based氧化酵素,是“稳定”的主要酶的过氧化物酶NHA [14]。NHA也有高水平的减少谷胱甘肽(GSH),能够通过直接化学解毒过氧化物,和高水平的所有三个超氧化物歧化酶(15,16]。过氧化氢酶和锰超氧化物歧化酶都调节星形胶质细胞受到氧化应激(14,16]。在细胞类型selenol /含硫醇氧化酵素是解毒的主要酶过氧化物,有机汞毒性往往造成损失的抗氧化酶的功能加上氧化剂产量的增加(17,18]。

有大量文献研究有机汞毒性的作用,涉及selenoenzymes TrxR、谷胱甘肽过氧化物酶GPx,看到18]和引用在其中;然而,这些数据可能不适用于NHA,特别是“惰性”NHA似乎并没有充分利用这些有机汞敏感的解毒酶。

1.4。本地化Organomercury-Induced损伤

氯化乙基是亲脂性的阳离子可以穿过血脑屏障19- - - - - -22]。甲基的辛醇/水分区系数和氯化乙基1.4到1.8 (21,23),在细胞内的pH值和Cl⁻),因此有机汞化合物都将主要作为亲脂性的阳离子存在细胞内。米切尔表明,亲脂性的阳离子线粒体内积累,Nernstian时尚,由稳态膜电位(24]。考虑到典型的星形胶质细胞和神经元的线粒体膜电位是在140 - 170号25),一个会,之前的线粒体内,预计这些有机汞化合物的浓度大约1000倍的胞质浓度。

1.5。氯化乙基和线粒体

我们假定,这种化合物是优先采取分成NHA造成损伤的线粒体呼吸链和随后的活性氧产量。细胞线粒体的损伤导致凋亡级联反应的激活和随后的细胞死亡(3,4,24,26- - - - - -31日]。这可能是临床相关的设置港口一个已知的或未知的线粒体疾病的病人。设置的线粒体疾病,一个特定的线粒体毒素可能是生活改变或危及生命。

我们设计了这一系列的实验来检查Thimerosal-derived氯化乙基人类星形胶质细胞凋亡的影响,选择一个时间段的细胞检查治疗后,将展示细胞凋亡的早期阶段。我们建议通过检查细胞在早期阶段,60分钟后氯化乙基剂量,我们可以想象化合物对线粒体和线粒体DNA的影响(mtDNA)。

2。方法

正常的人类星形胶质细胞(NHA)获得Lonza (Walkersville,医学博士,美国)和发展他们的建议。NHA种植confluency在星形胶质细胞细胞基础培养基补充3%的边后卫,谷氨酰胺,胰岛素,fhEGF, ga - 1000和抗坏血酸在好吧Lab-Tek幻灯片钱伯斯(Nalge Nunc,罗切斯特,纽约,美国),240年的总量l

2.1。探测器在活细胞

NHA与探针固定前1小时孵化。固定在缓冲多聚甲醛(PFA)分两个阶段进行。首先,一个50l整除的冰冷的PFA 8%添加到每个好,然后轻轻吸气,PFA井两次洗了冰冷的2%,然后在4°C允许完全修复。后固定细胞被洗两次x1 PBS(美国热费希尔科学,罗克福德,IL)。坦克被从幻灯片,以及区域覆盖着Fluoromount-G(美国IL SouthernBiotech) cover-slipped和密封的指甲油。

DNA使用1可视化赫斯特33258(猫没有。H1398),线粒体膜电位与500 nM Mitotracker红色(27(猫没有。使用5 M22425),过氧化氢M H₂DCFAM [31日,32(猫没有。D399),线粒体超氧化物和5代M MitoSOX红色(26(猫没有。M36008);何^•化验使用5M羟苯基荧光素(32)(高通滤波器)(猫没有。H36004),试剂获得分子探针(尤金,或者美国)。

2.2。探测器在固定细胞

固定细胞permeabilized使用x1 PBS和特里同x - 100年的0.1%。联氨反应性醛/酮使用225的标签M Biotin-XX酰肼(33(猫没有。B2600)和可视化使用德克萨斯红亲和素(猫没有。A820)。

Caspase-3固定的活动,0.1% Triton permeabilized细胞测量使用分子探针R110-EnzChek分析工具包(猫没有。E13184),孵化细胞1 h在37°C [34]。

2.3。DNA标签

DNA的测量和量化3′哦(ddTUNEL)、氧化DNA碱基(台塑- - - - - -ddTUNEL)和钝的使用ddTUNEL和blunt-ended结扎进行我们最近的出版物中描述(35,36]。生物素化的ddUTP和生物素化的生硬的寡核苷酸探针可视化使用分子探针FITC标记抗生物素蛋白(猫没有。434411)。

2.4。ddTUNEL

一个负2反应缓冲准备每日稀释股票解决方案1:5 TUNEL缓冲区(125毫米Tris-HCl 1米钠甲次砷酸盐,1.25毫克/毫升BSA, pH值6.6)和25毫米氯化钴股票的解决方案,1:25。每两次洗在这个反应缓冲,然后用50孵化l反应缓冲区包含20个单位/毫升负2和250 nM Biotin-16 -ddUTP(罗氏在美国)。标签是使用标记FITC-avidin(猫没有。434411)。

2.5。CIAP- - - - - -ddTUNEL

每个样本,此前经历了ddTUNEL,洗和孵化3 30分钟然后的缓冲区50l相同的缓冲含100单位/毫升的小牛肠碱性磷酸酶(σ)2小时,新生成的3′→3′哦,结束。

2.6。Fpg-ddTUNEL分析

后ddTUNEL /CIAP- - - - - -ddTUNEL,覆盖所有3′哦/ 3′PO₄以真实、标记抗生物素蛋白,样本在10毫米洗两次玫瑰,10毫米氯化钠,2毫米EDTA和0.1% BSA然后50l相同的缓冲含100单位/毫升formamidopyrimidine DNA糖基化酶(台塑)(USB,克利夫兰,哦,美国)应用于每一个井,然后孵化一个湿润的盒子2小时。每个样本被两次x1 PBS(美国热费希尔科学,罗克福德,IL) NEBuffer 3和两倍50l相同的缓冲含100单位/毫升CIAP应用于每个部分和孵化2小时;然后进行了第三轮样品ddTUNEL和FITC-avidin标签。

2.7。Blunt-Ended DNA断裂

我们使用的生物素化的版本blunt-ended oligonuleotide调查前所述[36]。威尔斯在结扎preincubated缓冲区没有探针(66 mM-Tris HCl, pH值7.5,5毫米MgCl₂、0.1毫米dithioerythritol 1毫米ATP, 15%聚乙二醇- 8000),以确保即使饱和。缓冲区是吸气,结扎将包含结扎缓冲与探针,35克/l和0.5 U /l T4 DNA连接酶(美国新英格兰生物学实验室,伊普斯维奇,MA)是应用于部分,然后孵化湿盒里过夜。

2.8。硫柳汞

硫柳汞≥97% (HPLC)和未指明的regeants都来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国),除非另有说明。硫柳汞的解决方案准备在x1 PBS(美国热费希尔科学,罗克福德,IL)最大浓度为360米和10l被添加到240年l星形体积。NHA 3% FCS在场媒体在整个时间进程。生成时间进程图所示1NHA暴露在Mitotracker, H₂DCFAM和赫斯特。增加10l整除被添加在10分钟的间隔,在序列不同的井,所以,所有的细胞暴露于记者的长度相同,但是不同的时间接触硫柳汞。

2.9。显微数字化

信号使用尼康收购Eclipse TE2000-E荧光显微镜配有CoolSnap ES数码相机系统(RoperScientific)包含一个ccd - 1300 y / HS 1392×1040由珀尔帖效应成像阵列冷却装置。

图像记录和分析使用尼康NIS-Elements软件和图像存储为.jpeg200和jpg文件。

3所示。结果

3.1。线粒体膜电位的变化和ROS生成硫柳汞孵化

氯化乙基对荧光的影响水平的三个记者调查在两个方面。浓度依赖性的氯化乙基NHA研究通过添加至0 - 14.4M硫柳汞细胞媒体。此外,我们调查了时间变化引起的增加14.4米硫柳汞、10、20、30、40、50分钟前固定在60分钟。我们成像中心的三个独立的井,在每个时间点或浓度,收集的三个记者的荧光水平平均44±18个人星形胶质细胞中心。在图1我们展示的变化水平的MT和活性氧(通过DCF形成)作为硫柳汞浓度的函数(图1(一))和14.4的变化引起的孵化随着时间的推移M硫柳汞。

可以看出,低浓度的氯化乙基导致增加两个信号。增加活性氧的发现氯化乙基代并不奇怪,考虑到众所周知的影响这个代理在扰乱细胞硫醇/ glutathione-based抗氧化防御系统(20.,22,30.]。线粒体膜电位的超极化是意想不到的,因为线粒体去极化已经观察到在大多数细胞凋亡前。在更高浓度(> 7.2硫柳汞)的线粒体信号和DCF的观察。这个失去信号,当比较> 7.2M < 7.2硫柳汞,关联和细胞形态的变化,细胞收缩和折边质膜和气泡的形成。

ethylmercury-induced时间进程的变化如图1 (b),我们看到,活性氧物种的生成是一个早期事件,有一个增加活性氧生成之前,线粒体膜电位的变化。细胞密度的水平开始下降> 40分钟,细胞活性氧的水平下降,这记者也对应的观测细胞收缩和细胞质气泡的形成。

3.2。Colocalization Mitotracker和ROS:硫柳汞增加线粒体ROS的生成

在图2我们展示的colocalization线粒体ROS信号的高分辨率图像控制NHA治疗60分钟为14.4硫柳汞。在图2(a)、上面板,我们现在Mitotracker(红色),ROS-induced DCF(绿色)和核赫斯特染色(蓝色)的NHA×60倍的放大的缺乏(左)和存在(右)为14.4硫柳汞。所有三个电池板的荧光水平相匹配的两个图片,这样的颜色绝对水平反映信号水平,表明硫柳汞引起线粒体膜电位下降约50%,ROS增加2倍。很明显,大多数细胞中线粒体的蠕虫状的网络,似乎有一个强大的colocalization线粒体和ROS信号。

在图2(b)所获得的图像的控制和治疗细胞×150放大显示。在这里,红色的线粒体信号乘以14.4的4倍M Thimerosal-treated星形胶质细胞,从而允许视觉识别这些细胞内线粒体的分布。所示的三个细胞治疗相当代表的人口与中央细胞萎缩和高度扭曲的细胞核。广场轮廓区域的细胞,我们目前个人Mitotracker和ROS图片,和这些选择的荧光团的覆盖图像区域,图2(c),这些图像清楚显示,一个橙色“马蹄”型信号控制细胞,如图2(b),由一个网络的线粒体和线粒体网络镜像在DCF, ROS,形象。治疗细胞的线粒体信号的相关性也表示,和治疗的细胞我们已经确定了一个“闪电”形状的线粒体网络。可以观察到这个“闪电博尔特”功能由mitotracker积极的线粒体和DCF网络信号。

这两个图片在图2(b)运行一个对角线从左上角到右下角。底部面板,图2(d),显示了强度的MT, DCF,和赫斯特这两条线(MT硫柳汞处理图像信号×4)。红线对应的荧光信号太,赫斯特的蓝线,绿线ROS生成的贴现。在这两个情节有一个额外的黑线,匹配线形状和DCF信号振幅。这黑色的线是我们适合ROS信号,基于amplitudinal MT和赫斯特的变化。在控制面板中ROS信号最佳模拟是0.44乘以太信号和0.39乘以赫斯特的信号。Thimerosal-treated细胞的内赫斯特染色和DCF水平之间的关系建模,在控制细胞的3% 0.38乘以赫斯特荧光。然而,符合太标签是截然不同的,最好的模拟生成一个值为0.117的比率实际太ROS信号。我们比较了模拟符合实际的光纤信号的互相关和发现山坡上1在这两种情况下,±0.01值大于0.99的控制和治疗细胞。因此,硫柳汞治疗病患线粒体产生四倍的ROS控制线粒体,但稳态代ROS地区没有线粒体,尤其是细胞核,是不变的。

3.3。ROS损伤和线粒体膜电位

在图3我们从ROS显示损坏,醛/酮(羰基)的形式,也与线粒体膜电位,更多的羰基存在Thimerosol NHA治疗。图3(一个)显示控制和14.4M硫柳汞准备使用MT和赫斯特,然后处理Biotin-XX酰肼羰基标签,这是使用FITC-Avidin可视化。

图3(一个)显示控制/ Thimerosal-treated细胞,所有三个荧光体有相同的规模。我们选择的图像大ethylmercury-treated细胞,有些代表性的人口规模分布、大细胞允许容易线粒体网络的歧视。值得注意的是,有一个绿色的ROS增加受损细胞内容作为核的距离的函数,在两个图像。图中的两个盒子3(a)我们选择突出显示领域太和羰基信号之间的相关性。这些区域显示为单一的图片太和羰基,和合并后的图像,如图3(b)。很明显,在控制细胞的线粒体网络与羰基的网络,但也有一些定义良好的结构网络显示的证据表明,氧化应激,不与线粒体有关。我们看到一个类似的模式Thimerosal-treated星形胶质细胞;有很明显的线粒体和羰基和结构网络包含ROS损伤的证据,但没有极化线粒体。两个垂直的线条图3(一个)显示的位置生成荧光团的荧光体被审问概要文件如图3(c),三种颜色代表不同的荧光团,太(红色),羰基(绿色)和赫斯特(蓝色),黑线是模拟相结合产生的活性氧损伤的水平太和赫斯特信号的分数。在两个样品的模拟是一个贫穷的匹配实际ROS-induced信号,但控制细胞给更穷的适应比Thimerosal-treated星形胶质细胞。互关联的ROS和羰基的仿真水平为控制和生成的0.75和1.1 ethylmercury-treated细胞,并证明值只有0.68和0.86,分别。因此,尽管我们观察到线粒体ROS高度本地化的一代(图2),标记的细胞分布与线粒体ROS损伤局部甚少。

因此,蛋白质痛苦ROS损伤,所以有羰基,从地区运输损坏。囊泡含有高水平的羰基存在控制和治疗细胞;然而,在我们观察的细胞与氯化乙基孵化大量小,< 500海里,丛生的氧化材料。这种材料的一个可能的起源是它代表了絮凝的受损的线粒体无法维持膜电位,如线粒体渗透性转换后所产生的效果(4]。这凝结的线粒体凋亡的早期阶段期间曾被描述和显示的结果的激活BH3域的伯灵顿(38]。

3.4。Colocalization ROS损伤和mtDNA伤害:硫柳汞mtDNA攻击

我们最初认为阳离子,亲脂性的氯化乙基应该分区到线粒体基质,积累应该由线粒体膜电位。mtDNA局限于线粒体基质,增加稳定状态的ROS舱应该作为一个记者的氧化应激。我们检查的3′DNA断裂或哦台塑不稳定的修改DNA碱基使用ddTUNEL和台塑- - - - - -ddTUNEL [35,额外的醛/酮(羰基)使用Biotin-XX酰肼。细胞生长在没有或14.4的存在M硫柳汞被标记的存在3′哦DNA缺口(ddacylated DNA碱基(TUNEL)或氧化/Fpg-ddTUNEL)使用生物素化的ddUTP。这些DNA末端与德州Red-Avidin可视化使用FITC-Avidin和羰基,又和核贴上赫斯特,图4。在图的信号4显示(蓝色)原子核,羰基(红色),(绿色)DNA末端(图3′哦4(一))或(绿色)台塑不稳定的DNA碱基(图/ apurinic或apyrimidinic网站4(b)),反映出四个图片的荧光团的水平。插入,图4(c),已经进入最后阶段的细胞凋亡,因此显示大量的3′哦DNA末端。在图4(c) ROS信号已经除以四的一个因素ddTUNEL信号的5倍,而图4(a)和(b)的比较图4(c)和4 (a)和(b)显示,在一个小时的孵化我们不是全面的观察细胞凋亡,特点是核DNA碎片,确实是观察细胞死亡的早期阶段。

什么图4显示有明显colocalization DNA损伤和羰基的存在。受损的DNA是胞质,而不是核,表明线粒体DNA损伤。通过展示colocalization线粒体DNA的损伤和细胞溶质的ROS nha,我们表明,线粒体可能是负责ROS的产生的氯化乙基的主要诱发凋亡级联。

3.5。在氧化剂的身份由氯化乙基线粒体

我们测量了活性氧的生产,使用探测MitoSox线粒体超氧化物,而且测量^•通过羟苯基荧光素(高通滤波器),3′DNA结尾哦ddTUNEL和blunt-ended DNA断裂NHA孵化与14.4 1小时硫柳汞,图5。图5(一个)显示,记者对超氧化物和HO)^•是高度与,给吗R²的值> 0.98,因此超氧化物生成导致芬顿/ Haber-Weiss化学线粒体内。治疗与氯化乙基NHA导致增加90%每细胞过氧化物生成,即使在同等条件下我们观察线粒体膜电位下降50%。反褶积超氧化物和何鸿燊^•信号表明氯化乙基的存在导致多出60%^•代/过氧化物。数据5(b)和5(c)表明,超氧化物生成与无核武器国家,因此mtDNA破坏的形式ddTUNEL 3′哦DNA结束,也极具破坏力的blunt-ended DNA断裂(36]。这两个绿色通道的扩展数据5(b)和5(c)不同的4倍,这表明有平均9倍3′哦结束有DNA断裂控制线粒体。

3.6。全球变化,线粒体功能和细胞损伤从接触氯化乙基NHA结果

在图6我们提出一个酒吧图显示改变我们观察总结NHA后14.4小时的接触硫柳汞。所有情节代表平均水平对控制细胞的信号。五张图片来自三个平行实验,平均每视野44±18个人的星形胶质细胞,和SD误差代表的人口。

氯化乙基引起膜电位下降50%星形胶质细胞在1小时。伴随这崩溃在膜电位我们观察一个显著增加各种活性氧的水平。内部的线粒体稳态水平的过氧化物增加70%,细胞治疗是通过增加细胞活性羰基肼匹配。使用H₂DCF-AM我们观察稳态活性氧化剂的生产增加了200%,从反褶积我们知道线粒体生成(图2)。线粒体DNA,而不是核DNA,更容易受到ethylmercury-induced损伤。我们观察线粒体DNA的水平增加了240%优惠,3′哦DNA缺口增加300%和460%氧化水平增加基地/ apurinic或apyrimidinic网站。mtDNA本地化在线粒体基质,它遵循的主要网站,这是ROS生成。何鸿燊的增加300%^•是大于80%的增加超氧化物的一代。芬顿/ Haber-Weiss化学是主要的发电机^•在生物系统5],这一发现表明氯化乙基也增加芬顿的水平金属,如铁和铜,星形胶质细胞内的线粒体。

在酒吧的最后一对Caspase-3活动的水平的变化,以研究的乳沟Z-DEVD-R110衬底。我们也找到Caspase-3活动增加了五倍,表明这个途径在Thimerosal-treated细胞被激活。

4所示。讨论

我们发现治疗NHA引起线粒体超氧化物的增加与氯化乙基生成如图5。然而,增加超氧化物生成相同的蛋白质羰基含量的增加,如图6。H₂O₂全身形成dichlorofluoresein H₂DCF-AM只有大约20%大于超氧化物/羰基形成,这表明过氧化物酶的损失函数不是NHA氯化乙基毒性的一个特性。这符合甲基汞的影响在海拉细胞,线粒体基质生成的过氧化物也受到牵连,最具破坏性的ROS (39]。海拉细胞可以通过上调线粒体免受甲基汞毒性Mn-SOD但不是胞质铜/ Zn-SOD、GPx或过氧化氢酶。

大部分蛋白质羰基在控制和ethylmercury-treated NHA也与线粒体,如图2。过氧化物测量通过H₂DCF-AM和蛋白质羰基来自线粒体ROS生成如图所示的colocalization信号与特定的线粒体超氧化物探针,MitoSox,如图5。这些研究结果与已知的ROS生成广泛共识的两侧内线粒体膜在正常的线粒体(40)和甲基汞对啮齿动物的影响星形胶质细胞夏克尔同事观察到(30.),因为他们也发现,线粒体是增加超氧化物的主要生产基地的一代。

除了测量过氧化/过氧化物生成我们还研究了何鸿燊的形成^•使用特定的探测HPR和使用台塑- - - - - -ddTUNEL分析氧化DNA碱基的措施。鸟嘌呤的转换8-hydroxyguanine 8-hydroxyguanine更多乙内酰脲DNA氧化损伤,spiroiminodihydantoin guanidinohydantoin,一般认为是由于^•或芬顿试剂(oxy-ferry;=)和oxy-cupryl= O⁽²⁻⁾)[41]。

8-hydroxyguanine、spiroiminodihydantoin guanidinohydantoin的基质台塑- - - - - -ddTUNEL分析(35,42]。在图4我们证明,而受损的核DNA的水平和mtDNA非常低在未经处理的细胞中,ethlymercury诱发大量增加氧化mtDNA病变。最高水平的损坏mtDNA和蛋白质羰基发生在似乎絮凝的线粒体的结构。氧化,这些颗粒状结构是不存在的谷物使用Mitotracker,当羰基丰富的谷物可以被识别,如图2。这些蠕虫状的结构也是治疗细胞标记中确定与特定的探测超氧化物和HO)^•如图5。然而,尽管我们观察的水平增加胞质(因此线粒体)blunt-ended优惠和裂纹在图5非常高水平的DNA断裂以颗粒形式不存在。因此,这些絮凝的线粒体代表终端线粒体状态和之间的密切相关性台塑- - - - - -ddTUNEL和Caspase-3 upregulation图所示6,它是合理的结论这些线粒体进行了渗透过渡(20.),导致释放proapoptotic蛋白质细胞色素c和暗黑破坏神膜间隙、mitoposis Caspase-3的启动凋亡级联(4]。

4.1。的机理超氧化物、过氧化物和^•代NHA

它早就知道,有机汞与铁硫反应中心(43];事实上甲基汞被用作帮助确定汞加合物iron-sulfur几十年来蛋白质晶体结构。有机汞的反应与铁硫中心在顺乌头酸酶导致的损失等蛋白质酶的功能,形成有机汞硫醚加合物,并暴露在散货水相氧化还原活性铁或释放自由铁。它已经表明,在小鼠大脑线粒体iron-sulfur复杂丰富的酶NADH /醌氧化还原酶(复杂I)对甲基汞(高度敏感44]。在勒贝尔等人的研究发现,甲基汞神经毒性部分铁介导的(37]。强有力的iron-chelator、去铁胺保护大鼠小脑ROS注射后的甲基汞。铁螯合物还保护神经元免受活性氧甲基汞暴露,但没有证据表明deferoxamine-mercurial复杂的形成(37]。甲基汞治疗孤立的线粒体,从大脑、小脑和肝脏,引起呼吸抑制,增加超氧化物/过氧化氢形成[29日),主要是通过对琥珀酸脱氢酶。琥珀酸脱氢酶在矩阵的三个iron-sulfur中心内部的线粒体膜的可能是抑制和可能的铁释放这些集群硫化/铁对嗜硫试剂不稳定,p-chloromercuribenzoate [45]。

根据这里的工作报告和其他,我们建议的机制有机汞的毒性,图解形式如图所示7。亲脂性的阳离子,氯化乙基将集中在星形胶质细胞,对细胞外的大部分阶段,等离子体膜电位后45号46)5.6倍褶皱,胞质ethlymercury将分区到线粒体倍1000倍,其积累由近似180 mV线粒体膜电位25),图7(一)。

线粒体内氯化乙基将与iron-sulfur反应中心,导致铁的释放到线粒体基质,人物7 (b)。

的角色ethlymercury活性氧物种形成和解毒如图7 (c)。氧化还原酶的iron-sulfur中心(例如,琥珀酸脱氢酶)当受到有机汞不仅创造了自由铁,(图7 (b)我),但也形成intraenzyatic碳激进的物种(图7 (b)II)会与氧气反应产生过氧化物,(图7 (b)III)。超氧化物可以自由铁反应生成,亚铁离子,或者由线粒体Mn-SOD dismutated成过氧化氢。亚铁离子、过氧化氢反应生成高度氧化自由基,氢氧自由基,(图7 (b)(四),代理涉及病理学和老化47,48]。过氧化氢的含量通常会降低线粒体抗氧化剂,包括glutathione-dependent selenol / thio-based氧化物酶,如GPx和TrxR。然而,这些酶是由有机汞间接抑制谷胱甘肽的耗竭,(图7 (b)V),直接由活性位点的限制selenol /硫醇有机汞,(图7 (b)(六)。

因此,铁催化的释放芬顿/ Haber-Weiss化学形成的高度氧化^•。何^•有多个目标,包括传感器的复杂而且mtDNA渗透过渡。高水平的医院^•导致Mitoposis,导致细胞色素c从线粒体和细胞凋亡的起始。我们发现由于氯化乙基接触NHA线粒体基因组损伤。我们发现DNA缺口,增加优惠和最重要的是,在氧化水平的基地。线粒体通常有150份mtDNA和暴露于环境的压力,在老化或错误的数量免费拷贝mtDNA经历的衰落。根据哈曼的自由基/线粒体老化理论[47,48),由线粒体ROS的产生导致mtDNA损伤和突变。这些反过来导致进行性呼吸链赤字,这导致更多的活性氧产量,生产一个积极的反馈回路。

这项研究的结果表明,氯化乙基人类星形胶质细胞线粒体毒素。我们认为,这一发现很重要,尤其是线粒体功能障碍的疾病数量与正在迅速增加。

确认

卫理公会医院研究所的工作是由“孤独症代言人”,青翠的基础,神经外科研究亨利·j·n·托布基金宝琳Sterne沃尔夫纪念基金会,基金会卫理公会医院。美国洛佩兹在整个研究提供了宝贵的技术支持。