文摘

Methanoarchaea甲醇有杰出的能力很多金属(根)因此产生毒性和高机动性的衍生品。在这里,我们报告的生产甲基化铋methanoarchaeum物种Methanobrevibacter smithii,一个共同的人类肠道的成员,损害的发展有益的肠道微生物群的成员在浓度较低的情况下。细菌叫多形拟杆菌的福利,这是非常重要的主机由于其通用的消化能力及其对肠道的保护作用,对甲基化高度敏感,但不反对无机,铋的物种。甲基化水平的铋物种methanoarchaeum产生的m . smithiicoculture实验导致的最大细胞密度的降低亚种。这个观察表明,甲基化的生产有机金属物种在人类肠道(根),由methanoarchaea的活动引起的,可能影响宿主的健康。物种减少的影响生理肠道微生物群带来额外关注的潜在有害作用methanoarchaea肠的高等生物。

1。介绍

Biomethylation金属和金属(根)是一个重要的过程,提高了流动性,这些元素的生物利用度,和毒性。厌氧微生物,特别是methanoarchaea,显示最大的多功能性甲醇有关元素的光谱(1]。考虑人类健康、无害的金属的生物转化,如铋、由人类肠道菌群是一个高度相关的过程。由于金属铋的低毒性和无机盐,铋被归为“绿色元素”(2]。铋因此广泛用于各种应用,如化妆品、催化剂、工业颜料,陶瓷添加剂(3]。然而,铋与一些不良反应如脑病,肾功能衰竭,甚至死亡的情况下在80年代和70年代(4,5]。有人建议,这种金属的衍生品可能这些损害负责。

我们最近的研究表明,摄入后无机铋、肠道微生物群,特别是methanoarchaea,能够使甲基化无机铋等可溶性paritally甲基化化合物单甲——(MMBi)和dimethylbismuth (DMBi)以及挥发性trimethylbismuth (TMBi) [6- - - - - -10]。TMBi相比具有更高的波动性和疏水性无机铋,因此可以轻松地分布在人体和能够通过血脑屏障11]。老鼠的食物含有胶体铋subcitrate (CBS)浓度升高的TMBi Bi在多个器官的血液和浓缩检测(12,13]。虽然有毒化合物甲基化的直接影响人体的生理已经解决(14),这些化合物的间接负面影响人类健康的抑制增长的有益的肠道微生物群的成员几乎没有调查到目前为止。

为了克服这种忽视,甲基化铋物种的影响研究这细菌的重要成员,特别是叫多形拟杆菌(15]。这革兰氏阴性厌氧细菌对寄主有一些优势。例如,它有一些通用的消化能力有利于高等生物(16]。此外,这种微生物是重要的防御病原微生物的不良活动,保证肠上皮的完整性,因此排名中肠道菌群(所谓的生理17,18]。在先前的研究中,发现这种生物是敏感permethylated铋、(CH₃)₃Bi (1]。在这项研究中,部分和完全甲基化铋衍生品的毒性作用亚种详细研究了使用一个吗在活的有机体内例如coculture methanoarchaeum系统m . smithiiTMBi生产商。

2。结果与讨论

2.1。影响胶体Bi Subcitrate (CBS)文化的发展亚种

在所有实验中关于铋物种的毒性作用,我们评估最大的降低细胞密度在固定相上的应用各种药物在对数生长期。这是作为一个衡量的抗菌活性化合物。如图1(一),250年的μ米2000μM CBS日益增长的文化亚种导致了固定相的最大细胞密度减少。随着浓度增加,抑制强劲增长是观察到的最小抑制浓度(MIC₅₀)约500μ哥伦比亚广播公司(CBS)。

的哥伦比亚广播公司(CBS)导致硫化铋(图的黑色沉淀1(b))。这是由于与硫化氢反应产生了厌氧代谢的亚种。最密集的降水量是500年观察到μ类似于麦克风₅₀。此外,哥伦比亚广播公司(CBS)的增加抑制的增长B。叫多导致减少的硫化物沉淀。

2.2。铋的甲基化衍生物的影响

类似的增长抑制效果观察的添加甲基化铋化合物monomethylbismuth dimethylbismuth, trimethylbismuth,然而,在显著低浓度(数字2(一个)和2 (b))。观察生长抑制的浓度在纳米范围内(麦克风₅₀30 nM TMBi),因此四个数量级的降低而subcitrate铋(500μ米)。TMBi,除了30 nM的顶部空间导致了抑制约50%,因此在一个浓度略高于先前的研究亚种(麦克风₅₀,17海里TMBi) [1]。这可能是由于添加TMBi培养液。有趣的是,GC-ICP-MS顶部空间的测量亚种曝光时间后表明TMBi迅速降解的亚种文化。因此,这个问题出现的毒性是否TMBi归因于TMBi本身或其部分甲基化降解产物。因此,部分甲基化Bi-derivatives的毒性亚种被评估。

2.3。分化的抑制影响部分甲基化Bi-Derivatives之间

在实验部分甲基化,可溶性铋衍生品monomethylbismuth (MMBi)和dimethylbismuth (DMBi),抑制对增长的影响亚种观察在类似水平的TMBi(图2 (c))。后添加这些衍生品在指数期,细胞生长减少,没有达到最大的细胞密度在固定相相比,未经处理的控制文化。48海里的浓度,观察到显著增长抑制对MMBi(下降18%)和DMBi(减少29%)。虽然部分甲基化Bi-derivatives的毒性大于无机铋,它是在一个类似的范围,但是在一个较低的范围比TMBi。

2.4。Coculture的亚种与m . smithii

确认的相关性在体外结果情况在活的有机体内,一个体内,像coculture系统构建(图3)。设计了两个不同的流体文化在一个共同的顶部空间为了研究TMBi产生的毒性作用m . smithii在亚种。哥伦比亚广播公司的文化m . smithii在指数期(80μ米),增长的行为亚种之后在48 h。如图4的增长亚种减少到大约一半的未经处理的密度控制。

为了验证生产TMBi增长减少的原因,我们测量的浓度进化Bi-derivative TMBi顶部空间在48 h。在顶部空间的孤立m . smithii发现文化TMBi [1),没有检测到挥发性TMBi coculture系统由于快速TMBi的退化亚种培养基如上所述。因此,另一种方法是基于被动TMBi chemotrapping使用银nitrate-coated硅珠最近推出了类似于方法的抽样波动砷和硒物种Uroic et al。19]。的亚种文化位于内胎取代chemotrap和铋的内容chemotrap 48 h后孵化icp分析;AgNO nmol Bi被困₃涂硅珠33海里TMBi在气相对应,这很类似于麦克风₅₀TMBi。

3所示。结论

目前的工作证实了产甲烷菌的代表成员能力改变肠道菌群与有害金属(根)变成有毒的甲基化衍生物。挥发性有机金属(根)物种不仅直接与主机交互形成的器官组织(例如,通过增加bioabsorption铋的12)或intoxification哺乳动物细胞(20.)),但也间接。间接交互抑制有益微生物群的能力帮助最佳消化复杂的食物,保护肠道上皮细胞。我们在我们的研究中显示了挥发性TMBi以及非易失性部分甲基化衍生物与生理肠道微生物群的成员。TMBi的浓度的测量老鼠的肠子CBS-containing chow(大约8 - 10 nM,未发表的数据)表明TMBi的生产数量是足够的负作用,最终在一个强大的抑制微生物群。

不幸的是,不知道这些现象的分子机制。此外,高疏水性的甲基化物种将会增加这些化合物的流动和允许他们与细胞膜相互作用,进入,损坏细胞。与内部的交互组件的细胞不能排除。Bi^{3 +}离子可能与必要的蛋白质亚种和甲基化铋衍生品可能导致甲基化与大分子反应,如图所示为砷(14]。考虑甲基化铋物种的数量级比无机铋和有毒,毒性降低减少甲基化程度与TMBi的不稳定,似乎合理的假设的毒性TMBi以及部分甲基化的物种由于甲基转移在这些高度不稳定的物种的退化。

考虑高潜在负面影响产甲烷菌在高等生物,其有害性质似乎是毋庸置疑的。但真正的致病古生菌的产甲烷菌真正的例子吗?“致病”意味着问题故意损害宿主的生物繁殖和传播的优势。但这是否适用于产甲烷菌?在最近的一项研究中,我们已经证明,金属(根)的甲基化甲烷八叠球菌属mazei不是一个深思熟虑的解毒机制类比为砷ArsM系统。相反,它是由于产甲烷代数余子式的副反应(Thomas et al .,提交(21])。因此影响产甲烷菌宿主仅仅因为一个巧合的甲烷生成中间体和金属的形成(根)衍生品。因此,一个特殊的优势从这些有害金属的生产(根)衍生品似乎并不明显。

4所示。材料和方法

4.1。标准的培养

增长的实验亚种(2079号DSMZ)和m . smithii(861号DSMZ)进行严格的厌氧条件下(气相:H₂/公司₂(80:20))37°C血清瓶120毫升的总量(50毫升液体,70毫升顶部空间)。以下用于复杂的生长介质亚种和m . smithii:0.5 g KH₂阿宝₄,0.4 g MgSO₄×7 H₂啊,0.4克氯化钠,0.4 g NH₄Cl, 0.05 g CaCl₂×2 H₂啊,1 g C₂H₃KO₂8 g NaCOOH, 4 g NaHCO₃6 g bacto脑心浸液,2 g酵母提取物,6 g蛋白胨,10毫升SL-10 (DSMZ)每升。

4.2。Coculture系统

coculture系统有两个单独的液体和一个顶部空间构造阶段通过使用100毫升玻璃瓶厚厚的丁隔(Schott AG)、美因茨、德国)和30毫升greiner管(毫升液体,50毫升顶部空间)。

4.3。量化的细胞

培养的细胞数与汤森计数室温和的稀释。

4.4。添加铋

文化的亚种整除和不同物种添加铋在后期指数增长阶段(细胞·毫升⁻¹)。无机和可溶性铋物种被添加到液相亚种。挥发性TMBi顶部空间应用。

4.5。分析挥发性金属(根)衍生品

分析了波动TMBi改性气相色谱仪系统吹扫捕集- (226000)耦合到一个ELAN (PerkinElmer)电感耦合等离子体质谱仪(P&T-GC-ICP-MS)所描述的地方。识别基于GC-ICP-MS挥发性金属(根)化合物的沸点保留相关验证了通过使用并行分子和元素质谱(GC-EI-MS / icp)如前所述23]。

4.6。Chemotrapping挥发性TMBi

波动TMBi被困用硅珠涂上硝酸银修改从Uroic et al。19]。这些珠子是放在晚上在1%硝酸银溶液,然后干40°C。1 g的涂布silica-beads放在coculture系统内管代替亚种。孵化后48 h, TMBi的生产m . smithii确定的提取和5% HNO珠子吗₃无菌过滤后,icp分析。

4.7。甲基化铋化合物的合成

甲基化铋化合物合成在一个两步的过程。在第一步,trimethylbismuth准备方法改编自马夸特(24]。总之,格氏准备的解决方案是添加甲基碘在乙醚镁豁口。Trimethylbismuth被分离蒸馏分离。在第二个步骤中,解决了trimethylbismuth在乙醚和溴化铋添加的摩尔比率2:1 BiBr₃和(CH₃)₃Bi屈服(CH₃)BiBr₂或1:2比屈服(CH₃)₂分别BiBr。铋半胱氨酸甲基半胱氨酸铋和准备通过添加铋(III)溴化(BiBr₃)或溴化甲基化铋((CH₃)BiBr₂),分别提取l -半胱氨酸的饱和溶液在超纯实验室水。提取l -半胱氨酸的摩尔比铋铋化合物是1:2。混合物在室温下搅拌(20°C)在惰性氩气气氛。这些化合物的隔离我们添加了少量的甲醇直到一个黄色的固体沉淀。水晶产品随后通过一个玻璃纤维过滤器过滤,真空干燥器干燥。验证的标准是由衍生化乙基化,并用gc - ms分析和报道之前(25]。

4.8。统计评估

细胞数量的意义使用组样本进行了分析t以及。在0.05水平,不同的人口意味着与测试差异明显不同。

确认

本文得到了德意志Forschungsgemeinschaft作为脱硫项目的一部分群体PAK 342:“金属(根)生物转化在人类肠道铋的例证。“此外,作者要感谢斯蒂芬妮Vorwerk协助开发coculture系统。