文摘

在这里,我们调查的交互cuminaldehyde模型载体蛋白,牛血清白蛋白(BSA)。BSA-cuminaldehyde复杂的形成被确认通过紫外-可见(紫外光谱和进一步详细证明内在荧光光谱测量。观察到,cuminaldehyde猝灭BSA的内在tryptophanyl荧光。前的荧光数据,分析,修正了内滤效应(人生)因为cuminaldehyde显著吸收的激发波长,采用的测量。典型的Stern-Volmer情节略非线性;他们表现出负偏移向x设在一个典型现象,观察着拥有不止一个色氨酸残基的蛋白质。因此,修改后的Stern-Volmer方程来分析数据。分析数据显示,cuminaldehyde之间的相互作用与BSA通过静态猝灭机制进行,有一个公平的1:1之间的绑定。的相互作用加强了疏水力和氢键。降低浓度的cuminaldehyde并不影响BSA的二级结构,虽然增加了部分暴露了蛋白质减少α螺旋的内容。BSA的分子对接和模拟和cuminaldehyde进一步证实的形成稳定BSA-cuminaldehyde复杂。的在网上结果也表明了,疏水作用和氢键的贡献的稳定的驱动力。

1。介绍

存在以来,人类食用香料、香草和其他产品来自植物和动物。香料是很好的抗氧化剂来源,它也被用作食品添加剂(添加风味,色、香、味,等等)超过2000年(1]。孜然,这是一个基本要素在许多菜肴,是最受欢迎的香料之一。其利用率作为食品添加剂添加味道是很常见的,特别是在南亚和中东地区。此外,孜然采用传统药物做准备。在阿育吠陀医学体系中,孜然种子被用来治疗一些消化障碍,包括慢性腹泻和消化不良2]。此外,石油也用作驱风剂和止血的药物。

据报道,孜然籽油具有许多药用和药理性质,如抗菌、抗真菌、antibiofilm群体感应抑制,抗病毒、低血糖和抗癌活动(3]。它也证明了孜然籽油能提高药物生物利用度的抗生素药物,利福平(4]。此外,孜然油是一个很好的愈合和抗氧化剂代理,据报道,已表现出杀虫特性(3]。

孜然挥发油的包含几个类的化合物,包括萜烯、醇、酚类和醛类。孜然油的主要成分是cuminaldehyde,丁香酚,β蒎烯,连同其他几个化合物,获得在低收益率(3]。Cuminaldehyde(图1)是一种氧化单萜醛,是最大量存在于精油(EO)从孜然。Cuminaldehyde也占特征香气的香料5]。类似于源头,cuminaldehyde拥有几个治疗属性,包括治疗糖尿病药、抗肿瘤、神经保护、抗炎,抗菌,抗真菌的活动6]。据报道,它降低了血糖水平升高和增强胰岛素分泌比临床使用口服降血糖药,格列本脲(7,8在糖尿病大鼠。cuminaldehyde浓度可以有效地降低黑色素的合成减少小鼠黑色素瘤细胞系。然而,高浓度范围cuminaldehyde非常细胞毒性的9]。此外,cuminaldehyde抑制的颤动α量-核蛋白,它是一个关键的过程在一些神经退行性疾病的病理生理学,尤其是帕金森病(10]。

这些广泛的治疗价值cuminaldehyde促使我们考虑其绑定到丰富的血浆蛋白,血清白蛋白,这也是一些外源性和内源性物质载体蛋白,如脂肪酸、胆红素、和各种各样的药物(11- - - - - -15]。血清白蛋白结合药物的功效是关键以来治疗属性每个药物具有不同albumin-binding形象,范围从非常强大非常弱的绑定。强大的约束力功效的药物可能会增加其在人体,从而增加许多不必要的副作用的概率。相反,弱绑定功效的药物可能会更短的半衰期和早期从身体的排泄,从而使它不那么有效由于其缺乏所需的行动。此外,绑定的物质,获得从自然资源(植物),血清白蛋白极大地吸引了利益的研究(16- - - - - -25]。最近,一些天然产物的绑定从不同的来源获得,包括红海海绵、百里香,cuminol,藏红花,血清白蛋白是调查,发现这些化合物相互作用与血清白蛋白不同,产生不同的影响后者的结构(26- - - - - -29日]。因此,它是很有价值的阐明使用血清白蛋白治疗代理机制。

在这项研究中,牛血清白蛋白(BSA)被雇佣为模型蛋白由于其相似人类血清白蛋白(> 76%30.),其与cuminaldehyde通过光谱研究和计算方法。

2。材料和方法

BSA (≥98%, A7030)和cuminaldehyde(≥98.0%, 135178)从σ购买。20毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液的pH值7.4是受雇为研究介质。可见-紫外可见光谱的测量都是基于优秀的λ45进行分光光度计使用1厘米石英电池。在日立的测量荧光强度进行了f - 7000荧光谱仪配备了珀尔帖效应系统维护所需的温度。狭缝的宽度为5 nm,激发和发射和光电倍增管(PMT)电压是500 V。蛋白质很兴奋在295 nm,荧光发射光谱被记录在300 - 500纳米的范围内。Jasco j - 815圆二色性(CD)分光偏振计来进行远紫外CD测量200 - 250纳米的范围内利用2毫米石英试管保持高压电压低于600 V。分子对接和分子动力学(MD)模拟进行采用薛定谔的滑移和德斯蒙德模块,如前所述[31日]。简而言之,BSA的三维结构是RCSB-PDB从数据库下载。蛋白质的结构使用蛋白质制备精制向导滑行通过删除不必要的水分子,添加任何丢失的氢原子,分配键命令,创建零键序二硫键和删除任何杂原子。生成氢键网络。最后,opls - 2005(优化潜力液体模拟- 2005)力场是最小化系统的能源利用。同样,cuminaldehyde的结构是在2 d舞台布景设计者的薛定谔和优化平台对接的分配适当的键序和角度LigPrep薛定谔的模块。不同的电离状态cuminaldehyde在pH值生成 使用Epik模块和能量最小化的opls - 2005力场。BSA的结合位点预测使用站点地图模块,和标准的精度(SP)一盒内进行分子对接 ,放置在 。停靠BSA-cuminaldehyde复杂被用作MD模拟的起点将其放置在一个斜方晶系的模拟框至少10远离墙壁。盒子和TIP3P水分子溶剂化,通过添加Na +或Cl-ions中和。此外,0.15 M氯化钠添加模拟生理条件。整个系统是最小化使用opls - 2005力场和生产运行进行了不扩散核武器条约》乐团在330 K温度和1.013条压力。大师是利用可视化和分析的结果。绑定关联(K_d)对BSA的cuminaldehyde评估使用以下对接自由能之间的关系和亲和力32]: 在哪里R和T玻耳兹曼气体常数(1.987大卡/摩尔/ K)和温度(298 K),分别。

3所示。结果和讨论

的紫外光谱−Vis cuminaldehyde图所示1(一)。的紫外线−Vis光谱BSA和cuminaldehyde如图1 (b)。BSA展出两个高峰:一个强峰周围210海里是由于多肽链的吸收,和其他在280 nm的存在是由于芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)33- - - - - -35]。自cuminaldehyde这附近表现出强烈的吸收波长,其贡献是减去累计谱的复杂;因此,它被称为差光谱(36,37]。BSA的紫外可见吸收的状况略有改变cuminaldehyde的存在,因为它们之间形成一个复杂的(38]。

生物分子的相互作用,尤其是蛋白质,可以很容易地研究了荧光光谱由于内在的大多数蛋白质的荧光性质,这是显示在一个或多个fluorophore-like色氨酸和酪氨酸存在其中。BSA包含两个色氨酸残基,通常指定为trp - 134和trp - 212∼20酪氨酸残基的形式分布于整个蛋白质域(30.]。酪氨酸荧光比色氨酸时孤立。然而,当他们在一起时,色氨酸发射的最大荧光是一种结果,是由于有效的能量转移从酪氨酸、色氨酸(39]。当蛋白质溶液兴奋在280海里,它展现了排放的色氨酸和酪氨酸残基发射最大在340纳米左右,而色氨酸时只发出荧光激发波长为295 nm。观察到的荧光发射的BSA没有和cuminaldehyde激发波长为295 nm和各种温度数据所示S1- - - - - -S4。图1(一)表明cuminaldehyde展览相当大的吸收在295海里。因此,荧光数据必须纠正内滤效应(机上娱乐系统;因素极大地影响蛋白质的荧光猝灭的概要文件由配体,展品显著吸收的激发和发射波长)28,37]。因此,人生是由方程(修正S1)。修正后的BSA的荧光光谱有或没有在295 nm cuminaldehyde励磁和各种温度数据所示2(一个)- - - - - -2 (d),观察和纠正光谱之间的差异可以通过简单的阐明视觉检查。

添加到BSA cuminaldehyde时,后者的荧光强度降低(淬火),因为这两个相互作用的荧光团的微环境变化。Stern-Volmer猝灭常数(K_SV)是一个衡量的淬火效果的荧光团冷却器,可以表达了以下方程: 在哪里F₀和F显示没有和cuminaldehyde BSA的发射强度,分别,问是饮料的浓度(cuminaldehyde) [40]。此外,K_SV因素是相关生物分子淬火速率常数(K_问)通过以下关系: 在哪里τ₀平均寿命 的荧光团没有饮料41]。

的情节 vs。的拦截1可以用来获得K的值_SV作为他们的斜坡。故事情节在图所示3(一个)和的值和 ,而从方程(1),展示在表1。图中显示,情节偏离了线性和向下弯曲向展出x设在,这是一个常见的现象,与不止一个色氨酸残基的存在与冷却器(不同的可访问性39]。

如前所述,Stern-Volmer情节的向下弯曲是由于两个或两个以上的色氨酸残基的存在,这是位于不同的环境,拥有不同的可访问性饮料,在蛋白质。修改后的Stern-Volmer方程可以应用于计算 ,的猝灭常数访问分数由以下方程(42,43]: 在哪里的分数是最初的荧光,可以弄熄。因此,的值K_一个图形由方程(3),的情节 vs。 产生了和分别截距和斜率。的值K_一个和f_一个展示在表2。

荧光猝灭分为静态或动态,尽管两者的结合在一个冷却器和荧光团之间的相互作用,主要表现为向上的曲率Stern-Volmer情节,也被观察到(33,34,39,44]。一般来说,静态猝灭与中度到强烈的相互作用,而弱相互作用通过动态猝灭机制[收益37,39),可以理解的价值观K_问如下:淬火是静态的K_问值是足够高于diffusion-controlled极限 (39]。相反,这一机制是动态的值K_问接近或低于diffusion-controlled限制。此外,静态和动态类型的淬火可以区分他们的相反对温度的依赖关系。高温促进动态猝灭,而一个低支持静态猝灭。因此,评估的猝灭常数在不同的温度下可以阐明淬火的类型,参与互动。的值K_SV和K_问在不同的温度下(表1)和K_一个(表2)表明,增加温度降低淬火常数,和的值K_问远高于diffusion-controlled限制;因此,推导出在这里,BSA的绑定cuminaldehyde通过静态猝灭机制。

结合常数(K_b)和结合位点的数量(n)可以通过使用下面的公式计算45]: (在哪里P]₀BSA的总浓度和[D]₀cuminaldehyde的总浓度。使用方程(荧光的数据进行处理5)的逐次逼近方法,日志的情节 对 被显示在图3 (c)。

的值K_b和n,从土地获得的 vs。表中列出3。有一个公平的1:1绑定BSA和cuminaldehyde之间。利用的价值K_b得到这里,范霍夫的热力学参数计算方程(方程S2和S3)。范霍夫情节(lnK_b与1 / T) BSA-cuminaldehyde交互如图4(一)。焓的值(ΔH)和熵( )变化计算的山坡和拦截范霍夫的情节,分别列在表3。这些值被进一步应用于计算的值在不同的温度下(方程S3)。热力学参数的值表明绑定是自发放热,增加系统的熵。这些热力学参数,特别是和 ,也可以应用于确定绑定部队(氢键、疏水、范德瓦耳斯和静电作用),参与互动(46]。疏水相互作用占主导地位时的值和是积极的。相反,这些参数的负交互时可以获得支持主要通过氢键和范德华力。Δ的计算值H(负)和Δ年代(积极的)透露,氢键和疏水力量绑定cuminaldehyde BSA的关键。

远紫外CD是一个有价值的技术,定性和定量地阐明二级结构组件。关于二级结构组件的信息,如α螺旋,β表,β转,随机线圈,可以获得的远紫外CD测量在200 - 250海里。的α螺旋蛋白质的特点是两个消极的乐队在208和222海里,虽然β表的蛋白质表现出只有一个消极的乐队在218海里。因此,蛋白质的二级结构的变化和结构变化可以通过CD光谱监测。BSA是一个α螺旋蛋白质的α螺旋∼67%的内容30.]。BSA的远紫外CD光谱没有cuminaldehyde,这表现出两个负峰值在208和222海里,如图所示4 (b)。低浓度的cuminaldehyde施加一个轻微的对BSA的二级结构的影响。然而,一些显著的减少α螺旋性观察通过增加cuminaldehyde的浓度。

%α螺旋的蛋白质是由下列方程计算(47]: 的意思是残留椭圆率(绝笔)使用以下公式计算: 在哪里是观察到的椭圆率(盐度精确),C是蛋白质的浓度(摩尔),n氨基酸残基的数量,l路径长度(厘米)。从上面的关系证明,%α螺旋BSA的内容没有和cuminaldehyde计算。这是观察到的α螺旋本机BSA含量是68.5%,这个值是在良好的协议与以前观察到的。此外,没有可见的变化在BSA的CD谱20μM BSA(数据没有显示),虽然α螺旋性40时略微下降至67.7%μM cuminaldehyde补充道。%α螺旋线的BSA进一步下降到65.1%和63.8%的浓度cuminaldehyde进一步增加到60 - 100μM,分别。因此,它认为cuminaldehyde浓度的增加可以部分BSA展开。

3.1。分子对接和MD模拟分析

cuminaldehyde对BSA的结合位点以及它们之间的相互作用的本质,阐明分子对接。BSA的结构的初步分析显示,它包含两个主要的结合位点,即Sudlow网站I和II位于子域的花絮和iii a,分别。在子域IB新的结合位点,这被称为网站IB或洋地黄毒苷网站也报道绑定的胆汁盐(48]。盲目的对接与BSA cuminaldehyde透露,这是绑定在一个十字路口Sudlow I和II的网站,因此引人入胜的残留物从子域活动花絮和iii a(数字5分别(a))。Cuminaldehyde形成两个氢键ser - 279和亮氨酸- 280和疏水相互作用形成板式换热器- 205,ala - 209, ala - 212,亮氨酸- 326,亮氨酸- 330,亮氨酸- 346,ala - 349, val - 481(图5(b))。一些残留物,如参数- 208,赖氨酸- 350,Glu353也导致BSA-cuminaldehyde的稳定性。能源标准对接精度(SP)模式估计−5.8480千卡摩尔⁻¹,对应于一个K_d的价值 。

BSA-cuminaldehyde复杂的稳定和动态评估的MD模拟100 ns。均方根偏差(RMSD)测量偏差仅在蛋白质的结构或复杂的配体基于最初的形式。表示整个C的测定α没有和cuminaldehyde BSA的原子。只有RMSD BSA的波动在1.6 - -3.2范围(图的仿真时间6(a))。相反,随后RMSD BSA-cuminaldehyde复杂的波动在0-20 ns仿真、后达到一个稳定的值在一个可接受的限制2的仿真时间。获得的平均RMSD BSA的值没有和cuminaldehyde分别为2.58和2.32,分别。结果证实的形成一个稳定的BSA-cuminaldehyde复杂。此外,均方根波动(RMSF)措施蛋白质的侧链的灵活性,因为配体的绑定。在这项研究中,RMSFs的Cα测量原子的BSA和cuminaldehyde比b因子(这是由x射线晶体学实验确定)。垂直的绿线代表氨基酸残基的位置,与cuminaldehyde(图6(b))。总的来说,结果证实cuminaldehyde与BSA形成一个稳定的复杂。此外,二级结构的变化的分析元素(ss)的组织,这是由于cuminaldehyde的绑定,被确定为一个函数的仿真时间(图7(a))。观察,上交所的BSA BSA-cuminaldehyde复杂是整个模拟稳定的维持在66.0%左右,从而表明绑定cuminaldehyde并不影响BSA的二级结构。此外,BSA和cuminaldehyde由监测的稳定性形成总数BSA和cuminaldehyde模拟之间的联系。我们确认的联系人cuminaldehyde与BSA之间的范围0 - 5,平均约两个联系人(图7(b))。这些结果与分子对接结果吻合较好,从而表明cuminaldehyde两个氢键与BSA形成的。

此外,回转半径(rGyr)是一个重要的参数测量的整体紧密绑定到配体的一种蛋白质。这里,我们有监控rGyr BSA与cuminaldehyde模拟(图8(a))。rGyr的分析显示,平均拥有2.67的价值,虽然它在2.60和2.73之间波动在整个模拟。同样,分子表面积的变化(MolSA) solvent-accessible表面积(莎莎)和极地BSA的表面积(PSA) BSA-cuminaldehyde复杂的测量来确定曝光的氨基酸残基溶剂由于其绑定到配体(数字8(b)——8(d))。MolSA和PSA BSA-cuminaldehyde复杂波动在172 - 179的范围²和42-46²平均值为175.7和43.8²,分别。此外,莎莎BSA整个模拟39号保持不变²除了在50 - 60 ns和95 - 100 ns,分别。

4所示。结论

孜然,以及其EO,是一个受欢迎的香料,具有药用价值。像其他香料和草药,它还包含多种次生代谢物,占其味道和药用价值。cuminaldehyde之间的相互作用(孜然)的主要组件的光电模型载体蛋白(BSA)研究工作。Cuminaldehyde展出一个合理1:1与BSA互动,随温度增加而降低。这对应于一个静态猝灭机制,氢键和疏水力量占交互的主要力量。交互也减少了α螺旋BSA的内容。

缩写

ΔG:	自由能变化
ΔH:	焓的变化
Δ年代:	熵变
BSA:	牛血清白蛋白
CD:	圆二色性
EO:	精油
机上娱乐系统:	内心的过滤效果
K一个:	修改Stern-Volmer猝灭常数
Kb:	结合常数
Kd:	亲和力
KSV:	Stern-Volmer猝灭常数
K问:	淬火速率常数
MolSA:	分子表面积
MD:	分子动力学
n:	的结合位点
PMT:	光电倍增管
PSA值:	极地表面面积
rGyr:	回转半径
表示:	均方根偏差
RMSF:	均方根波动
莎莎:	Solvent-accessible表面积
上交所:	二级结构元素
紫外可见:	紫外可见光。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

”作者承认的慷慨支持人员支持项目(负责2023 r122),沙特国王大学,利雅得,沙特阿拉伯。”

补充材料

实验的详细过程和计算研究。方程(S1):方程修正内部过滤效果,方程(S2)和(S3): S1-S4范霍夫方程,数据。观察到的荧光光谱在25岁,35岁,45 - 55°C。(补充材料)