产生微囊藻毒素的蓝藻细菌的急性暴露微胞藻属绿脓杆菌改变成年斑马鱼(鲐鱼类)游泳成绩参数

摘要

微囊藻毒素(MCs)主要是由蓝藻(蓝藻)产生的毒素微胞藻属绿脓杆菌，在全球范围内形成水华。当生物体受到环境干扰时，正常行为模式会发生改变。行为模式代表了多种生理和生化改变的结果。在本研究中，我们评估了成年斑马鱼的行为模式和全身皮质醇水平 (鲐鱼类)暴露于产生微囊藻毒素的蓝藻的细胞培养铜绿假单胞菌(应变RST9501 MC-LR)。MC-LR暴露(100μ与对照组相比，g/L）减少了63%的行驶距离，增加了三倍的不动时间。有趣的是，在相同的MC-LR浓度和暴露时间下，动物暴露于50和100 μg/L时，MC-LR显著增加了在坦克底部的时间(约93%)，表明焦虑效应。结果还表明，测试的MC-LR浓度没有促进绝对转弯角度、路径效率、社会行为或全身皮质醇水平的显著变化。这些发现表明，行为易受MC-LR暴露的影响，并为更好地理解有毒藻华的生态后果提供了证据。

1.介绍

微胞藻属绿脓杆菌是一种淡水蓝藻细菌，已知是微囊藻毒素(MCs)家族的制造者[1.,2.]MCs是在蓝藻水华衰老期间或衰老时释放到水中的肝毒性环七肽[3.]．MCs的肽环包含五种非蛋白氨基酸，而两种蛋白质氨基酸将MCs区分开来。MC-LR含有亮氨酸和精氨酸等氨基酸。MC-LR是最常见的一种[2.,4.]及毒性最强的微囊藻毒素[5.]．完整的细胞以及细胞裂解后释放的毒素可能是在许多生物体中观察到的毒性作用的原因，从微藻[6.]哺乳动物[7.]包括人类[8.–10]．

接触有毒蓝藻细菌或给药MCs可引起肝毒性作用[11–13]氧化应激[14，肾脏损害[15,16，生长抑制[17,18]、生殖损伤[19]、血液及生化改变[20.–22,细胞凋亡23，甚至鱼类死亡[24]．

当动物受到环境干扰时，正常行为模式的改变可能是防御的第一道防线[25–28]．此外，研究表明激素和行为之间存在重要的相互关系[29–33]．因此，皮质醇水平的改变可能会改变鱼类的正常行为。MC对鱼类行为的影响尚不清楚，但一些问题已经得到解决。Baganz等人[34,35]报道了斑马鱼自发运动行为的变化(鲐鱼类),Leucaspius delineatusMC-LR曝光后，和Cazenave等[36]表现为游泳活动的变化Jenynsia multidentata用微囊藻毒素- rr (MC-RR)喂养。此外，使用不同暴露途径(腹腔注射、口服摄入或浸泡)的研究表明，MCs可以在鱼类组织中积累，主要是在肝脏中[21,36–39],肠[37,39–41],鳃[42,43)、肾(37,39]，肌肉[40,41,44–46]，胆囊[47,血40,41,48，大脑[43]．总之，这些发现表明MCs可能对鱼类产生神经毒性影响，给鱼类种群的成功和生物多样性的变化带来严重风险，以及其他生态后果[36]．

斑马鱼在许多生物学研究领域正迅速成为一种受欢迎的模式物种。其应用领域包括发育生物学[49]，毒理学[50、神经生理学、生物医学、药物发现[51，人类疾病[52–54]、药理学及行为分析[55–59]．这些鱼表现出强烈的行为反应，特征明确的基因组、神经和内分泌系统与人类相似[60–62，并拥有所有“经典”脊椎动物神经递质[63,64]．此外，斑马鱼是实验室研究的理想动物模型，因为它们价格便宜，需要低维护，并能产生大量的后代[65]最近，这种鱼也被用于MCs毒性的蛋白质组学研究[66,67]．

为了更好地理解mc对鱼的神经毒性作用，并提高对其毒性机制的认识，本研究的主要目的是评估MC-LR对暴露于毒素后的斑马鱼行为参数和内分泌(全身皮质醇)反应的影响。

2.材料和方法

2．1．动物

野生型成年（小于8个月大）斑马鱼(鲐鱼类)从专门的供应商（巴西RS Agroloja红鱼）处获得了雌雄动物的数量。动物饲养在50个实验室中 L装有自来水的水箱，之前用Tetra's AquaSafe（中和水中可能对鱼类有害的氯、氯胺和重金属）处理，并持续充气（7.20 氧化镁_2./ L)摄氏度，低于14–10摄氏度 h光/暗光周期，密度高达每公升五只动物。实验前，动物至少驯化两周。每天三次喂食四分之一的热带鳞片鱼。

该程序此前已由大南大教皇天主教大学(pics)动物伦理委员会根据10/00142-CEUA协议批准。

2．2.治疗

MC-LR在细胞培养中的含量m . aeroginosa(株RST9501)采用美国Envirologix公司提供的MC-LR定量抗体免疫分析法(Elisa)进行检测，检测范围为0.05 ~ 2.5μg/L MCs。将适当稀释液应用于培养样品，以提供范围内的检测。斑马鱼分为三组：第一组（对照组）暴露于含有m . aeroginosa24小时;第二组和第三组在最终MC-LR浓度为50的条件下进行细胞培养μg/L和100 μ暴露后立即对动物进行水池潜水行为测试和社会交往测试。行为测试后，对动物进行斩首安乐死。

MC-LR浓度和暴露时间是根据之前的研究选择的，使用j . multidentata[43]．此外，这种浓度通常在蓝藻水华事件中遇到[68,69]．

2.3.储罐潜水行为试验

行为测试发生在光阶段上午10点至下午4点的动物被分别转移到2.7升舱(24厘米L×8厘米W×20厘米H)与侧根和底部白色覆盖,以避免任何视觉障碍和习惯坦克30年代,如前所述[70]．行为实验中没有药物暴露。在适应期结束后，使用Logitech Quickcam PRO9000对动物的运动活动进行5分钟的录像，并使用ANY-Maze记录软件(Stoelting Co.， Wood Dale, IL, USA)进一步分析。水槽被用四条垂直线和一条水平线等分，测量了以下行为模式:行进距离(米)、静止时间(秒)、交叉次数、绝对转弯角度、路径效率和在底部花费的时间(秒)。这项任务利用了斑马鱼的自然倾向，当被引入一个新的环境时，它们大部分时间都呆在底部，然后在一段时间内逐渐扩大游泳范围，包括测试池的上部。在水箱底部呆的时间越长，说明焦虑程度越高[71]．

2.4.社会互动

斑马鱼是一种成群游动的鱼，在某些情况下可能表现出对同类的偏好。社会互动分析是基于Gerlai [72]．经过24小时的展出，可达到50或100件μg/L MC-LR，将五条鱼一组放置在一个小型实验箱（30 厘米长×15 厘米高×10 cm W）。在实验鱼缸的一侧，放置一个空鱼缸，在另一侧，有一个大小相同的鱼缸，内有15种同种。让实验鱼在30分钟内适应实验鱼缸 然后分析他们的行为。接下来的10天 本试验的结果分析如下。实验鱼缸实际上被分成两个相等的部分和一条垂直线。所有五条实验鱼在靠近同一鱼群的鱼缸一侧停留的时间用秒表测量。

2．5．急性约束应激(ARS)协议

ARS协议是基于Piato等人[73]．在适应期之后，鱼被提交给ARS协议。本实验将每只动物封闭在2ml的微离心机塑料管中，瓶盖关闭，两端开小口，使管内自由水循环，完全避免鱼类运动。囚禁90分钟后，轻轻捕获动物，立即用液氮冷冻，保存在−80°C，直到提取皮质醇。曝气(8ppm, Labcom Test Camboriú， SC，巴西)和水温(°C)。

2.6。测量的皮质醇

巴瑟罗等人详细描述了从斑马鱼中提取和测量全身皮质醇[74]．简单地说，斑马鱼被分为四组:第一组，斑马鱼暴露在含有培养基的水中m . aeroginosa24小时，被视为“阴性对照”；第二组和第三组暴露于最终MC-LR浓度为50%的细胞培养物中 μg/L和100 μ在24小时内，分别为g/L；在第四组，被认为是“阳性对照”，斑马鱼被提交给ARS方案。之后，斑马鱼被捕获，并立即冷冻在液氮中，储存在冰箱中−80°C，直到全身皮质醇提取。每只斑马鱼都被称重，一池三条鱼被切碎，放入一个一次性胃袋中，袋中有2条 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH值7.4）持续6小时 内容物被转移到一个10 mL螺旋顶一次性试管，5 添加1毫升实验室级乙醚。管子旋转了1小时 min，离心10分钟 3000分钟 转速。然后立即在液氮中冷冻试管，并倒出未冷冻部分（含皮质醇的乙醚）。将乙醚转移到新管中，并在温和的氮气流下完全蒸发2小时 h、 产生含有皮质醇的脂质提取物。提取物储存在实验室−20°C，直到用1 毫升PBS缓冲液。为了防止操纵可能引起的应激反应，捕获和杀死之间的时间少于10分钟 s使用市售的高灵敏度唾液皮质醇酶免疫分析试剂盒（Salimetrics，USA）在组织提取物的重复样品中测量全身皮质醇。通过比较PBS（pH 7.4）中组织提取物的标准曲线和系列稀释度之间的平行度，评估试验的特异性。用人类标准品构建的标准曲线与用斑马鱼组织提取物连续稀释获得的曲线平行。在线性回归检验中，高度正相关()在曲线之间。分析内变异系数为3.33 ~ 3.65%。

2.7。统计分析

探索性评估、社会互动和皮质醇水平的数据以均数±扫描电镜(mean±SEM)表示，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行分析，然后采用Newman-Keuls事后检验。一个显著的差异归因于．所有数据采用spss18.0 for Windows软件进行评估。

3.结果

在5分钟水箱潜水行为测试中，对斑马鱼游泳活动的不同参数进行评估。MC-LR曝光在100μg/L显著(单因素方差分析/Newman-Keuls，,)减少了旅行的距离(米)，与受管制动物有关(米)(图1（a）)和显著性(单因素方差分析/纽曼- keuls，,)增加了静止时间(秒)，而对照组(秒）（数字1（b）)，而MC-LR曝光在50μg/L不会改变这两个参数。在两种试验浓度下，未观察到交叉线数量、绝对转角和路径效率的差异（图1（c），分别为1D和1E。）。

对照组动物58.4%的时间()的底部。暴露于50和100的动物μg/L MC-LR显著(单因素方差分析/Newman-Keuls，,)增加了(93%)在测试槽底部的时间(和时，与对照组()（图1（f）).

在社会互动测验中，结果显示50和100μg/L的MC-LR浓度对动物的这种行为没有任何促进作用(图2.).

他们还测量了全身皮质醇水平。与对照组相比，ARS方案(阳性对照)导致全身皮质醇水平升高(单因素方差分析/纽曼- keuls，,;和与对照组相比，用两种浓度的MC-LR处理的斑马鱼的皮质醇水平没有改变（图3.).

4.讨论

行为改变反映了动物对环境的感知和反应，是动物暴露于环境干扰时的第一道防线[28]．因为已经证明，蓝藻粗提取物对水生生物的促进作用要么更明显，要么与使用纯毒素观察到的效果不同[75,76]，我们使用产生微囊藻毒素的蓝藻的细胞培养铜绿假单胞菌(MC-LR)，以评估mc对斑马鱼行为的影响。

根据先前的研究表明MCs在鱼类组织中积累，选择了动物暴露的毒素浓度和时间段[21,37–48].本文给出的结果表明，100 μg/L MC-LR减少了移动距离，增加了静止时间。然而，在两种浓度下的越线数量没有发现显著变化。当动物暴露在50和100μg/L, MC-LR导致花在底部部分的时间显著增加。结果还表明，测试的MC-LR浓度没有促进绝对转弯角度、路径效率或社交互动的显著变化。

由于行为将特定物种的生理功能与生态过程联系起来，它可能为检测有害化学污染物提供有用的指标或生物标记[77]．斑马鱼作为神经行为研究模型的潜力直到最近才出现。研究已经检测了斑马鱼幼虫的行为[78–81以及它们对不同药物的反应，如乙醇[82,83]和氟西汀[84]．对成年斑马鱼的研究包括社会行为[85–87]，嗅觉相关行为[88,89[],焦虑74]，上瘾[90–92,睡眠93]、学习与记忆[94,95]．

目前仍只有少数研究评估微环境对鱼类行为的影响。Baganz等人[34]证实暴露于MC-LR可引起斑马鱼自发运动活动的剂量效应相关变化。而暴露在较低浓度(0.5和5μg/L）导致白天活动性增加，暴露量增加（15和50 μg/L）导致不动性显著增加 μg/L)也降低了产卵活性和产卵成功率。与白天活动相比，在较高的MC-LR暴露下，夜间游泳活动显著增加。在另一项研究中，Baganz等人[35显示出斑马鱼自发运动行为的变化l . delineatus在暴露于浓度为0.5、5和15的MC-LR后μ17天和50天的总重量 μ付款六天。在白天，斑马鱼的流动性以及l . delineatus暴露在最低浓度下显著增加，而较高浓度导致流动性显著降低。受MC-LR的影响l . delineatus相反，从显著的白天活动变为夜间活动;斑马鱼在白天仍然活跃。此外，Cazenave等人[36的游泳活动发生了变化j . multidentata喂食含有MC-RR的受污染食物颗粒。低水平(0.01μg/g）增加游泳活动，而最高剂量（1 μ当游泳活动减少时，与对照组相比（仅在暴露约20小时后），使用的剂量（g/g）产生了显著变化。

在这个意义上，我们的研究结果表明MC-LR在最高浓度(100μg/L)导致斑马鱼移动距离减少，静止时间增加。有趣的是，在相同的MC-LR浓度和暴露时间下，尽管在更高浓度下有减少交叉数的趋势，但交叉数没有显著变化。需要强调的是，这些发现与Baganz等人之前发表的结果相似。35]．然而，这些作者使用纯化的毒素，而产生微囊藻素的蓝藻细菌的细胞培养铜绿假单胞菌(MC-LR)在我们的实验中使用。游动能力的下降，导致活动速度的降低，可能会降低鱼类收集食物的能力，使其更容易受到捕食[96]．在自然条件下，这种整体活动水平的降低最终会对生态系统中的生物造成不利影响，从而影响生物群落的结构和功能[34]．

暴露在一个新的环境中，斑马鱼会产生强烈的焦虑反应[97，直到它们觉得可以在水箱的上部安全游泳时，它们才会潜到底部[58]．这里，MC-LR在50和100μg/L促进了花在底部的时间的增加，表明一种焦虑行为。

斑马鱼是一种群居物种，表现出群体偏好和攻击性。浅滩行为在孵化后不久就开始，隔离饲养的鱼放在一起时很快就会形成浅滩[98]．一项研究表明，暴露于壬基酚5天可以减少幼虹鳟(雄鱼mykiss） ［99]．同样，暴露在除草剂下的金鱼也显示出聚集减少[One hundred.]．当斑马鱼暴露60 ~ 100天时，雄性斑马鱼的运动活动、攻击行为和群体偏好以及雌性斑马鱼的群体偏好均明显受到抑制μg/L壬基酚浓度[101]因此，我们评估了MC-LR暴露对斑马鱼社会互动的影响。然而，在对照组和MC-LR暴露的动物之间未发现显著变化。

研究表明，应激激素和行为之间存在着重要的相互关系[29–33]．血浆皮质醇水平升高是鱼类应激反应的主要指标[102]．和人类一样，斑马鱼使用皮质醇作为主要的应激反应激素[74]．考虑到这一点，我们测量了斑马鱼的全身皮质醇，以验证MC是否能引起治疗鱼的应激反应。然而，与对照组相比，暴露于这两种浓度MC-LR的动物的全身皮质醇水平没有发现显著变化。巴瑟罗等人[74研究表明，斑马鱼在与捕食者进行视觉接触后，全身的皮质醇水平会升高。与对照组相比，接受不可预测的慢性应激(UCS)方案的斑马鱼的皮质醇水平明显更高[103]．Bury等人[104研究发现，褐鳟(斑鳟属trutta)， 24 h后恢复到对照水平微胞藻属绿脓杆菌细胞。鲫鱼(Carassius auratus)暴露于亚致死和致死剂量(150μ克/公斤和600μ克/公斤,resp。)微胞藻属提取物显示出血浆皮质醇水平的显著急性升高，这表明MC诱导了处理鱼的应激反应。MC处理的鱼的皮质醇变化曲线似乎是剂量依赖的，表明高剂量组的鱼经历了更大的MC诱导的干扰[105]．

综上所述，鱼类的行为反应可能是一种有前景的亚致死毒性和水污染的生物标志物。一些行为终点测量，特别是运动活动和在底部停留的时间，可以为水生生态系统中MCs的有效评估提供依据。

致谢

本研究由Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (Proc. 472298/2010-0)和DECIT/SCTIEMS通过CNPq和Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do里约热内卢Grande do Sul (FAPERGS) (Proc. FAPERGS 10/0036-5- pronx)资助。L. W. Kist、J. G. S. da Rosa和G. Koakoski获得了Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)的奖学金。

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