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毒理学杂志》
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毒理学杂志》/2011年/文章

研究文章|开放获取

体积 2011年 |文章的ID 808967年 | https://doi.org/10.1155/2011/808967

撒迦利亚Panagiotis Mitsopoulos大肠Suntres, ”该文就近年来关于百草枯所致细胞毒性发生保护作用对脂质体的防治作用和基因表达”,毒理学杂志》, 卷。2011年, 文章的ID808967年, 14 页面, 2011年。 https://doi.org/10.1155/2011/808967

该文就近年来关于百草枯所致细胞毒性发生保护作用对脂质体的防治作用和基因表达

Panagiotis Mitsopoulos1,2和 撒迦利亚大肠Suntres1,2

1医学科学部门,安大略省北部医学院的桑德贝,在加拿大

2湖首大学生物学系,桑德贝,加拿大

学术编辑器:p . j . O ' brien
收到了 2010年12月03
修改后的 2011年1月20日
接受 2011年1月31日
发表 2011年04月04

文摘

百草枯(PQ)是一种除草剂,优先积累在肺癌和发挥其细胞毒性通过活性氧簇(ROS)的产生。没有特定的治疗百草枯中毒。尝试,以提高肺使用抗氧化剂的抗氧化状态(如超氧化物歧化酶、维生素E、防治作用),但这种治疗方法的结果是有限的。封装的抗氧化剂在脂质体提高他们对oxidant-induced肺损伤的治疗潜力,因为脂质体促进细胞内交付和延长保留裹入细胞内。在目前的研究中,我们比较传统的防治作用的有效性(NAC)和liposomal-NAC (L-NAC)对PQ-induced细胞毒性和检查机制(s)这些抗氧化剂配方赋予cytoprotection。南汽的影响或L-NAC PQ-induced A549细胞的细胞毒性评估通过测量细胞PQ吸收,细胞内谷胱甘肽含量、ROS水平,线粒体膜电位,细胞基因表达,炎性细胞因子释放和细胞生存能力。预处理的细胞与L-NAC明显比预处理与传统药物更有效减少PQ-induced细胞毒性,生物标记表示的用于本研究。我们的研究结果表明,南汽的交付作为脂质体配方改进其有效性在抵消PQ-induced细胞毒性。

1。介绍

百草枯(PQ)是一种除草剂,优先积累在肺癌和发挥其细胞毒性效应通过活性氧的生成(ROS) [1- - - - - -3]。许多研究把重点放在了增加肺的抗氧化状态使用各种抗氧化剂防止PQ损伤,包括抗氧化酶(例如,SOD)、维生素(如抗坏血酸,α生育酚)和低分子量thiol-containing抗氧化剂(如谷胱甘肽(GSH)、防治(NAC))但这种治疗方法的结果是有限的或没有成功2- - - - - -11]。这些抗氧化剂的失败认真修改除草剂的毒性,大多被归因于他们无法跨越细胞膜障碍和/或他们的快速从细胞间隙3,4,6,7,10,11]。近年来,它已被证明,抗氧化剂的封装脂质体提高他们对oxidant-induced肺损伤的治疗潜力,包括PQ肺毒性,因为脂质体促进细胞内交付和延长保留时间的裹入细胞内代理(3,6,12- - - - - -15]。

脂质体是磷脂脂质影响封闭一个水舱组成的囊泡。亲水分子可以封装在水空间、亲脂性的分子可以被纳入脂质影响。脂质体,除了使用人工膜系统,用于抗氧化剂和其他治疗药物的选择性交付不同的组织足够的浓度可有效改善组织损伤。相对轻松的将亲水、亲脂性的治疗药物脂质体,直接交付的可能性脂质体身体易访问的网站,如肺、脂质体的相对nonimmunogenicity和低毒性使脂质体系统极具吸引力的药(3,12,16]。

在目前的研究中,我们比较传统的南汽和liposomal-NAC的有效性(L-NAC)对PQ-induced细胞毒性和检查机制(s)这些抗氧化剂配方cytoprotection授予。免费防治是一种低分子量thiol-containing抗氧化剂与自由基清除属性(3,17,18]归因于其硫醇基的亲核性和氧化还原交互(17,18]。此外,南汽是半胱氨酸的来源,通常限制的前兆新创谷胱甘肽合成(17,19,20.]。谷胱甘肽是一种重要的抗氧化剂,因为它是最丰富的非蛋白硫醇存在于活细胞,及其水平是常用的作为细胞内抗氧化状态的指标。此外,南汽已被证明影响redox-sensitive细胞发出信号和转录途径,如NF -κB(调节促炎基因),p38, ERK1/2, SAPK /物,c-Jun, c-Fos途径,其中,在各种不同的系统17,21,22]。防治作用可以促进细胞生长和生存通过激活MAPK通路,以应对ROS-induced伤害(这通常导致增长逮捕和细胞凋亡),能够限制炎症过程,如释放促炎细胞因子(22]。这些行动可能发挥作用在其cytoprotective效果。因此,南汽的cytoprotective效应或L-NAC PQ-induced在人类肺腺癌A549细胞毒性评估通过测量细胞PQ吸收,细胞内谷胱甘肽含量、ROS水平,线粒体膜电位,细胞基因表达,炎性细胞因子释放,和细胞生存能力。A549细胞具有许多重要的生物学性质的肺泡上皮II型细胞(23,24),已被证明是有用的为研究肺泡II型的代谢和高分子加工贡献在肺上皮细胞的药物传输机制(25]。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和化学物质

人类肺泡型II-like上皮A549细胞(写明ATCC没有。ccl - 185美国类型文化收藏,马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)保持在0.2合演μm通气帽细胞培养瓶(美国纽约康宁,康宁公司)与标准杜尔贝科修改鹰的培养基营养混合物F-12火腿(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)补充含铁10%牛牛血清(SAFC生物科学、Lenexa菅直人美国),2毫米l谷氨酰胺(美国加州Gibco,卡尔斯巴德)和抗生素/抗真菌的(100 U /毫升青霉素,100μ克/毫升链霉素和0.25μg / mL两性霉素B;Gibco)。文化孕育在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2在空气和亚文化汇合的80%。在电镀之前,细胞计数和异常评估使用Vi-Cell XR细胞生存能力分析仪(贝克曼库尔特,米西索加、加拿大)。百草枯(百草枯二氯化x-hydrate Sigma-Aldrich)溶解在蒸馏水和稀释培养基准备特定的治疗浓度。实验用无血清的媒体。

单独确定南汽的细胞毒性,细胞治疗与控制媒体或媒体含有不同浓度的NAC(0到50毫米最终NAC浓度)。确定南汽的影响或L-NAC PQ的毒性,细胞首先使用控制、空脂质体- (EL)南汽,或L-NAC-containing媒体4 h(5.0毫米),其次是控制或治疗PQ-containing媒体。

2.2。防治(NAC)准备

NAC (TLC N-acetyl-L-cysteine SigmaUltra > 99%;Sigma-Aldrich)溶解在PBS和调整pH值7.4 0.1股票的解决方案。后过滤灭菌(0.2μ孔隙大小的过滤器),具体数量股票的防治解决方案被添加到培养基预处理/治疗的细胞。南京汽车股票每天是新鲜的。

2.3。Liposomal-N-Acetylcysteine准备

Liposomal-N-acetylcysteine (L-NAC)准备从DPPC的混合物(dipalmitoylphosphatidylcholine)和南汽在7:3摩尔比率通过使用dehydration-rehydration方法中描述(13]。脂质体囊泡与亚微米粒子大小确定筛选器(Nicomp模型270)补液和被发现后平均181.5±19.6 nm直径。南汽的封装效率DPPC-liposomes被测定为18.5%。

2.4。细胞生存能力

用MTT细胞生存能力测量(3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴)测定如前所述在[26]。异常的细胞评估相对于控制的挑战。

2.5。测定细胞内南汽和PQ浓度Ultraperformance液相色谱(UPLC)

南汽的细胞内水平、PQ、谷胱甘肽是由一个ultraperformance液相色谱(UPLC)方法使用水域Acquity系统配备一个二进制溶剂经理,一个自动化的样品经理,和一个光电二极管阵列检测器(水域,米尔福德,海量存储系统(Mss)中,美国)如前所述Mitsopoulos和Suntres [26]。简单地说,每次治疗后,通过胰蛋白酶化细胞收获,洗两次磷酸盐(PBS),细胞溶解通过声波降解法(20多岁,幅度100%;声波Dismembrator型号500,费舍尔科学,匹兹堡,Pa,美国),离心,然后通过一个0.2μm过滤器。超滤液被注入到一个Acquity UPLC高速钢T3分析列(2.1毫米身份证×150毫米长度,1.8μ米粒子)与先锋2.1毫米身份证×5毫米长度列,在30°C。流动相由23毫米甲酸铵(3)pH值0.250毫升/分钟的流量。南汽、PQ、谷胱甘肽测定波长的200.3,257.7,和202.1 nm,分别和值归一化总蛋白质使用微劳莱总蛋白质Kit-Peterson的修改(Sigma-Aldrich),按照制造商的说明。

2.6。测定活性氧的水平

细胞内活性氧水平是由与CM-H染色的细胞2DCFDA (5 - (6 -) chloromethyl-2′, 7′-dichlorodihydrofluorescein二乙酸,乙酰酯)(分子探针,尤金,矿石,美国)在(PBS如前所述26]。流仪分析使用BD FACSCalibur流式细胞分析仪(美国BD生物科学,加州圣何塞)与BD CellQuest Pro软件。最少10000的事件是获得每个样本。

2.7。线粒体膜电位的测量

线粒体膜电位评估使用MitoProbe JC-1试验装备的流式细胞术(分子探针)。挑战后,细胞用PBS和彩色30分钟JC-1 (5、5′, 6, 6′-tetrachloro-1, 1′, 3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine碘),一个展品potential-dependent积累在线粒体的阳离子染料,在标准孵化条件下。染色细胞脱离板表面和悬浮在PBS流仪分析使用FL1-H和FL2-H渠道的BD FACSCalibur流式细胞分析仪(BD生物科学)与BD CellQuest Pro软件。最少10000的事件是获得每个样本。线粒体去极化被红色荧光强度下降表示由于浓度红色荧光J-aggregates的形成。

2.8。基因表达分析

基因阵列分析细胞的挑战与0.25毫米PQ 4 h后预处理控制,NAC-containing或L-NAC-containing媒体(5.0毫米4 h)进行详细之前在26使用人类的压力和毒性PathwayFinder RT)2分析器PCR(表数组1;SA生物科学)。
加入资源库。 基因名字 象征 褶皱变化
控制媒体+ PQ P价值 南汽+ PQ P价值 LNAC + PQ P价值
氧化/代谢压力
NM_005953 金属硫蛋白2 MT2A 1.17 0.127 −1.07 0.616 1.33 0.229
NM_002133 血红素加氧酶1 (decycling) HMOX1 1.14 0.531 1.34 0.170 −1.16 0.456
NM_000962 Prostaglandin-endoperoxide合酶1 (G / H的前列腺素合成酶和环氧酶) PTGS1 1.10 0.671 1.34 0.208 1.50 0.026 * *
NM_001885 晶状体蛋白αB CRYAB 1.07 0.847 1.36 0.190 1.18 0.510
NM_002574 酶类1 PRDX1 1.07 0.505 1.05 0.367 1.04 0.662
NM_000454 超氧化物歧化酶,可溶性(肌萎缩性脊髓侧索硬化症1(成人)) SOD1 1.04 0.343 1.05 0.332 −1.07 0.200
NM_000581 谷胱甘肽过氧化物酶1 GPX1 1.01 0.812 1.05 0.395 −1.08 0.286
NM_000849 谷胱甘肽S-transferase M3(大脑) GSTM3 −1.02 0.833 −1.09 0.600 −1.03 0.743
NM_001752 过氧化氢酶 猫 −1.03 0.740 −1.31 0.136 −1.16 0.168
NM_000637 谷胱甘肽还原酶 GSR −1.08 0.594 −1.57 0.098 −1.46 0.111
NM_005809 酶类2 PRDX2 −1.12 0.528 −1.01 0.892 −1.22 0.573
NM_001461 Flavin-containing单氧酶5 FMO5 −1.28 0.154 −1.53 0.072 −1.60 0.065
NM_000499 细胞色素P450,家庭1亚一个多肽1 CYP1A1 −1.40 0.057 1.09 0.583 4.44 0.003 * *
NM_000941 P450氧化还原酶(细胞色素) 运动 −1.93 0.174 1.26 0.367 −2.70 0.122
NM_001979 环氧化物水解酶2,细胞质 EPHX2 −2.06 0.066 −2.24 0.225 −1.22 0.369
NM_000773 细胞色素P450,家庭2亚科E多肽1 CYP2E1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
NM_000780 细胞色素P450,家庭7,亚科,多肽1 CYP7A1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
NM_002021 Flavin-containing单氧酶 FMO1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
热休克
NM_005347 70 kDa热休克蛋白5 (glucose-regulated蛋白质,78 kDa) HSPA5 1.35 0.004 * * 1.24 0.026 * * −1.00 0.983
NM_007034 DnaJ (Hsp40)同族体,4亚科B,成员 DNAJB4 1.32 0.052 1.10 0.568 −1.02 0.813
NM_001539 DnaJ (Hsp40)同族体亚科,成员1 DNAJA1 1.29 0.048 * * 1.12 0.439 −1.08 0.443
NM_005526 热休克转录因子1 HSF1 1.14 0.074 1.08 0.253 1.13 0.354
NM_006644 热休克蛋白质1 105 kDa / 110 kDa HSPH1 1.14 0.253 1.03 0.551 1.03 0.612
NM_001
040年
141年		 热休克蛋白90 kDaα(胞质),类成员2 HSP90AA2 1.08 0.200 1.05 0.557 1.09 0.279
NM_002157 10 kDa热休克蛋白1 (chaperonin 10) HSPE1 1.07 0.414 −1.06 0.367 −1.07 0.503
NM_002156 60 kDa热休克蛋白1 (chaperonin) HSPD1 1.06 0.671 −1.15 0.312 −1.08 0.406
NM_006597 热休克蛋白质8 70 kDa HSPA8 1.02 0.922 −1.09 0.599 −1.33 0.060
NM_021979 70 kDa热休克蛋白2 HSPA2 1.01 0.908 −1.40 0.004 * * −1.46 0.003 * *
NM_002154 70 kDa热休克蛋白4 HSPA4 −1.06 0.523 −1.47 0.036 * * −1.71 0.004 * *
NM_007355 热休克蛋白90 kDaα(胞质),1 B类成员 HSP90AB1 −1.07 0.666 1.00 0.995 −1.61 0.058
NM_005345 70 kDa热休克蛋白1 HSPA1A −1.09 0.478 −1.29 0.102 1.00 0.957
NM_001540 27 kDa热休克蛋白1 HSPB1 −1.24 0.227 −1.00 0.924 −1.28 0.218
NM_005527 热休克蛋白质1 70 kDa HSPA1L −1.29 0.084 −1.65 0.032 * * −1.42 0.077
NM_002155 70 kDa热休克蛋白6 (HSP70B′) HSPA6 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
扩散/致癌作用
NM_001964 早期生长反应1 EGR1 1.97 0.039 * * 1.70 0.117 −1.24 0.395
NM_005190 细胞周期蛋白C 国家气候变化委员会 1.30 0.226 1.02 0.995 1.18 0.561
NM_182649 增殖细胞核抗原 PCNA 1.14 0.283 −1.08 0.461 −1.04 0.678
NM_053056 细胞周期蛋白D1 CCND1 −1.03 0.885 −1.28 0.225 −1.02 0.803
NM_004060 细胞周期蛋白G1 CCNG1 −1.05 0.410 −1.02 0.316 1.07 0.435
NM_005225 E2F转录因子1 E2F1 −1.28 0.473 −1.16 0.450 −1.94 0.107
增长逮捕/衰老
NM_004864 生长分化因子15 GDF15 1.91 0.000 * * 1.96 0.003 * * 1.37 0.045 * *
NM_004083 DNA-damage-inducible记录3 DDIT3 1.87 0.000 * * 2.17 0.000 * * 1.46 0.020 * *
NM_000389 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1 (p21 Cip1) CDKN1A 1.50 0.002 * * 1.72 0.001 * * 1.88 0.000 * *
NM_001924 增长逮捕和DNA-damage-inducible,α GADD45A 1.29 0.125 1.50 0.044 * * −1.01 0.942
NM_002392 Mdm2、转换3 t3细胞两分钟2,p53-binding蛋白质(鼠标) MDM2 1.26 0.119 −1.01 0.999 1.25 0.112
NM_000546 肿瘤蛋白质p53 TP53 1.14 0.294 −1.10 0.546 −1.11 0.353
NM_002178 胰岛素样生长因子结合蛋白6 IGFBP6 −1.19 0.186 1.04 0.761 −1.58 0.032 * *
炎症
NM_001562 白介素18 (interferon-gamma-inducing因素) IL18 1.49 0.010 * * 1.26 0.106 1.28 0.016 * *
NM_000575 白介素1α IL1A 1.47 0.085 1.18 0.481 1.88 0.020 * *
NM_000602 Serpin肽酶抑制剂,进化枝E (nexin,纤溶酶原激活物抑制剂1型),成员1 SERPINE1 1.38 0.035 * * 1.34 0.096 1.01 0.976
NM_000595 淋巴毒素α(肿瘤坏死因子超家族,成员1) 英国网球协会 1.22 0.458 1.38 0.141 −2.19 0.060
NM_003998 核因子k光多肽基因增强剂B细胞1(施敏原著) NFKB1 1.22 0.004 * * 1.12 0.092 1.36 0.000 * *
NM_002415 巨噬细胞迁移抑制因子(glycosylation-inhibiting因素) MIF 1.02 0.505 1.13 0.043 * * −1.06 0.331
NM_000576 白介素1,β IL1B −1.02 0.948 −1.69 0.357 −1.02 0.936
NM_002989 趋化因子配体21(碳碳主题) CCL21 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
NM_002983 趋化因子配体3(碳碳主题) CCL3 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
NM_002984 趋化因子配体4(碳碳主题) 亚兰 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
NM_001565 趋化因子配体(C-X-C主题)10 CXCL10 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
DNA损伤/维修
NM_000051 共济失调毛细血管扩张突变 自动取款机 1.21 0.318 −1.38 0.197 −1.07 0.727
NM_005431 x射线在中国仓鼠细胞修复补充缺陷修复2 XRCC2 1.19 0.125 −1.26 0.261 1.10 0.303
NM_003362 Uracil-DNA糖基化酶 ) 1.11 0.315 −1.01 0.882 −1.01 0.890
NM_000122 切除修复cross-complementing啮齿动物修复缺陷,互补群3(着色性干皮病B组补充) ERCC3 1.07 0.612 −1.26 0.271 −1.20 0.229
NM_005053 RAD23同族体(酿酒酵母) RAD23A 1.04 0.764 −1.00 0.956 −1.23 0.265
NM_007194 相关的检查点同族体(美国非洲酒) CHEK2 1.03 0.844 −1.32 0.111 −1.23 0.100
NM_001923 Damage-specific dna结合蛋白1,127 kDa DDB1 −1.11 0.403 −1.26 0.241 −1.54 0.041 * *
NM_001983 切除修复cross-complementing啮齿动物修复缺陷,互补群1(包括重叠的反义序列) ERCC1 −1.16 0.463 1.08 0.666 −1.48 0.278
NM_006297 x射线在中国仓鼠细胞1修复补充有缺陷的修复 XRCC1 −1.25 0.235 −1.29 0.226 −1.64 0.071
NM_007120 UDP glucuronosyltransferase 1家庭,多肽A4 UGT1A4 −1.30 0.319 −2.04 0.071 −1.50 0.283
细胞凋亡的信号
NM_001230 半胱天冬酶10,apoptosis-related半胱氨酸肽酶 CASP10 1.71 0.006 * * 1.25 0.194 1.35 0.110
NM_001154 膜联蛋白A5 ANXA5 1.42 0.025 * * 1.17 0.073 1.42 0.004 * *
NM_020529 核因子k光多肽基因增强剂b细胞抑制剂,α NFKBIA 1.20 0.097 1.35 0.014 * * 1.47 0.017 * *
NM_001228 半胱天冬酶8日apoptosis-related半胱氨酸肽酶 CASP8 1.15 0.184 −1.08 0.571 1.36 0.017 * *
NM_004324 BCL2-associated X蛋白 伯灵顿 −1.04 0.656 −1.12 0.503 −1.30 0.069
NM_003810 肿瘤坏死因子(配体)总科,10个成员 TNFSF10 −1.09 0.788 −1.15 0.444 −1.53 0.110
NM_033292 半胱天冬酶1,apoptosis-related半胱氨酸肽酶(白介素1β转化酶) CASP1 −1.11 0.818 −1.24 0.150 −1.19 0.627
NM_001065 肿瘤坏死因子受体超家族,成员1 TNFRSF1A −1.29 0.235 −1.15 0.610 −1.64 0.081
NM_138578 BCL2-like 1 BCL2L1 −1.46 0.028 * * −1.37 0.257 −1.42 0.340
管家
NM_001101 肌动蛋白,β ACTB 1.35 0.018 * * −1.17 0.251 1.23 0.152
NM_004048 Beta-2-microglobulin B2M - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
NM_000194 次黄嘌呤phosphoribosyltransferase 1 (Lesch-Nyhan综合症) HPRT1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
NM_012423 核糖体蛋白L13a RPL13A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
NM_002046 Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶 GAPDH - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
。
表1
基因的相对表达,通过微阵列分析,参与细胞中的细胞毒性压力和挑战与0.25毫米PQ 4 h后预处理控制,NAC-containing或L-NAC-containing媒体。基因的顺序列出细胞减少褶皱变化与PQ使用控制媒体和挑战。褶皱变化是表示相对于未经处理的控制细胞使用管家基因B2M, HPRT1 RPL13A, GAPDH。请注意。拟议的看家基因ACTB显著改变PQ挑战后,并没有这种能力在我们的研究中使用。 独立的实验。

细胞挑战常规RT - pcr分析显示使用RT执行之前2qPCR底漆化验(表2;SA生物科学)。概述的方法是类似的基因阵列除了1μL适当的底漆是手动添加到每个PCR iCycler智商96孔板(Bio-Rad)和覆盖着Microseal“B”电影(Bio-Rad)。
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加入不。		 基因名字 象征 褶皱变化
控制媒体+ PQ P价值 南汽+ PQ P价值 LNAC + PQ P价值 EL + PQ P价值
各种各样的基因
NM_00584 白介素8 IL8 2.23 0.007 * * 2.01 0.001 * * 1.74 0.010 * * 2.15 0.009 * *
NM_002746 增殖蛋白激酶3 MAPK3 1.47 0.404 1.45 0.472 1.86 0.151 1.55 0.378
NM_002228 小君致癌基因 小君 1.40 0.240 1.63 0.049 * * 1.36 0.174 1.09 0.606
NM_002750 增殖蛋白激酶8 MAPK8 1.18 0.847 1.45 0.544 1.03 0.907 −1.08 0.820
NM_000660 转化生长因子β1 TGFB1 1.13 0.593 1.34 0.245 1.26 0.316 1.07 0.664
NM_005252 V-fos FBJ小鼠骨肉瘤病毒致癌基因相同器官 ”丛书 1.02 0.866 1.63 0.417 1.09 0.958 1.04 0.737
NM_001315 增殖蛋白激酶14 MAPK14 −1.03 0.781 1.24 0.590 −1.01 0.930 −1.33 0.911
NM_000572 白介素10 IL10 −2.15 0.079 −1.82 0.126 1.09 0.889 −1.60 0.177
验证基因
NM_000576 白介素1,β IL1B 1.35 0.677 1.73 0.476 1.77 0.452 1.40 0.656
NM_020529 核因子k光多肽基因增强剂b细胞抑制剂,α NFKBIA 1.31 0.271 1.46 0.179 1.69 0.087 1.55 0.205
NM_000499 细胞色素P450,家庭1亚一个多肽1 CYP1A1 1.12 0.950 1.10 0.925 2.26 0.155 1.77 0.400
NM_000575 白介素1α IL1A 1.08 0.802 1.48 0.308 1.65 0.317 1.36 0.446
NM_000594 肿瘤坏死因子(TNF超科,2) 肿瘤坏死因子 −1.00 0.942 1.34 0.255 1.32 0.134 1.36 0.098
NM_000454 超氧化物歧化酶,可溶性(肌萎缩性脊髓侧索硬化症1(成人)) SOD1 −1.04 0.962 1.02 0.784 −1.43 0.263 −1.24 0.297
NM_001752 过氧化氢酶 猫 −1.12 0.852 −1.21 0.402 −1.30 0.299 −1.25 0.466
。
表2
基因的相对表达,通过常规rt - pcr分析,参与细胞中的细胞毒性压力和挑战与0.25毫米PQ 4 h后预处理控制NAC - L-NAC——或者EL-containing媒体。褶皱变化是表示相对于各自使用管家基因RPL13A未经处理的时间控制。 独立实验一式三份。
2.9。测量细胞因子水平

细胞播种到无菌25厘米2培养瓶(康宁)1.35×106细胞/瓶被孵化80%融合一夜之间,然后用PBS和使用控制,NAC-containing或L-NAC-containing媒体(5.0毫米4 h)其次是挑战与控制或PQ-containing媒体(0.25或1.0毫米4 h)。孵化后,媒体对细胞的细胞因子水平进行了分析使用人类Grp我7-Plex面板工具包(Bio-Rad)特定细胞因子白介素(IL) 1βil - 10、il - 6、引发,IL-15, TNF -α,使用Bio-Plex eotaxin 200系统(Bio-Rad)与Bio-Plex经理软件按照制造商的指示。

2.10。统计数据

数据提出了均值±S.E.米( )和分析使用成对的学生的统计学意义 以及, 被认为是重要的。规范化数据,成对的一个示例 以及进行比较方法1的假设的意思 。

3所示。结果

3.1。NAC对A549细胞的可行性

挑战与南汽的A549细胞浓度范围从0到10毫米没有任何影响细胞的生存能力后24 h NAC曝光。然而,相对于控制细胞生存能力下降了30% NAC治疗后观察到50.0毫米(图1(一))。NAC浓度的5.0毫米被用于所有后续实验。

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图1
2 __ NAC对细胞活力的影响(a)和吸收南汽在A549细胞(b)。细胞治疗的可行性与南汽浓度增加24小时使用MTT试验评估。酒吧代表的意思是±S.E.M. 3独立实验在八连音。相对于控制*表示差异显著。吸收的研究(b),细胞治疗与5.0毫米NAC -或L-NAC-containing媒体各种跨度为24小时;与UPLC法测定细胞内NAC水平节中描述。(实线:NAC治疗;虚线:L-NAC治疗)。数据点代表的意思是±S.E.M. 3独立实验进行重复。相对于NAC-treated集团表示差异显著。
3.2。南汽在A549细胞的吸收

NAC A549细胞的吸收是评估使用5.0毫米NAC治疗后UPLC -或L-NAC-containing媒体为0,1,2,4,8,24 h(图1 (b))。A549细胞的治疗与常规NAC导致增加NAC吸收2 h后治疗;此后,水平保持不变24 h后治疗。细胞治疗L-NAC展出增加吸收随着时间的推移,最大水平达到4 h后治疗。在所有调查情况下,南汽的A549细胞治疗后也显著大于L-NAC配方相比,南汽。

3.3。南汽和L-NAC预处理对细胞生存的影响后PQ的挑战

挑战与PQ A549细胞导致浓度减少细胞生存能力(图2)。细胞的生存能力受到挑战与PQ(0.1和0.5毫米)24小时在这些细胞使用L-NAC更高。相比之下,预处理与南汽或空白脂质体(EL)没有授予任何显著影响细胞PQ-challenged细胞在这些条件下的可行性。


图2
EL效应、南汽或L-NAC预处理PQ-challenged细胞的可行性。细胞进行预处理的可行性和控制媒体(没有预处理),或5.0毫米NAC - (NAC预处理)L-NAC——(L-NAC预处理)或空liposome-containing媒体(EL预处理)为4 h之前24小时PQ挑战(0、0.1、0.5或1.0毫米)使用MTT试验评估。酒吧代表的意思是±S.E.M. 3独立实验在八连音。*表示没有显著性差异相对于细胞预处理;北达科他州:不确定。
3.4。南汽和L-NAC预处理对细胞氧化还原状态的影响和PQ吸收PQ的挑战

接触的细胞浓度增加PQ 24小时显著降低细胞内谷胱甘肽含量,这与增加细胞PQ吸收,以UPLC(图3)。一般来说,预处理与L-NAC但不是NAC PQ-induced损耗降低导致细胞内谷胱甘肽水平的单元格内容。预处理对线性与南汽或L-NAC没有影响( )采用PQ A549细胞浓度增加的挑战PQ(图3 (b))。ROS水平提高后PQ曝光(图3 (c)),但预处理与南汽或L-NAC显著降低ROS水平在0.25和1.0毫米PQ-challenged细胞(4 h)基底或基质浅通过流仪结果CM-H水平评估2DCFDA-stained细胞(图3 (c))。

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图3
2 南汽效果或L-NAC预处理细胞内的谷胱甘肽水平(a), PQ (b),并在PQ-challenged细胞ROS (c)。细胞进行预处理4 h和控制媒体(没有预处理)或5.0毫米NAC - (NAC预处理)或L-NAC-containing媒体(L-NAC预处理)的挑战随着PQ浓度(0、0.1、0.5、1.0和5.0毫米)24 h。细胞收获细胞溶解,同时测量细胞内谷胱甘肽含量(a)和PQ吸收(b)通过UPLC总蛋白质分析和规范化。活性氧的测定,细胞被染色的细胞渗透CM-H 30分钟后治疗DCFDA荧光染料特定的氧化物种。贴壁细胞刮和分析流动cytometrically使用FL1-H通道。酒吧代表的意思是±S.E.M. 3个独立的实验。*表示没有显著性差异相对于细胞预处理。
3.5。南汽或L-NAC预处理对线粒体膜电位的影响后PQ的挑战

细胞线粒体膜电位的挑战与0.25毫米PQ 4 h显著降低相对于未经处理的控制细胞和进一步减少1.0毫米PQ的挑战。与L-NAC预处理是有效预防线粒体膜电位的下降0.25和1.0毫米PQ-challenged细胞,返回到基底的水平在前,以及增加近2倍相比,未经处理的控制细胞(图4)。相反,预处理与南汽显著预防线粒体膜电位的降低0.25毫米PQ-challenged细胞没有明显影响未经处理的控制或1.0毫米PQ-challenged细胞。


图4
南汽或L-NAC预处理对线粒体膜电位的影响后PQ的挑战。细胞进行预处理4 h和控制媒体或5.0毫米NAC - (N)或L-NAC-containing媒体(L)挑战了0,0.25或1.0毫米PQ 4 h。30分钟后治疗的细胞染色细胞渗透JC-1荧光染料。酒吧代表的意思是±S.E.M. 3个独立的实验。*表示没有显著性差异相对于细胞预处理。
3.6。南汽效果或L-NAC预处理后炎性细胞因子的分泌PQ的挑战

引发水平分泌细胞暴露于0.25毫米和1.0毫米PQ显著增加相对于未经处理的控制细胞(图5)。南汽和L-NAC预处理降低引发未经处理的控制细胞和0.25毫米PQ-challenged细胞,尽管L-NAC,但不是南京,也能够显著降低水平的1.0毫米PQ后引发的挑战。水平的il - 1β、il - 6、il - 10、IL15 TNF -α,eotaxin并不在这些条件下可靠地检测到。


图5
南汽或L-NAC预处理效果PQ曝光后引发的水平。细胞进行预处理4 h和控制媒体或5.0毫米NAC - (N)或L-NAC-containing媒体(L)挑战了0,0.25或1.0毫米PQ 4 h。收集细胞培养上清液后立即挑战,与此同时分析引发使用Bio-Plex悬浮阵列系统。酒吧代表的意思是±S.E.M. 3个独立的实验。*表示没有显著性差异相对于细胞预处理。
3.7。南汽或L-NAC预处理对细胞基因表达的影响后PQ的挑战

基因表达的变化评估使用基因阵列设计研究基因与细胞压力和毒性。基因表达在细胞的大小使用NAC或0.25毫米前L-NAC PQ挑战4 h普遍降低相对于挑战细胞没有预处理(图6)。褶皱的变化(相对于控制细胞)的数组的每个基因PQ挑战没有预处理后,NAC预处理或L-NAC预处理表中列出1。


图6
南汽或L-NAC预处理效果的大小在PQ-challenged细胞基因表达。从细胞中提取RNA的挑战与0或0.25毫米PQ 4 h后预处理与5.0毫米NAC -或L-NAC-containing媒体和分析通过定量逆转录PCR基因阵列。每个基因的表达的大小表示规模从最小的(强烈的绿色)到最大(强烈的红色)表达式(独立实验)。

许多氧化或代谢应激相关基因的表达没有明显改变在任何研究的条件下,除了CYP1A1和PTGS1显著调节与L-NAC PQ-challenged细胞进行预处理。所有研究热休克基因的表达仍然或多或少不变PQ-treated细胞但HSPA2 HSPA4, HSPA1L都显著表达下调与南汽或L-NAC预处理。EGR1的表达增加2.0倍PQ挑战细胞在缺乏抗氧化剂预处理但其表达与L-NAC预处理保持在控制水平。

抗氧化剂预处理细胞随后挑战与PQ增长逮捕和衰老相关基因的影响。短暂,GDF15和DDIT3都显著调节与L-NAC PQ挑战和被调制后1.9倍(1.4和1.5倍,分别地。),但不是NAC(2.0和2.2倍,分别地。),预处理。CDKN1A调节后1.5倍PQ的挑战,逐步调节进一步NAC(1.7倍)和L-NAC预处理(1.9倍)。也显著改变一些炎症基因的表达模式。IL18 PQ-challenged细胞调节1.5倍,但其表达调制与南汽或L-NAC预处理。使用单个引物与常规rt - pcr分析,我们发现IL8显著调节(2.2倍)PQ-challenged细胞没有预处理,但逐步调制与南汽(2.0倍)和L-NAC预处理(1.7倍)。值得注意的是,IL10基因,编码抗炎细胞因子il - 10,是抑制在PQ-challenged细胞,影响L-NAC逆转,但不是南汽,预处理。最后,许多细胞凋亡信号基因的表达并没有改变在研究条件下除了CASP10,调节1.7倍于PQ-challenged细胞没有预处理,被南汽和L-NAC预处理调制。L-NAC被证实的影响不是直接导致脂质组成的脂质体作为预处理和空白脂质体相比并没有改变表达式PQ-challenged细胞没有预处理(表2)。

常规rt - pcr检测进行了验证研究从基因获得数组。对于大多数被观察到了类似基因表达模式的基因(如猫,CYP1A1、IL1A NFKBIA,和SOD1)分析了这两种方法。

3.8。用常规rt - pcr验证基因阵列数据

图7描绘了一个代表electropherogram提取RNA,通过使用Experion自动电泳站,表明高RNA的完整性与很少或没有明显退化18 - 28 S rRNA。此外,一个峰值(或零如果没有放大产品)出现在一阶导数解离曲线每PCR反应在所有基因阵列和常规rt - PCR分析,表明只有一个PCR产品(即。感兴趣的基因)是放大在每种情况下。

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图7
验证的RNA PCR基因的完整性(a)和评估产品质量(b)。整除提取RNA的控制或PQ-challenged A549细胞有或没有预处理对RNA浓度和完整性评估使用Experion自动电泳。代表electropherogram显示18 - 28 S rRNA的山峰。代表一阶导数解离曲线放大的PCR产物4 h控制和PQ-challenged细胞使用控制媒体或NAC -或L-NAC-containing媒体进行描述。
3.9。空的脂质体对细胞毒性的影响和基因阵列分析

挑战与空白脂质体的A549细胞毒性细胞。同时,预处理空白脂质体的细胞没有授予任何保护PQ-induced细胞毒性(图2(表)和基因阵列分析2)。

4所示。讨论

本研究的结果显示,暴露的A549细胞PQ在体外导致浓度和时间积累相关的PQ伴随增加细胞内ROS水平和减少谷胱甘肽水平,证实了其他研究的结果:PQ对其毒性作用,在重要程度上,通过氧化应激机制(1- - - - - -3,26]。因此,研究管理的PQ中毒也指向抗氧化剂的使用。一个潜在的抗氧化剂候选人不仅是南京,因为它可以在诊所还硫醇基提供免费自由基清除属性和它作为半胱氨酸的来源,通常限制的前兆新创谷胱甘肽合成(3,17,18]。

为了评估cytoprotective传统和脂质体NAC配方的影响,我们首先研究在A549细胞最佳处理条件。南汽在变量被报道具有细胞毒性浓度根据细胞类型:10毫米人类支气管上皮细胞(NAC是无毒的17),3 t3成纤维细胞(40毫米是无毒的27),50毫米是无毒的主动脉内皮细胞(17];然而,30毫米在血管平滑肌细胞毒性细胞,单核细胞,中性粒细胞,低至5.0毫米南汽在猪主动脉内皮细胞(细胞毒性17]。南汽在A549细胞参与的研究一般都采用浓度从1到10毫米(26,28- - - - - -31日]。我们的研究结果表明,浓度的10.0毫米或更少没有对细胞生存能力产生负面影响,而更大的浓度(即。,50.0毫米)导致24小时(图后显著降低细胞生存能力1)。

两NAC配方授予保护PQ-induced细胞毒性但一般L-NAC比常规NAC制定更有效的限制细胞谷胱甘肽的PQ-induced减少内容(图3(一个)ROS的)和生产(图3 (c))。南汽的保护作用或L-NAC不能归咎于PQ的抗氧化配方吸收的影响因为南汽或L-NAC预处理对A549细胞的胞内PQ水平没有影响(图3 (b))。目前尚不清楚这种保护作用是南汽的直接清除属性或结果新创使用NAC作为前体合成谷胱甘肽。可能的原因在细胞保护作用更突出使用L-NAC是更大的和更可持续的胞内NAC水平可以通过实现脂质体交付(图1 (b))。细胞摄取实验表明,NAC作为脂质体制剂的吸收(即大得多。4倍),在所有条件下研究当交付L-NAC而NAC(图1 (b))。因此,更高和更持续的细胞内NAC水平负责维护一个正常的细胞氧化还原状态就是明证ROS和更高的谷胱甘肽的生产水平。应该注意的是,预处理细胞空DPPC脂质组成的脂质体并没有改变PQ-induced细胞毒性和基因表达的变化。

线粒体被认为是毒性PQ的重要目标和重要。事实上,有证据表明,PQ破坏线粒体电子传递链导致减少代谢功能,并建议由于PQ首先发生在线粒体病变(32- - - - - -34]。预处理与南汽或L-NAC表现出有益的影响PQ-challenged细胞的线粒体膜电位(图4)。南汽或L-NAC预处理提高了膜电位高于控制水平在0.25毫米PQ-challenged细胞4 h,虽然L-NAC,但不是南汽,预处理有限膜电位的降低细胞暴露于1.0毫米PQ。有趣的是,控制细胞使用L-NAC展出近2倍增加荧光强度相对于控制细胞没有预处理。Suntres et al。8]表明,放射性同位素对脂质体抗氧化剂囊泡与线粒体有关,和抗氧化剂,是积累到线粒体可以选择性地抑制线粒体氧化损伤,导致一系列的退化性疾病与氧化应激有关。

维护细胞氧化还原状态是至关重要的细胞内稳态,及其对氧化细胞内环境失调与异常转录激活和基因表达影响几个过程,如细胞生长、分化、和炎症(22,35- - - - - -37]。在这项研究中,PQ-induced细胞中基因表达变化的大小进行预处理与南汽或L-NAC前0.25毫米PQ挑战4 h与L-NAC通常是低比NAC(图更有效的治疗6)。尽管确切的机制(s),南汽影响途径参与信号转导和基因表达不能从这项研究的结果描述,这些途径都可能受氧化剂和redox-sensitive步骤自增加水平的细胞内南汽影响稳态水平的氧化剂(图3 (c)),可以修改的氧化还原状态的细胞(图3已知),影响发挥监管影响转录激活和基因表达22,35,38- - - - - -40]。例如,表达GDF15、IL8 EGR1,和CASP10基因被认为是调节氧化应激条件下,治疗效应抵消了抗氧化剂的存在(36,41- - - - - -47]。GDF15 upregulation,一种蛋白质,这种蛋白质发挥作用在调节炎症和凋亡通路在受伤组织和疾病过程中48- - - - - -50),和EGR1编码激活基因转录监管机构(包括p53)所需的分化和有丝分裂发生51),是维持细胞使用L-NAC接近正常水平,但不是NAC(表1)。CASP10的表达,它编码发起者caspase-10参与death-inducing信号复杂时细胞凋亡(Bidere et al。52]),在PQ-challenged细胞调节1.7倍,但接近控制水平PQ-challenged细胞使用NAC或L-NAC(表1)。很明显,保护细胞内稳态L-NAC,和南汽在较小程度上,促进了细胞的生存。

百草枯管理已被证明是与中性粒细胞的浸润肺(5,53]。Interleukin-8(引发)发布的一项有效的促炎细胞因子在受伤,有一个关键的角色在招聘和激活中性粒细胞炎症(54,55]。IL8基因的表达在PQ-challenged调节细胞,但其表达显著调制与L-NAC预处理与NAC(表程度较轻2)。南汽的抑制作用和对言论引发L-NAC与可比的变化引发细胞培养上清液的蛋白质分泌PQ-challenged细胞(图5)。南汽的调节的upregulation引发其他研究中被描述:增加引发基因(56)和蛋白质(57,58)的表达PQ-challenged外周血单核细胞被NAC (57),南京政府发现抑制中性粒细胞的趋化因子的释放,从而减少渗透到肺部PQ-challenged老鼠的9]。

氧化应激,这发生在细胞内的氧化还原体内平衡改变,是一个关键的多向性的调制器可以参与upregulation多个基因的差别和/或对这些35,37]。IL10,编码抗炎细胞因子白细胞介素- 10”(il - 10),是抑制PQ-treatment后(表2.2倍2),这表明细胞可能是积极抑制抗炎介质的促炎介质(例如,引发)。NAC il - 10的差别,以防止对这些基因的能力,在更大的细胞比南汽用L-NAC预处理,是细胞内水平较高的证据证实,NAC维持细胞的氧化还原状态接近正常。

总之,本研究的结果表明,预处理与南汽的A549细胞,在其传统和脂质体形式,授予cytoprotection PQ-induced毒性。这主要是归因于它能够改善细胞氧化还原状态(即。、细胞内谷胱甘肽含量和活性氧水平)和独立PQ吸收。这些保护作用更明显的细胞用L-NAC预处理,认为,至少在某种程度上,增加了NAC水平达到通过脂质体交付。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

承认

这项工作是支持的资助加拿大自然科学和工程研究理事会(NSERC没有。312533 - 2008)。

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