文摘

我们合成和毒物学地特征代谢物thiodimethylarsinic砷酸(含硫的-)。成功的合成高纯硫代的-证实了最先进的分析技术包括核磁共振、HPLC-FTMS HPLC-ICPMS。毒理学特性进行了亚砷酸相比,其著名的三价和五价的甲基化代谢物。它由细胞生物利用度以及不同的细胞毒性和基因毒性终点在培养人类A549肺癌细胞。所有调查偏方,含硫的-产生最强烈的细胞毒性。此外,含硫的- - - - - -没有诱导DNA链断裂,增加诱导的微核和多核细胞发生只在开始细胞毒性浓度,表明含硫的-不采取行动通过基因毒性的行动方式。最后,评估潜在影响含硫的-对人类健康,迫切需要进一步的机械的研究确定这剧毒的毒作用方式,不同寻常的五价的有机砷化合物。

1。介绍

无机砷是证据确凿的人类致癌物(IARC、组1)引起的肿瘤肺、皮肤、膀胱和(1,2]。然而,无机arsenic-induced致癌性的基本分子机制还有待阐明,特别是无机砷,与其他经典化学致癌物,并直接诱导DNA损伤和诱变在exposure-relevant浓度(3]。除了其新陈代谢的贡献,各种讨论进一步的潜在机制,包括基因通过氧化损伤的感应机制(4- - - - - -6],表观遗传失调[7),与细胞DNA损伤反应的交互和DNA修复8),导致comutagenic和cocarcinogenic效应(9]。

在一般人群中,人类饮食的主要来源是总砷和无机砷摄入量。欧洲食品安全局(EFSA)污染物在食物链和联合委员会粮农组织/世界卫生组织(FAO / WHO)食品添加剂专家委员会(联合)在最近的科学意见砷对人体健康风险有关食品中无机砷的存在不能被排除在外。2010年,食品添加剂联合专家委员会撤销了之前暂定每周摄入(PTWI) [9- - - - - -11]。此外,欧洲食品安全局小组强调毒理学特性的必要性的海鲜和鱼有机偏方,包括arsenosugars和arsenolipids,日期不存在毒性数据(9]。arsenobetaine相比,鱼类的主要砷化合物,但不是由人类代谢,arsenosugars和arsenolipids biotransformed广泛大量的砷代谢产物(12,13]。这些化合物被认为是剧毒,因此它不能被排除在外,海鲜和鱼有机砷物种对人类健康的风险。

关于在体外毒性著名的无机砷和部分毒理学地描述人类代谢物monomethylarsinous (MMA)^三世),dimethylarsinous (DMA^三世),monomethylarsonic (MMA)^V)和dimethylarsinic (DMA^V)酸、三价代谢物产生较强的细胞毒性,以及直接和间接基因毒性与亚砷酸(14- - - - - -21]在大多数细胞和亚细胞的测试系统。因此,三价甲基化通常相信偏方强烈导致无机arsenic-induced基因毒性,最有可能的是,致癌性。

Thiodimethylarsinic酸(thio-DMA^V[(CH₃)₂(年代)哦),也叫dimethylmonothio-arsinic酸,DMMTA^V或DMTA^V)是五价的硫模拟DMA^V和有机以及无机偏方的代谢物。第一个thio-DMA的识别^V作为哺乳动物尿液中代谢物得到砷和羊毛从羊自然消耗大量arsenosugars通过海藻22]。摘要群Feldmann thio-DMA还讨论了严重问题^V可能被误认为DMA吗^三世在人类的尿液样本,因此可能会逃脱检测在许多样品到目前为止(22,23]。事实上,thio-DMA^V后来被发现在人类尿液接触后对arsenosugars以及无机砷污染饮用水(12,13,23]。在最近的一项研究调查75年在尿液中代谢物的无机砷arsenic-exposed女性在孟加拉国,thio-DMA^V已被证明是一个共同的代谢物,被发现在44%的样本23]。此外,thio-DMA^V也可能直接发生在食品、大米(之前已经假设24]。

可能是因为thio-DMA^V不是商用,在文献中没有在活的有机体内为thio-DMA毒性研究^V(除了毒性动力学研究),只有少数在体外毒性研究存在。然而,这些很少有研究指出thio-DMA相当强劲的细胞毒性^V在哺乳动物细胞的文化。因此,在大多数研究中,thio-DMA^V显示更高的细胞毒性与MMA相比^V和/或直接存储器存取^V(23,25三价偏方[]和相当的影响26,27]。在一些研究中,thio-DMA^V甚至产生较强的细胞毒性与亚砷酸(27- - - - - -29日]。此外,Ochi等人提供证据,基因毒性thio-DMA的潜力^V在培养的仓鼠细胞(25),而没有详细的数据关于thio-DMA基因毒性的存在^V在人类细胞。

本研究的目的是进一步调查thio-DMA的毒性^V在培养人类A549肺癌细胞。因此,我们合成和分析特征高度纯dimethylthioarsinic酸酐,在水溶液立即thio-DMA形式^V。随后,细胞毒性,细胞吸收,以及首次在DNA和染色体基因毒性水平检查在培养的人类细胞,而比较thio-DMA的影响^V亚砷酸的影响,MMA^三世,直接存储器存取^三世,MMA^V,直接存储器存取^V。

2。材料和方法

2.1。谨慎

无机砷是归类为人类致癌物。以下化学品危险,应该小心处理:亚砷酸钠,methyloxoarsine (MMA的前兆^三世),iododimethylarsine (DMA的前兆^三世),dimethylthioarsenic酐(thio-DMA的前兆^V),MMA^V,直接存储器存取^V。

2.2。材料

杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM),胎牛血清(FCS),胰蛋白酶,penicillin-streptomycin解决方案获得Sigma-Aldrich (Steinheim,德国)。文化的菜肴由Biochrom(德国柏林)。亚砷酸钠(元)(纯度≥99%)和阿尔新蓝从丙烯酰胺购买Biochemika(书、德国)。Methyloxoarsine (CH₃作为^三世O,纯度≥99%)和iododimethylarsine [(CH₃)₂作为^三世我,纯度≥99%)(存储在−80°C)请提供教授w·卡伦(加拿大温哥华英属哥伦比亚大学)。直接存储器存取^V(纯度≥99%)和MMA^V(纯度99%)买来Sigma-Aldrich (Steinheim,德国)。ccl A549细胞(- 185)从美国获得类型文化集合(贝塞斯达,医学博士,美国)。

和吖啶橙染色染料从罗斯(德国卡尔斯鲁厄)。ICPMS基本标准(,1 mg / L)从SPETEC购买(德国埃尔丁)。Suprapur双氧水(30%)和硝酸(65%,Suprapur)产品的默克公司(达姆施塔特,德国)。特里同x - 100买了皮尔斯(Oud-Beijerland、荷兰),羟磷灰石(高分辨率)Calbiochem(坏Soden、德国)和赫斯特33258年从默克公司(达姆施塔特,德国)。所有其他proanalysis化学物质都是来自Sigma-Aldrich默克(Steinheim、德国)或(达姆施塔特,德国)。

2.3。Dimethylthioarsinic酸酐的合成

thio-DMA Dimethylthioarsinic酸酐,在水中水解^V,根据Fricke合成等。30.]。简单地说,直接存储器存取^V溶解在乙醇(30%)和硫化氢溶液通入,搅拌过夜。去除溶剂后,残渣提取与氯仿/水(3:1)和氯仿层是用水洗,以消除剩余的水溶性砷化合物。最后,溶剂移除,dimethylthioarsinic酐甲醇/己烷重结晶。

2.4。分析和纯度控制Dimethylthioarsinic酸酐

HPLC-FTMS(热Accela热LTQ Orbitrap XL), HPLC-ICPMS(日本岛津公司LC-10,珀金埃尔默ELAN 6000),和电热原子吸收光谱法(珀金埃尔默,AAnalyst 600)申请以及获取信息的识别和量化的纯度砷物种。Thio-DMA^V解决方案在水里准备直接对每个实验;为了弥补敏感性差异,样本用于HPLC-FTMS (20 mg / L)稀释400倍HPLC-ICPMS分析。短暂,色谱分离、聚四氟乙烯autosampler瓶,一个反相柱(水域亚特兰蒂斯T3,5毫米,μ米),在水/ 10%甲醇洗脱液13.2毫米醋酸铵(pH值4.6)(30.]。流量为0.3毫升/分钟。m / z范围HPLC-FTMS分析组从m / z 80 - 1000。分裂实验进行碰撞诱导解离(CID)使用规范化的碰撞能量,使用Xcalibur执行和数据分析软件。量化的砷物种HPLC-ICPMS,色谱数据收集的m / z 75(和监控⁴⁰基于“增大化现实”技术³⁵Cl)和77年(⁴⁰基于“增大化现实”技术³⁷Cl) 100 ms的思考时间。色谱分析的结果从OriginLab与数据分析软件。总在thio-DMA的量化^V解决方案是由电热原子吸收光谱法,应用一个ICPMS基本标准。

此外,¹核磁共振光谱(力量克莱斯勒- 400,400 MHz)被用来获取额外纯度的信息。砷物种溶解在氧化氘(D₂O),化学位移值观察结构信息。结果进行评估与核磁共振数据软件MestReNova (Mestrelab研究)和从文献与数据。

2.5。细胞培养和孵化偏方

由于肺的重要靶器官无机arsenic-induced致癌性,人类上皮肺腺癌A549细胞被用作在体外模型系统。培养基中生长的A549细胞在DMEM单层包含10% FCS, 100 U青霉素/毫升,100μg链霉素/毫升。文化在37°C和5%孵化有限公司₂在空气和湿度100%。

砷的股票的解决方案是在无菌准备去离子水。股票的解决方案都是准备在每个实验之前不久,其中以防止氧化三价偏方。对数增长A549细胞被孵化的偏方1 h或24 h描述各自的实验。

2.6。细胞毒性测试Thio-DMA^V

的细胞毒性thio-DMA^V阐明了量化它对细胞数量和集落形成能力的影响。细胞数量和集落形成能力测试之前完全执行所述无机砷、MMA^三世,直接存储器存取^三世,MMA^V,直接存储器存取^V(31日]。短暂,经过24小时的孵化与各自的偏方,细胞用磷酸缓冲盐(PBS)和使胰蛋白酶化。随后,细胞数量和细胞体积测量的自动细胞计数(Casy-1,罗氏Innovatis AG)、比勒费尔德,德国)。这些测量是基于非侵入性(dye-free)电流排斥通过脉冲信号评价区域分析。评估thio-DMA的影响^V后A549细胞集落形成能力,每个样本的细胞计数,300细胞/盘被播种。经过7天的孵化,殖民地与乙醇固定,沾染了染色(25%乙醇),统计和计算百分比控制。

2.7。细胞生物利用度

比较细胞thio-DMA的生物利用度^V细胞生物利用度的无机砷及其相关甲基化代谢物,细胞生物利用度研究是由相同的协议之前报道(31日]。简单地说,对数生长细胞()暴露于thio-DMA^V24 h,使胰蛋白酶化,通过离心收集,用冰冷的PBS洗净,细胞数量以及细胞体积测量的自动细胞计数每个样本描述。孵化后的灰化(65% HNO混合物₃/ 30% H₂O₂(1/1,v / v))在95°C至少12小时,用再蒸馏的水样本稀释,砷是衡量电热原子吸收光谱法(AAnalyst 600年,珀金埃尔默)。

2.8。测定DNA链断裂

DNA链断裂是由碱性解除量化如前所述[32]。简单地说,细胞被播种,允许附加与thio-DMA 24 h和孵化^V1 - 24 h。随后,细胞中被洗了PBS和一个包含0.03氢氧化钠碱性溶液,0.02 Na₂HPO₄和0.9 M氯化钠添加。中和后,声波降解法、分离单-和双链DNA进行0.5毫升羟磷灰石列60°C。单-和双链DNA被筛选了1.5毫升的0.15米和0.35米磷酸钾缓冲,分别。DNA含量的分数是由赫斯特33258年染料添加到最终的浓度M 1毫升的每个样品和测量微量滴定荧光的荧光读者(FLUOstar最适条件,BMG Labtechnologies,耶拿,德国)的激发波长360 nm和发射波长455 nm)。DNA链断裂被标定量化与x射线如前所述33]。

2.9。微核的形成和多核细胞

1990年代早期,微核分析被证明是适合调查arsenic-induced染色体改变基因毒性的生物标记(34]。近年来,在体外微核检测已成为一个有吸引力的工具一般用于基因毒性测试(35]。因此,这个端点一直在强劲(现在也是)用来描述基因毒性的潜力在流行病学研究[偏方36,37)以及培养的哺乳动物细胞(例如,38])。探讨诱导微核和多核细胞,在这项研究中A549细胞被播种在阿尔新蓝6-well板镀膜玻璃盖玻片。24小时后,细胞被孵化的各自的偏方24 h,固定在一个冰冷的固定的解决方案(90%,10%甲醇/ PBS−20°C) 10分钟,干空气中在室温下,用吖啶橙染色在PBS (125 mg / L) 10年代,最后分析了荧光显微镜。每盖玻片,至少1000个细胞是单核的清点,分类,双核和多核细胞以及细胞和微核。

3所示。结果

3.1。Dimethylthioarsinic酸酐的合成、分析和纯度控制

无色、高纯净dimethylthioarsinic酐晶体通过DMA的反应^V与H₂在乙醇,其次是提取与氯仿和甲醇/己烷重结晶(图1)。在水中溶解后dimethylthioarsinic酸酐,thio-DMA的形成^V分析了通过用连字符连接技术和¹核磁共振。

质量和光谱数据¹核磁共振的结果证实了转换酸酐合成的水进入酸thio-DMA形式^V。thio-DMA结构说明^V是由HPLC-FTMS分析和精确质量的决心。酸的质量计算表格154.9512 m / z [m + H]⁺和检测质量是154.9509 m / z。分裂的实验与父离子的碰撞诱导解离154.95 m / z (C₂H₈美洲国家组织)⁺给136.9403 m / z的碎片离子(C₂H₆的屁股)⁺并进一步分裂导致108.9089 m / z (H₂的屁股)⁺。相应的HPLC-FTMS总离子色谱图(图2(一个))演示了thio-DMA^V作为一个质子化了的分子离子的保留时间7.3分钟,而起始物料和产品检测进一步反应。

HPLC-ICPMS分析进一步验证thio-DMA的纯洁性^V保留时间匹配的已知砷物种,包括直接存储器存取^V为起始原料。因此,溶解thio-DMA之后^V在水里,HPLC-ICPMS色谱显示只有一个化合物(图2 (b))。在额外的考虑thio-DMA量化的^V电热原子吸收光谱法,评估了dimethylthioarsinic酐的纯度≥98%。

¹核磁共振测量thio-DMA^V(图2 (c))在D₂O导致2.12 ppm的化学位移值是类似于2.11 ppm的价值由Fricke et al。30.]。直接存储器存取^V的范围显示化学位移为1.98,符合五价砷化合物。的¹核磁共振数据thio-DMA^V显示没有杂质,得到所需的复合分析纯形式的基础上¹核磁共振光谱。

3.2。细胞毒性的Thio-DMA^V

细胞毒性的thio-DMA^V由调查其影响细胞数量和集落形成能力(图324小时孵化后)。细胞体积(图4)确定,然而,主要计算细胞砷浓度。关于两个端点,细胞数量和集落形成能力,thio-DMA^V产生更高的细胞毒性与亚砷酸盐,特别是五价的甲基化代谢物MMA^V和直接存储器存取^V,而影响与MMA相比低是双重的^三世和直接存储器存取^三世(表1)。Thio-DMA^V影响集落形成能力更强的细胞数量,相比与三价的甲基化代谢物。亚砷酸盐,MMA^V和直接存储器存取^V,包括细胞毒性端点显示出类似的敏感性。

3.3。细胞的生物利用度Thio-DMA^V

评估细胞A549细胞生物利用度和关联thio-DMA的细胞毒性^V砷的含量与细胞,细胞砷浓度测定24 h后孵化了电热原子吸收光谱法。

比较细胞外和细胞内砷浓度,观察9-10-fold积累在细胞孵化15μM thio-DMA^V(图4)。Thio-DMA^V对细胞数量(图显示无显著影响4在noncytotoxic浓度),但增加细胞数量的细胞毒性浓度(≥10μ米)44%。意思是(±SD)卷nonincubated控制细胞L。

有趣的是,细胞的浓度砷与thio-DMA的细胞毒性密切相关^V,导致相关系数(手机号)或−0.986−0.998(集落形成能力),分别。

3.4。由Thio-DMA诱导DNA链断裂^V

可能一代thio-DMA的DNA链断裂^V研究在A549细胞短期(1 h)和长期(24小时)孵化,应用碱性解除技术。高,细胞毒性thio-DMA^V浓度在1 h和24小时孵化后,没有明显的诱导DNA链断裂观察(数字5(一个)和5 (b))。

3.5。微核的形成和多核细胞的偏方

两个基本机制导致微核的出现是染色体分离机械和染色体断裂的干扰。因此,在体细胞,微核只能发生在有丝分裂后,和cytokinesis-block微核测定(CBMN),由细胞松弛素B,基于胞质分裂抑制细胞增殖,从而有丝分裂通常由mono的进球——和双核细胞(35]。然而,我们的第一个CBMN研究表明一些偏方与肌动蛋白和/或细胞松弛素B的影响(数据没有显示)。评估诱导微核的偏方,我们省略了细胞松弛素b的应用,以确保有丝分裂,我们控制细胞增殖的细胞数量的量化和选择一个孵化时间24小时,相当于1.25 A549肺癌细胞的细胞周期。这个孵化时间以前用于检查偏方在A549细胞的细胞毒性31日),因此打开比较结果的可能性。此外,该协议允许适当的量化的形成多核细胞同时偏方。

在noncytotoxic开始微微细胞毒性浓度,MMA^三世(0.5,1μ米),thio-DMA^V(5μ米),MMA^V(250μ米)和直接存储器存取^V(250μ米)诱导一个小,但相当数量的大约20微核(图6(一))。已经细胞毒性砷物种浓度更高,微核形成增加也成为重要的亚砷酸盐(≥50岁μ米),高细胞毒性浓度,5μM直接存储器存取^三世和30μM thio-DMA^V显示强大的效果,诱导和分别微核。

此外,thio-DMA^V特别是直接存储器存取^三世增加多核细胞的形成和发生的双核细胞相比,未经处理的控制细胞(图6 (b))。然而,被局限于细胞毒性浓度影响显著。对于所有其他应用偏方,没有明显增加的bi -观察和多核细胞。

4所示。讨论

在这项研究中提出的数据进一步证明最近的强烈的细胞毒性代谢物thio-DMA砷^V在人类细胞。

应用人类肺细胞,细胞毒性thio-DMA^V强烈与细胞生物利用度。砷物种,为其他类似的相关报道在A549细胞(31日)以及在人类移行细胞(UROtsa)和肝细胞(HepG2) (39之前)。

当比较各自的砷浓度孵化,thio-DMA^V产生细胞毒性高于亚砷酸盐,而影响MMA相比要低^三世和直接存储器存取^三世。当另外考虑细胞生物利用度的偏方,在所有偏方,thio-DMA应用^V显示了最高A549细胞的细胞毒性。例如,细胞数目减少30%发生在24小时后孵化与5μM直接存储器存取^三世,这是相关的μM细胞砷(31日]。12.1μM thio-DMA^V引起了相似的细胞数量减少;然而,它对应于一个细胞砷的浓度μm .因此,一个类似的细胞毒性效应是实现在两个细胞砷浓度较低。总之,指的是细胞外孵化的浓度,在人类肺癌细胞A549按照偏方细胞毒性顺序:DMA^三世> MMA^三世> thio-DMA^V亚砷酸≫≫MMA^V~直接存储器存取^V。考虑砷物种的细胞吸收砷的浓度,从而指的是有效的细胞细胞毒性顺序thio-DMA开关^V亚砷酸~ ~ MMA^三世>直接存储器存取^三世≫MMA^V~直接存储器存取^V。这是相反的研究Naranmandura et al。26在各自的IC50),浓度,细胞thio-DMA^V吸收是DMA相比更高^三世和亚砷酸盐的摄取。这不同的结果可能是由于不同的细胞系统应用,但最有可能的结果从不同的细胞毒性端点进行调查。通过MTT测试,Naranmandura等人使用细胞代谢相关细胞毒性端点,而量化的影响细胞活动的偏方脱氢酶。相比之下,在这项研究中我们量化细胞数,包括细胞死亡和增殖抑制的偏方。此外,集落形成能力,一般认为是基准长term-cytotoxicity试验直接没有急性毒性化合物,应用作为第二个细胞毒性端点。非常有趣的是,thio-DMA^V关于端点集落形成能力产生较强的细胞毒性,它指向一个间接的有毒的行动方式。这也同样被证明之前的三价甲基代谢物(31日]。

与所有其他甲基砷代谢产物(18),在thio-DMA A549细胞^V没有代DNA链分解高细胞毒性浓度。这也是thio-DMA符合事实^V没有显著增加活性氧水平A549细胞(如评估DCFDA荧光)到高细胞毒性浓度(数据没有显示)。这与假设,活性氧species-mediated有毒thio-DMA的行动方式^V(28,40]。因此thio-DMA^V,以及DMA^三世和亚砷酸盐,施加强大的染色体上的基因毒性水平只在细胞毒性浓度。因此,在目前的研究中,MMA^三世是唯一arsenical-inducing noncytotoxic微核,exposure-relevant浓度从0.5μm . A549细胞微核形成的结果,至少在一定程度上从早0.5观察诱导的DNA损伤μM MMA^三世(18]。

在直接存储器存取^三世之前,微核感应已被证明在CHO细胞(38并讨论了由于aneugenic和DMA的致染色体断裂的影响^三世。在她(叙利亚仓鼠胚胎)细胞24小时孵化后,20μM thio-DMA^V诱导染色体结构畸变包括染色单体差距,染色单体断裂和染色单体的变化(25]。这符合好早些时候数据由黑田等人在国科中国仓鼠肺细胞:在这里,DMA的未知微生物代谢物^V,这是如今thio-DMA强烈讨论^V、诱发染色体畸变以及姊妹染色单体交换,有丝分裂被捕,和四倍体41]。在这项研究中,thio-DMA^V特别是直接存储器存取^三世另外增加的形成多核和双核细胞,大多数可能是由纺锤体异常引起的这些砷物种(25,42]。此外,双核细胞形成的增加表明DMA的抑制作用^三世和thio-DMA^V胞质分裂。因此,在相同的浓度范围,都引起了偏方G2 / M细胞周期阶段逮捕后24 h孵化A549细胞(数据未显示)。对于thio-DMA,这已经被证明在人类HepG2肝癌细胞(25)和A431细胞表皮样癌(26]。

当评级微核的形成、血细胞和双核细胞,它再一次必须明确表示,所有这些影响都局限于高浓度的亚砷酸盐,thio-DMA^V,直接存储器存取^三世。强烈的影响是专门为DMA^三世微核诱导增加了七倍,十倍增加发生的双核细胞,多核细胞和一个80倍增加24小时孵化后5μM直接存储器存取^三世。因此,在直接存储器存取^三世,这些效应最有可能引发DMA^三世细胞毒性,特别是有关端点集落形成能力。这对于thio-DMA不太可能^V更不可能对亚砷酸盐。

总之,thio-DMA^V似乎发挥其高细胞毒性作用方式不同于亚砷酸盐,MMA^三世,直接存储器存取^三世。我们的数据强烈表明,在人类A549肺癌细胞,thio-DMA^V不采取行动通过基因毒性的行动方式。然而,评估thio-DMA的角色^V在无机arsenic-induced致癌性,迄今为止仍然thio-DMA了解太少^V。这是特别有效的thio-DMA^V不仅是一种人类代谢物的无机砷还海鲜相关有机偏方,这表明迫切需要进一步的机械的研究来确定其毒性作用方式和最终评估对人类健康的潜在影响。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢教授w·r·卡伦(加拿大温哥华)请提供三价砷甲基化代谢物以及博士生米里亚姆·斯瓦泽尔(分析化学、卓WWU)有益的讨论,关于LC-ICPMS测量,和大师的学生,Imke Pieper弗雷德里克•施瓦茨和对普瑞斯(食品化学,卓WWU),在实验室的实际工作。作者特别感谢H.-U博士教授的团队。Humpf(食品化学,WWU门斯特干酪)有用的讨论关于HPLC-FTMS和1 h - nmr分析。他们承认支持德意志Forschungsgemeinschaft (DFG)和开放获取出版基金的大学中自得其乐。这项工作是支持的DFG格兰特数量等903/3-2和等903/4-1。Marc Bartel和Franziska艾伯特同样本研究的实际工作。