文摘
神经系统的Periplaneta美国蟑螂是用于广泛的药理研究,包括电生理技术。介绍了其作为制备toxinological发展的研究在以下电生理学方法:double-oil-gap技术在孤立的巨大的轴突,膜片箝DUM神经元(背未配对中位数),微电极技术原位条件在连接和DUM神经元轴突在神经节,和单纤维oil-gap技术在持续腹腔神经节突触。最后提到了蟑螂synaptosomal制备中的应用。
1。介绍
蟑螂,尤其是Periplaneta美国物种,被认为是一个非常有用的模型在神经生物学研究[1]。领域toxinology很大程度上要归功于使用各种神经准备从这昆虫。Periplaneta美国代表了一个优秀的模型应用于不同的药理学方法,尤其是电生理学,扮演了一个至关重要的部分在toxinology在大多数的研究活动。它可能是基于使用自然和“人工”的准备工作,例如转染非洲爪蟾蜍卵母细胞。描述了各种神经功能的基础上,研究神经系统的各个部分蟑螂(图1(一))和实验可以进行自然模型。昆虫神经系统功能的生物物理原则在哺乳动物一样。两组动物能找到类似的神经递质,虽然他们的分布变化。因此,观察蟑螂几乎可以应用于脊椎动物。另一方面,一些节肢动物神经毒素显示高选择性昆虫神经系统和它们bioinsecticides视为有效。蟑螂模型主要是用来描述他们的行动方式。在接下来的段落,使用蟑螂准备将各种电生理方法,连同他们的贡献toxinology的发展。
2。巨大的轴突和单纤维Double-Oil-Gap方法
胞体和树突树p .美国巨大的中间神经元,位于腹腔神经节,已经确定了很长一段时间。他们拥有无髓鞘的,非常长(1.5 - 2厘米),大直径(50μm)轴突。轴突胶质雪旺细胞包围,能手动(图中分离出来1(b))在显微镜下,可以观察到他们的活动使用double-oil-gap分手方法精制电生理学technique-Figure2(一)2- - - - - -5]。这样轴突准备展品简单生物电子性质;一种压敏电阻器的钠和钾(Kdr)可以找到渠道;他们是负责生成短(0.5 ms)动作电位。Double-oil-gap技术许可,在current-clamp,唤起大(100 mV)轴突动作电位(图2(b) (A)),遵循他们的进化和控制静态电位以及当地反应的程度。被动轴突膜的特点(电阻和电容)可以使用更长时间分析(例如,5 ms)超极化脉冲(图2(b) (b));长去极化脉冲的应用程序允许观察延迟整流(图2(b) (b))。
在电压钳位配置中,去极化电压脉冲诱发短,内心执导,tetrodotoxin-sensitive钠电流和推迟,noninactivating外向钾电流(图2(d)),最敏感的3、4 diaminopyridine [6];超极化脉冲被用来记录泄漏电流。在持有的潜在−60 mV,大约50%的钠电流灭活;这失活是完全删除当惠普达到−80 mV,在这些条件下,可以观察到一个更大的电流,同样被Pichon报道(2)(图2(e))。Double-oil-gap方法有几个优点:(1)录音是稳定和持久的(1小时),(2)各种实验协议在current-clamp电压钳可以应用,(3)检测分子的数量可以是很小的(例如,0.2毫升10−7米的高度活性物质),(4)它是便宜的。然而,一个孤立的轴突的制备是一个复杂的过程,需要经验。
巨大的轴突的活动也可以记录原位条件在整个神经索(7]。在这种情况下,轴突离开其在神经链,与他人保持联系的轴突及其微环境改变而孤立的轴突要少得多。一个连接是desheathed之后,巨大的轴突成为微电极的访问。介绍他们允许记录准确的轴突的静态电位半生理上的微环境。细胞外的刺激,甚至进行一些毫米距离,引起动作电位和动作电位振幅大小相似记录从孤立的轴突(图2(c)),然而,长脉冲刺激只能加速动作电位的产生。轴突的可访问性原位测试分子更有限,然而,它们可以被认为是更多的生理的影响等条件。
Double-oil-gap方法被用于toxinological研究多年。历史悠久的抗虫蝎毒素开始使用这种方法,当在1970 - 80年代,从北非蝎子毒素净化(Androctonus南极光Hector-AaH它,钳蝎属judaicus -Bj)教授Eliahu Zlotkin并从耶路撒冷希伯来大学的合作者,以色列,将进医学院学习,法国马赛的(8),首次测试在蟑螂孤立巨轴突由Marcel Pelhate生理学教授,法国昂热大学(9,10]。毒性试验和生化研究,特别是通过绑定化验,这种毒素的特异性,已证实了电生理实验。在后来的岁月里,故事的发展,越来越多的现代方法的应用和目前很多细节节肢动物毒素的选择性昆虫是已知的(11- - - - - -13]。他们的适用性bioinsecticides正在审理(12,14,15]。
蝎子毒素,钠离子通道活动,分为两个大组:α和β毒素,修改主要通道的失活和激活,分别12,13,16,17]。在α毒素,α如小组建立了(18,19]。insect-selective毒素,镇静剂和兴奋性β毒素。一些毒素与这些群体进行了测试和他们的作用方式是决定使用单纤维oil-gap方法。它有助于区分兴奋性和镇静剂毒素组。最特色的轴突的生物电活动引起的修改(啊IT1兴奋性毒素Androctonus南极光赫克托耳,Bj IT1Buthotus judaicus- - - - - - (9,10,20.];Bm 32-VI和Bm我钳蝎属martensi- - - - - - (21];是一个轻微的去极化,减少对动作电位阈值生成(图3(a) (a)和(B)),和重复的活动而不是单个响应电流刺激(图3(一)(C))。轴突的能力来生成这样的破裂排放体现尤其是人为再极化或超极化(图3(一)(D))。尊贵的轴突兴奋性的增加引起钠电流振幅-膜电位及其延长观察低压脉冲(图3(b))。电流电压依赖性钠的分析揭示了在当前电压依赖性钠转向更多的负面膜电位(20.]。在毒性的测试中,这些毒素导致立即收缩瘫痪苍蝇幼虫和快速兴奋性“混战”效应在蝗虫8,10),保持一致的观察在电生理实验中完成的。
“镇静剂毒素”这个名字来源于他们造成的弛缓性麻痹在苍蝇的幼虫。组内的毒素(Bj IT2 - (10];毒素从天蝎座maurus palmatus毒液,22];机器人IT3和机器人IT4钳蝎属occitanus tunetanus- - - - - - (23,24];BmK ITa和BmK胫钳蝎属martensiKarsch - [23];Lqh IT2 - [25在静态电位)明显增加钠渗透性,诱导相对快速的去极化和不同的动作电位振幅下降(图3(c) (A)和(B)),最终阻断传导(图3(c) (c))。在电压钳实验中,观察峰值钠电流的降低,然而,随着恒流的发展,在保持潜在等于轴突静态电位,即−60 mV。
也有病例发现的毒素影响轴突兴奋和镇静剂的电生理活动之间的出现中间团体,例如:BcTx1从东非蝎子Babycurus centrurimorphus(26]或机器人IT2,此外,诱导一个新的、不寻常的电流与缓慢激活/失活动力学[23,24,27]。机器人IT2 insect-selective;其结合位点是类似于一个啊IT1兴奋性毒素,但氨基酸序列类似于在镇静剂的毒素(23,24]。类似的修改轴突由机器人IT2生物电活动已经证明使用毒素从蚂蚁的毒液,Paraponera clavata蟑螂,还测试了孤立的轴突(28]。
电生理效应的比较分析几种兴奋和镇静剂毒素表明这两组之间的歧视毒素并不容易,当然不可能只生物电活动的基础上修改。平行的生化和结构研究是绝对必需的。正如上面提到的,这两个组织的毒素属于一个非常大的群β在钠离子通道毒素结合受体4 (13,14,17]。
从南美蝎子毒素七世,Tityus serrulatus,是一个典型的β生物毒素没有选择任何团体(29日,30.]。对蟑螂轴突也可以被描述为介于兴奋和镇静剂的毒素。存在的毒素,休息去极化观察会同倾向于重复的排放。钠电流激活负电位比正常;这是长期的,但保持电流发展慢的镇静剂毒素(31日]。
蝎子α毒素结合受体部位3对钠离子通道和抑制通道的失活(12]。在电压钳实验中,短钠电流长时间在去极化电压脉冲(图4(b));钾电流没有修改。在current-clamp,短动作电位是扩展和转化成高原动作电位(图4(a))。这些影响被观察到当第一个抗虫毒素Lqhα它从Leiurus quinquestriatus hebraeus蝎毒是蟑螂孤立的轴突(测试32,33]。后,几个新的抗虫毒素Lqh相似一个特征进行描述,例如机器人IT1 [23,24]。
α毒素(Lqhα)也是蟑螂巨大的轴突上测试过原位条件。第一个观察到效果,毒素的应用程序后,重复一代略延长动作电位,以应对短期stimulation-such效应从未被观察到的实验孤立巨大的轴突(图4(c))。后来,高原动作电位有时出现(图4(d)),但它从来没有那么长时间的与世隔绝的轴突,即使经过长时间的应用高毒素浓度。轴突的影响微环境由胶质细胞和其他轴突在这件事上是一个很有可能的因素。,有必要考虑的实验条件可能会有所不同从生理的一个非常多样化的程度,进而可能影响显著的影响测试分子。
电生理实验进行蟑螂轴突帮助定义一个新的群蝎神经毒素:α例如毒素。这些分子的受体部位与钠通道受体部位3,α毒素结合(18,19]。α例如毒素并不会表达对昆虫和哺乳动物的钠离子通道选择性。药物的特点α例如毒素相似但不相同的α神经毒素。他们引导高原势,但除此之外,他们去偏光逐步轴突膜。他们抑制钠电流的失活,但程度较轻Lqh的情况α它。此外,出现尾电流,增加当去极化脉冲应用重复(每5秒),同时,峰值钠电流减少(18,19]。
随着科学的进步,现代分子生物学技术应用和蝎子抗虫毒素的“新时代”。其中最值得注意的方法对这一问题迄今为止提供的教授Michael Gurevitz Dalia戈登博士从植物的分子生物学和生态学,以色列特拉维夫大学。他们和他们的合作者孤立的遗传物质负责蝎毒的毒素的合成,它们定义了cDNA序列和开发人工表达系统(33- - - - - -36]。新的,Lqh重组毒素αITr [36),Lqh IT2 [37]和Bj-xtrIT [38),测试蟑螂孤立巨大的轴突,显示相似的行动以本机方式。这样的研究提供了一个非常有价值的结论:正确处理的重组毒素的活性是本地的一样。这是一个巨大的一步toxinology领域的。如今,重组毒素可以在更大的数字比本机分子和进一步突变的出现是可行的。现在关键是抗虫选择性的分子基础研究,以及anti-mammalian特异性。
毒性测试,结合研究和电生理记录以及分子建模、基因克隆和基因定点诱变创造了一个机会来研究毒素的分子基础的活动。实验上执行α例如毒素从钳蝎属martensiKarsch使用蟑螂轴突显示单个氨基酸的突变可以改变完全毒素的行动模式39]。一句话:“一个氨基酸的故事”很可能总结multiapproach镇静剂毒素研究的历史悠久Leiurus quinquestriatus hebraeus。在实验中孤立的轴突的蟑螂,它已经表明,氨基酸的替换的位置从Asn 58 Asp能够完全改变毒素的作用方式。同时,其亲和力钠离子通道的目标及其毒性降低。从这些研究结论如下:Asn在位置58起强制作用抑制剂活性的毒素(13,40]。
蟑螂的孤立的轴突也用于测试获得的毒素从蜘蛛的毒液。在大多数情况下他们延长动作电位的持续时间,然而,高原动作电位产生的只能存在钾通道阻滞剂。当前的失活是钠抑制毒素的存在,但从来没有等一定程度的蝎子α毒素(41- - - - - -43]。Postapplication Lqh的α增加晚期钠电流记录在去极化脉冲(Stankiewicz、个人观察)。
3所示。DUM神经元膜片箝和微电极技术
在1989年和1990年两篇文章描述的应用膜片钳技术在神经内分泌的研究活动背未配对中位数(DUM-Figure1(c))从终端神经节神经元Periplaneta美国神经索发表(44,45]。单DUM细胞分离技术和膜片箝记录了在实验室的神经生理学在法国昂热大学教授布鲁诺Lapied。DUM神经元具有内生起搏器活动依赖于范围广泛的离子膜电导(46]。各种类型的受体提供了一个非常精确的调节神经元的自发活动和神经内分泌功能。DUM神经元代表一位杰出的模型来研究细胞内过程(47- - - - - -49)以及药理测试(50,51]。他们也被用于toxinological实验。
有几个DUM细胞实验与观察同时执行一个孤立的轴突。尽管DUM神经元代表一个更复杂的模型比轴突的生物电活动,观察相似和conclusions-compatible [25,52]。背景考察DUM神经元上的钠离子通道(bNa)使用膜片箝cell-attached技术(53]。他们似乎是一个新的Lqh目标α毒素,比经典的压敏更敏感的钠通道在这准备。bNa有限的活动在膜电位−50 mV (DUM神经元静态电位)和Lqh下可以“解放”α它在非常消极的行动或(−90 mV)膜电位。毒素的存在(10−8米),未聚集的,短暂的单通道开口控制(−50 mV)变成了大,多步振幅破裂活动,隔开一段沉默。打开通道的概率增加了20倍。这样的频道活动对应转换DUM神经元中观察到:从正常跳动,自发活动有节奏的破裂(53,54]。
背景DUM神经元的钠离子通道也的目标β从巴西蝎子毒素(七),Tityus serrulatus,毒液55]。毒素的存在,single-amplitude开口渠道取而代之的是事件的几个不同的subconductance当前水平。通道开放概率增长了大约50倍和类似的开放时间持续时间;此外,很长时间的事件出现。古典压敏电阻器钠离子通道也被修改的方式的典型β毒素。钙成像的实验进行了增加细胞内钙浓度的毒素七世。这种现象的一个非常复杂的研究证明高压的参与激活n型钙通道和noncapacitative钙激活的条目(NCCE)。一个重要的结论来自这些研究,减少NCCE的活动可能是一个有用的策略发展的药物antienvenoming治疗(55]。
DUM神经元的活动也可以观察到原位使用微电极技术条件。终端腹腔神经节和神经索,desheated和固定。神经元留在他们的位置在周围神经节神经胶质细胞和其他神经元。DUM神经元被自发动作电位时,微电极进入细胞。神经元活动的模式类似于录音了孤立的细胞,然而,毒素的影响并不完全相同。的应用α毒素(Lqhα,10−5和10−4米)从来没有诱导高原动作电位原位;只有从常规发射转变成破裂观察活动和爆炸产生的轻微的去极化(图5 (c))。下神经节,DUM细胞主要是神经胶质细胞的影响,以及其他神经元;因此,离子微环境仍然部分原状。为了研究毒素的作用机理,应该使用孤立的神经元通过一切手段,然而,原位实验在某些情况下可能揭示更多关于有毒分子的生理效应。两个神经毒素观察孤立和之间的交互原位DUM细胞也不同(Stankiewicz et al .,在准备)。
(一)
(b)
(c)
4所示。Cercal Nerve-Giant中间神经元突触和单纤维Oil-Gap技术
信息产生的机械刺激的蟑螂cercal感觉神经元传播给巨大的中间神经元。Cercal神经X和XI是与巨大的中间神经元树突树通过抑制和兴奋性突触,分别位于腹腔神经节。可以观察到这些突触的活动使用单纤维oil-gap技术(图6(一)),由教授让-雅克•Callec雷恩大学(56,57),后来改进和应用多年教授伯纳德色调从实验室昂热大学神经生理学,法国(58- - - - - -60]。这种方法允许自发和诱发的细胞外记录兴奋性突触后电位(EPSP)和抑制性突触后电位(IPSP) [57,60,61年]。神经XI分为兴奋性及其纤维激活烟碱受体的突触后膜。统一的兴奋性突触后电位(uEPSP)结果从单一的刺激头发覆盖尾毛的机械;由突触后电位(cEPSP)习cercal神经电刺激的影响。在这种突触的突触前脸,毒蕈碱的受体存在,所扮演的角色由负反馈调节乙酰胆碱释放(62年]。毒蕈碱的受体还发现在突触后膜(63年]。刺激神经X唤起抑制性突触后电位(IPSP)通过激活GABA受体(61年]。单纤维oil-gap方法允许执行长期实验(甚至12小时)和神经节的适应灌注使获得可靠的剂量反应曲线。使用的iontophoretic应用乙酰胆碱或氯化氨甲酰胆碱对突触后膜附近许可区分预处理和突触后测试药物的行动。突触准备从蟑螂药理研究代表了一个非常有用的模型,然而,获得高质量的稳定的准备需要大量经验。
蟑螂突触模型允许测试在胆碱能受体活性的毒素。蛇毒是一个著名的来源。α-bungarotoxins k-bungarotoxins完全阻塞uEPSP和cEPSP 10的浓度−7M。所有实验执行协议表明,神经元突触后烟碱受体和毒素的块α金环蛇毒素是更有效的64年,65年]。蝎子α毒素Lqhα它诱导突触后自发活动大幅增加,也就是说,在uEPSP的频率和振幅(数字6(b)和6(c)),以及在cEPSP的幅度和持续时间(图6(d))。更高的突触前活动导致增加乙酰胆碱的释放,然而,它激活了负面的反馈通过突触前毒蕈碱的受体,几分钟后毒素的行动,可以观察到突触后活动减少(Stankiewicz、个人观察)。
使用单纤维实验执行oil-gap方法与蜈蚣,蜈蚣sp,毒液决定其组件诱导蟑螂突触后膜的去极化和减少EPSP振幅。与阿托品预处理后这样的效果是有限的。随着研究上执行果蝇毒蕈碱的受体(Dm1)表示非洲爪蟾蜍卵母细胞,这是证明的毒液蜈蚣由一个组件作为受体激动剂对昆虫毒蕈碱的受体(66年]。
最后,实验上执行蟑螂突触准备了研究可以解释化学神经毒素之间的协同交互的机制:拟除虫菊酯(氯菊酯)和氨基甲酸盐(残杀威)67年]。这些研究的结论对实际的实现很重要领域的作物保护。
5。从蟑螂神经索Synaptosomal准备
蟑螂的神经索(Periplaneta美国)也被用来准备突触体,包含神经终端功能的囊泡。synaptosomal准备很容易获得和被应用在一些药理试验。作为例证,结合化验的放射性标记的毒素已经成功具有突触体(24,42,43,68年]。此外,研究光亲和标记的使用125年我TsVII作为配体在突触体的神经索蟑螂表示第一次蝎子毒素受体的分子量的昆虫神经系统被认为是与电压敏感Na+渠道(68年]。最近准备也成功应用于绑定涉及放射性标记的研究蜘蛛毒素的钠离子通道(德利马,准备)。从电生理实验结果往往来自蟑螂synaptosomal准备使用神经系统完成。
6。总结
蟑螂的神经系统(Periplaneta美国)可以被认为是一个非常有用的模型准备在多个电生理技术,它允许进行不同程度的神经系统药理测试组织。面对获得的结果表明,毒素可能影响的活动相同的神经结构与多元化的影响,根据实验条件和这个结论之前应该考虑任何明确的声明关于任何毒素的作用方式。
确认
科技部支持的工作是和波兰的高等教育;批准号N N303 320637。m·德利马被FAPEMIG支持斗篷,CNPq, INCTTOX赠款在巴西。m . Dąbrowski是博士的受益者格兰特在项目中“加强教育潜在Nicolaus哥白尼大学的数学和自然科学的学科;(项目号POKL.04.01.01-00-081/10),“波兰。玛丽亚Stankiewicz表达感谢Marcel Pelhate教授,教授伯纳德色调,和教授布鲁诺Lapied Laboratoire de Neurophysiologie(目前Recepteurs et Canaux Ioniques Membranaires)昂热大学教学法国,她技术本文中描述的蟑螂和慷慨的将她处理所有实验室的设施在许多年。也非常感谢所有的合作者,特别是Dalia戈登博士和教授Michael Gurevitz来自特拉维夫大学、以色列。