文摘

在本研究中,pyrazoline哒嗪衍生物7-methyl-2-phenyl-4 - (3、4、5-trimethoxyphenyl) 2 h-pyrazolo [3,4 - d]哒嗪(5 d),研究了其与牛血清白蛋白(BSA)的交互。各种光谱技术和分子对接分析用于理解交互的机制。通过使用试验药物的猝灭BSA荧光5 d方法的基本原理。Spectrofluorometric方法和紫外吸收进行了研究探索的5 d和BSA绑定机制。BSA的荧光猝灭机理5 d相互作用是年代tatic淬火,也形成一个复杂的发生。焓和熵值达到积极的暗示在BSA和疏水的参与力量5 d交互。2.23 nm的福斯特距离计算了荧光共振能量转移(FRET)。BSA二级结构的改变从BSA的构象研究证明5 d交互。这个绑定交互研究提供了一个理解绑定之间的相互作用的基础5 d和组织。这些结果提供的信息网站的BSA参与互动5 d。

1。介绍

前列腺素生物合成(环氧酶;cox)是被非甾体类抗炎药(1,2]。花生四烯酸是由考克斯酶分解产生前列腺素具有许多重要的生理功能。主要使用非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药)来减轻疼痛和炎症是由于某些患病的状态。COX-1同种型主要是所有生理条件下诱导,而在致癌作用和炎症反应,引起cox - 2 (3]。cox - 2抑制剂的合成改进管理的辅助疼痛,炎症,和其他相关的障碍。除了某些病变的有效管理,cox - 2抑制剂已经建立了增强胃肠耐受性和更少的副作用相比,非选择性非甾体抗炎药(4,5]。

然而,长期使用选择性COX-inhibitors或非选择性非甾体抗炎药可导致严重心血管事件(6,7]。为了克服某些药物的副作用,它们的结构修改或新药物,目的是发现生产安全、治疗药物(主管8]。

吡唑支架具有抗炎(9- - - - - -12],止痛剂[13),神经保护(14)、抗抑郁和抗惊厥的活动(15,16]。一些pyrazoline衍生品具有镇痛活性和抗炎活性苯基丁氮酮,塞来昔布,deracoxib。

在这种背景下,5 d(图1)是合成药物化学实验室内部的目标是找到一个新的cox - 2抑制剂可能具有更好的耐受性和更少的副作用17]。合成的化合物5 d强烈的表达下调cox - 2诱导和抑制其表达42.8%相比,脂多糖(LPS)——刺激控制细胞表达(100%)。同时,强烈抑制LPS-induced观察一氧化氮合酶的表达5 d(17]。

在体循环,合成药物与蛋白质接触,从而导致药物相互作用。血清白蛋白蛋白质存在于血液维持渗透压(胶体)和传输生物分子如类固醇,脂肪酸,和体内激素18- - - - - -20.]。药物分子与血清中白蛋白和也由体循环。药效学和药代动力学(吸收、分布、代谢和排泄)药物的性质是高度受到protein-drug互动(1,2]。减少配体的一生是由于其弱结合白蛋白,也导致了可怜的分布。然而,一个强大的约束力与配体的互动导致自由配体浓度的减少。结合配体相互作用的研究和理解,因此,白蛋白在分子水平上评估配体的生物活性的关键。因此,药物与白蛋白的绑定机制,需要调查及其分布(20.- - - - - -23]。

因为BSA和人血清白蛋白(HSA)的同源结构(2],由于低采购成本的组织,它是一种流行的方式与BSA替代HSA代表protein-ligand血清白蛋白的相互作用研究。BSA -亲和力、模式5 d系统使用荧光光谱测定。

荧光猝灭的研究包括同步和三维荧光和紫外光谱研究进行了理解与BSA之间的绑定机制5 d。结合位点的5 dBSA成立与配体置换使用网站调查研究配体苯基丁氮酮为网站我和布洛芬网站二世(24,25]。BSA和分子对接研究5 d交互也执行与实验结果证实。这项研究的结果将有助于进行药代动力学的研究5 d。

2。材料和方法

2.1。材料

复合5 d合成了内部(17,21]。其他材料采购如下:脂肪无酸的BSA(西格玛奥德里奇;美国)、布洛芬和苯基丁氮酮(国家科学公司;KSA)。

2.2。样品制备

BSA股票制备磷酸缓冲盐(PBS;pH值7.4)。的股票5 d(5毫米)准备在乙腈和与PBS稀释pH值7.4。

2.3。紫外可见吸收光谱

日本岛津公司uv - 1800(日本岛津公司日本)分光光度计是用来记录紫外可见吸收光谱。BSA的光谱在不同浓度的缺失和存在的5 d被获得。在室温下进行测量和固定BSA浓度。

2.4。荧光光谱

荧光光谱仪(JASCO模型fp - 8200)被用来记录荧光光谱。光谱获得了BSA(固定浓度)在不同的缺失和存在5 d浓度。荧光光谱是在298年,303和310 K。光谱被收购了λ_前女友= 280海里,λ_新兴市场= 300 - 500 nm。

2.5。荧光猝灭测量

BSA的光谱记录各种浓度的存在5 d(0-18μBSA的浓度(1.5米)μ所有测量M)保持不变。BSA荧光猝灭5 d。Stern-Volmer方程用于荧光数据评估: 在哪里F和F₀BSA的荧光强度(FI)的存在和无配体5 d。K_sv代表Stern-Volmer猝灭常数;K_问双分子的猝灭速率常数。(问是饮料的浓度,τ₀“是荧光团的平均寿命时间。

双对数回归图被用来获得BSA的结合常数5 d。下面的方程是用来表达分子的平衡:

在(2)”n”是结合位点和数量K_b是绑定常数。

热力学的研究有助于确定类型的交互和债券参与交互。标准吉布斯自由能变化了

2.6。同步荧光(SF)和结合位点探测实验

科幻光谱有助于测定和表征微环境变化的氨基酸残基酪氨酸酪氨酸和色氨酸(Trp)。BSA -5 d系统,这些变化记录使用一个常数∆的区别λ= 60和15 nm激发和发射波长之间的关系。这些科幻光谱达到298 K。药物与苯基丁氮酮和布洛芬位移进行了研究,以建立BSA的结合位点5 d。

2.7。三维(3 d)荧光光谱

这些光谱帮助获得发色团的信息。数据帮助找到构象改变蛋白质与配体(BSA)发生互动(5 d)。3 d光谱获得了BSA和BSA -5 d系统。

2.8。分子对接

分子对接是分子的操作环境(MOE)。分析被执行死刑与BSA水晶结构(共晶与萘普生,PDB ID: 4 or0)。的5 d结构是在教育部软件。能量最小化从默认MMFF94X的场力参数,实现每股收益=r,截止(8 - 10)。使用默认对接参数三角形匹配器。得分函数1,伦敦dG和函数2是GBVI / WSA dG。最合适的交互被指定为每个获得的均方根值(21]。

3所示。结果与讨论

3.1。荧光猝灭的研究

蛋白质与配体相互作用与荧光猝灭可以理解的研究蛋白质配体。BSA的荧光行为是由于氨基酸残基,Trp,酪氨酸和板式换热器残留物,嵌入式。三个氨基酸的荧光强度比出现在BSA是100:9:0.5 Trp,酪氨酸,分别和板式换热器26]。因此,这两个Trp残留在BSA主要负责其荧光。子域上的残留trp - 134 IB表面,而trp - 213是在子域活动花絮疏水口袋里。BSA荧光因为的酪氨酸残基被用来研究构象变化和配体相互作用。酪氨酸的量子产量Trp几乎是一样的;然而,吲哚组的蛋白质主要是负责紫外吸光度(∼280海里)和发射(∼350海里)。激发光谱测量λ_新兴市场= 340海里(图2(一个)BSA和BSA -5 d比较,他们提供信息的影响5 d浓度增加(Trp行为27]。

BSA浓度保持不变。5 d浓度是不同的在不同的样本获得的荧光猝灭光谱(图2 (b))。BSA的FI的浓度降低5 d增加了。一个小1海里的红移λ_(排放)暗示的氨基酸被发现存在于极地环境和有较高的暴露在溶剂(28]。猝灭机制分为静态和动态猝灭。动态猝灭和静态猝灭是有区别的基础上,温度和粘度的影响。在动态淬火,淬火常数随温度上升由于高扩散和碰撞猝灭。相比之下,更高的温度会导致不稳定的复杂和更低的淬火静态猝灭常数。因此,降低淬火常量值在更高的温度指示nonfluorescent复杂的形成和静态猝灭机制(29日]。

Stern-Volmer方程(1)用于解释淬火protein-ligand交互机制。低K_sv观察在高温下(图3(一个)),从而推断BSA -的形成5 d极化子复杂(表1)。同样的,K_问(碰撞猝灭常数)也有助于说明猝灭机制并给出

的最大价值K_问动态猝灭过程是2×10¹⁰L·摩尔⁻¹·年代⁻¹(25,30.],BSA -的值5 d系统相当大于最大值(表1)。这些结果表明,静态猝灭参与BSA -5 d交互。

3.2。结合常数和结合位点的数量

从方程(2日志(情节),(F₀/F)−1)和日志(问]了一条直线,结合化学计量学(n)等于斜率和K_b(绑定常量)拦截(图3 (b))[31日]。结合常数在不同的温度下和“n“值表中给出2(32]。

站点特定的标记用于结合位点的识别使用竞争结合实验研究。具体网站标记苯基丁氮酮(PBT)网站我和布洛芬(IBF)网站二世BSA被用来研究结合位点参与竞争5 d(图4)[24,25]。BSA的光谱记录网站的存在标志着两个常量和增加的浓度5 d浓度在室温下(图3 (d))。一个巨大的减少BSA的结合常数5 d系统添加网站的标记PBT和IBF是观察(表3)。的结合常数减少要么PBT和IBF以及减少比IBF PBT的存在,这是推断出来的5 d可能是绑定的BSA在网站I和II和网站我最好。

3.3。热力学参数

四个主要力量,即疏水相互作用,氢键,范德华和静电相互作用力量参与ligand-protein互动(33- - - - - -35]。从范霍夫热力学参数计算方程(图3 (c)): 在哪里K_b和R分别代表绑定和气体常数。的∆H°和∆年代°分别焓和熵的变化;∆G°代表吉布斯自由能。这些参数的计算值在表2。∆的价值H°> 0,∆年代°> 0表明疏水作用。范德华力或氢键的形成暗示如果∆H°< 0,∆年代°< 0,而∆H°≈0,∆年代°> 0指示一个静电力。(负∆的结果G°)标明自发绑定之间的交互5 d和组织。积极的∆H°和∆年代°推断出疏水性的主要影响力量与BSA之间的相互作用5 d。

3.4。紫外可见光谱

紫外可见光谱法被广泛应用为研究protein-ligand互动和结构变化,可能会发生,因为它(36- - - - - -38]。蛋白质分子中复杂的吸收光线λ_马克斯= 280海里,主要是由于氨基酸残基法Trp, BSA和酪氨酸,BSA的其他吸收峰发生在205 nm,归因于BSA的多肽链。

内的微环境改变氨基酸附近由于protein-ligand交互提供信息绑定机制(39,40]。BSA的吸光度的增加观察到280 nm和205 nm (41]。这种增长是归因于之间的相互作用5 dBSA,最大吸光度(1纳米)转向更高的波长(图5(一个))在对波长进行了研究。这些变化在280 nm和205 nm建议改变微环境的酪氨酸蛋白和肽债券。因此,集体转移在205 nm和280 nm表明蛋白质结构构象变化(42]。BSA和之间的阴谋5 d与浓度5 d在205和280海里表明获得的情节是非线性和偏离直线(图5 (c))。这种行为的紫外线数据显示复杂的形成与BSA构象变化5 d。规范化的荧光激发光谱(归一化淬火效应)也对BSA和获得5 d混合物,在图5 (d)。正常化后,没有观察到变化激发光谱∼280海里;然而,峰值在∼226海里代表最低激发态的芳香族氨基酸(Trp和酪氨酸)BSA显示减少强度增加5 d并建议周围的微环境变化和酪氨酸残基。的参与互动的动态猝灭BSA和5 d并不认为是BSA的吸收光谱的存在吗5 d在这种情况下可能会被影响。然而,增加与BSA的吸收强度5 d表明他们之间复杂的形成(图5 (b))和参与静态猝灭43]。此外,没有重叠在BSA的吸收光谱,5 dBSA -5 d,(BSA -5 d)- - -5 d。这些结果在图5 (b)也确认复杂地层发生与BSA之间5 d。

3.5。能量转移

绑定在BSA和距离5 d计算使用荧光共振能量转移(FRET) (34,35)(图6)。担心发生由于发射光谱的重叠(供体)和吸收光谱(受体)。担心效率取决于之间的重叠度和距离发射和吸收光谱和计算(44] 能量转移效率作为在哪里E。”r“施主和受主的距离,R₀是关键的绑定距离当能量转移(50%)和由吗 在哪里K²表示偶极子取向;给出了介质折射率为“n”;“ϕ”是缺乏受体的捐赠者的量子产率;和J表示在发射和吸收光谱和光谱重叠程度给出 在哪里F(λ)是发射光谱荧光供体。ϵ(λ)表示摩尔吸光系数系数受体。的值K²= 2/3(随机取向的流体解决方案)。介质的折射率为1.336ϕ_D对BSA (= 0.11843,44]。的计算值E,R₀,J(λ)展示在表4。

绑定的距离r= 3.89推断附近的供体和受体。此外,供体和受体之间的距离(r< 8海里)显示高从BSA非辐射的能量转移的可能性5 d。此外,静态荧光猝灭机制也可以推断与BSA之间5 d。

4所示。构象的研究

4.1。同步荧光研究

同步荧光研究提供信息的微环境变化负责荧光的蛋白质的氨基酸(44- - - - - -47]。这些研究测量的转变λ_哦,这可能由于发生变化的生色团分子附近。BSA的荧光残留Trp和酪氨酸可以分析任何∆微环境的变化λ= 15 - 60 nm,分别。靠近发色团分子的极性有关的转变最大的排放强度。的转变荧光发射最大值对应的位置改变发色团分子的极性。因此,蓝色转变的最大发射表明更多的疏水性氨基酸残基的微环境,为他们和红移推断极地环境和更多的溶剂接触。

Δ没有谱的转变λ= 15海里表明微不足道的影响5 d在酪氨酸微环境(图7(一))。此外,无关紧要的红移∆(1纳米)也被观察到λ= 60 nm观察(图7 (b))。这些无意义的发射波长的变化表明,5 d与BSA没有交互影响的构象地区酪氨酸和Trp位于(42]。

4.2。三维荧光光谱

三维荧光光谱获得访问蛋白质结构变化相当受欢迎。它详细叙述了蛋白质的构象修改由于protein-ligand互动(21,43]。BSA的构象和微环境的变化探讨了相关光谱的变化后BSA的缺失和添加5 d(图7)。所确定的山峰(图8(一个)和8 (b))如下:峰值(瑞利散射峰;λ_前女友=λ_新兴市场)和峰值b(2^nd阶散射峰;λ_新兴市场= 2例)[46]。峰的强度随着浓度的增加5 d。峰值强度的增加归因于复杂的形成,因此,一个更大的高分子的大小会导致更高的散射效果。峰1 (λ_前女友/λ_新兴市场= 278/340 nm)代表Trp和酪氨酸残基,在∼280海里感到兴奋和负责BSA的荧光。的荧光法是可以忽略的,不考虑。峰2 (λ_前女友/λ_新兴市场= 226/340 nm)代表了荧光的电子从激发态在BSA和酪氨酸残基。荧光研究三维轮廓图给出的数字8 (c)和8 (d)。峰的强度比1 BSA: BSA -5 d系统1:0.77和0.69 2是1:峰值(图8)。在BSA山峰都从不同的残留,在互动和改变5 d建议BSA某种微环境的变化。峰2被认为是从肽链被证明是错误的48]。峰2是由于芳香残留在紫外光区域,得到吸收迅速放松到最低激发态,然后释放范围在300 - 350海里。因此,峰2还提供了微环境变化的信息,可能会发生在Trp和酪氨酸残基的励磁∼280海里。同步荧光结果显示没有变化的蛋白质构象Trp附近和酪氨酸残基。然而,激发光谱图5(d)显示励磁的变化BSA在添加5 d。图9代表着∆酪氨酸和相应Trp残留λ= 15 - 60 nm,分别和三维荧光等高线图。这一数字证实Δ的值λ= 60 nm导致色氨酸的直接探测发射。

4.3。分子对接

分子对接有助于理解和解释BSA和之间的相互作用机理5 d(47,49,50]。分子对接充当in-silico工具分析protein-ligand交互和验证实验的解释。已经知道,BSA的疏水腔子域活动花絮I和II和iii a代表网站,分别。网站调查位移有研究表明子域名花絮/ iii a或BSA参与绑定5 d。的构象至少结合能网站我和站点II给出图10。配体5 d嵌入在子域的疏水腔花絮和iii a自由结合能−31.04 kJ·摩尔⁻¹和−30.12 kJ·摩尔⁻¹。配体5 d343氨基酸残基Ser包围,爵士201年爵士453年,Arg 217年,198年参数,参数194年,454年低浓缩铀,列伊480年,346年低浓缩铀,210年低浓缩铀,列伊197年,290年阿拉巴马州,阿拉巴马州209年,342年瓦尔,Val 481、451年酪氨酸,Asp 450的疏水腔花絮(数据吗10 ()和10 (c))。色氨酸残基213年Trp也在附近5 d现场。此外,一个氢键Arg 194 (N-Arg194 2.88)被观察到。疏水残基参与互动是阿拉巴马州290年,342年Val,列伊197年,454年低浓缩铀,列伊346、480年低浓缩铀,阿拉巴马州209。

同样,子域名iii a Asn 390的疏水空腔,爵士488年,413年赖氨酸,Arg 409年Gln 389年,386年低浓缩铀,列伊490年,429年低浓缩铀,456年低浓缩铀,列伊452年,448年用力推,Val 432年法487年,402年和板式换热器,周围残留花絮(数字10 (b)和10 (d))。酪氨酸残基(410年酪氨酸)被发现附近的5 d网站二世和5 d之间的氢键被发现酪氨酸410 (N-Tyr410, 2.35)。另一个氢键被发现与赖氨酸413 (N-Lys413, 3.15)。的疏水残基附近的站点二世于386年低浓缩铀,452年低浓缩铀,Gln 38951,52]。

这些结果确认的热力学研究和现场调查研究,推断,疏水的力量贡献了BSA -5 d相互作用,以及两个站点I和II也参与其中。该站点的刚性和柔性对接进行BSA的我。柔性和刚性对接,只有一个氢键被发现的细微差别参数之间的键长194和5 d在灵活(3.12)和刚性对接(2.88)。他241包含一个氨基酸残基咪唑环,可以缓解Trp 213荧光。他241年和213年Trp之间的距离是3.9的刚性对接,灵活对接相比,减少到3.7的距离。自从241年被放置接近Trp 213残渣,他241年对Trp 213不能排除。此外,trp - 213和之间的距离5 d在刚性3.3和3.5的灵活对接研究,这些结果与荧光研究的结果一致,没有观察到的重大转变在BSA和之间的相互作用5 d(53]。

5。结论

研究了绑定BSA和之间的相互作用5 d使用不同的光谱和分子对接技术。BSA -5 d交互是一个静态猝灭机制。绑定的网站,网站我BSA和/或网站二世,参与了互动5 d。现场调查和分子对接研究结果证实。三维荧光和UV-spectrophotometric研究表明BSA构象变化由于其相互作用5 d。积极的自由焓和熵的BSA -5 d系统建议的疏水作用。本研究可以有助于理解药理学和生物化学行为5 d自从强弱绑定到这些蛋白质起着药物的治疗能力的主要规则。绑定的药物血清白蛋白也会影响他们的分布和消除,和5 dBSA温和的亲和力。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者想扩展他们的真诚感谢院长以来的科学研究。这项工作是由科研院长以来,沙特国王大学(研究小组。rg - 1435 - 073)。