牙髓学的生物膜的拉曼光谱特征矩阵

文摘

牙髓学的持续性感染通常是由细菌生物膜。这种细菌生长模式的特点是一个矩阵的存在主要由细胞外高分子物质(系统)保护包裹微生物。建立更好的控制和消毒协议,说明生物膜的主要成分矩阵存在于牙髓学的感染是必需的。本研究的目的是描述的主要组件粪大肠,答:naeslundii和姐妹种生物膜矩阵通过拉曼光谱和激光共焦扫描显微镜(CSLM)技术。通过结晶紫生物膜的总生物量是量化分析,和monospecies生物膜生物量高于姊妹种生物膜。拉曼光谱和激光扫描共聚焦显微镜是用来识别的生化成分和生物膜的结构矩阵。光谱来自两个牙髓学的病原体的生物膜显示存在的碳水化合物,蛋白质,脂肪酸,和在所有样本中核酸;然而,这些生物分子的表达水平的变化使生物膜的光谱差异使用主成分分析。这项研究是第一次尝试识别monospecies的构成和姊妹种牙髓学的起源的生物膜。我们的数据提供了重要的方法对牙髓学的感染的分子动力学的理解。

1。介绍

微生物群的多样性持续性感染的牙髓学的非常有限,和革兰氏阳性兼性细菌通常是孤立的1,2]。粪肠球菌和放线菌种虫害代表物种的两个最常从标本分离的临床状况(2,3]。都有形成生物膜的能力,这给予它们的能力持续尽管恶劣的环境条件,如根管chemomechanical消毒,intracanal药物,甚至抗生素治疗(4]。

生物膜的发生在感染牙根和其他地方已经广泛报道;牙齿形态调查原发性或持续根尖牙周炎揭示了生物膜的存在不仅在主根管,而且在解剖变异包括横向运河,地峡,顶端的影响(5,6]。Extraradicular生物膜附着在根的外部表面的牙髓学的治疗失败也被描述(7,8]。

细菌生物膜是surface-associated社区产生各种各样的大分子。这些所谓的胞外聚合物物质(系统),如多糖、蛋白质、脂肪酸,和细胞外DNA(埃德娜)9),提供生物膜的结构和功能完整性的矩阵和也涉及在通信过程中,基因转移,营养,和细菌与环境之间的相互作用10,11]。每股收益的生产和类型是受不同因素的影响,如细菌物种,环境条件,营养可用性、粘附表面等。12]。这些因素的起源高多样性和多种类型的生物膜,这异质性是许多慢性病的发病机制的主要原因和危及生命的感染(13]。

由于生物膜矩阵差异很大,很多方法和技术可用于研究他们的超微结构和化学成分。显微技术如扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)、透射电子显微镜(TEM)和共焦激光扫描显微镜(样品形貌)中使用的方法来确定生物膜矩阵结构(14]。最近,CSLM已成为一个非常受欢迎的和有用的工具为原位生物膜的结构和检测评估矩阵组件使用不同的染色协议(15]。然而,化学CSLM所提供的信息可以是有限的,因为丢失的污渍和化合物之间的相互作用,也是一个昂贵的和高度耗时的技术。

拉曼显微镜,分子vibration-based光谱技术,是一个功能强大的分析工具,对生物材料的研究。它允许快速、原位、无损收购化学通过指纹谱的生成和结构信息。Ivleva et al ., Popp来说,同事,和其他研究小组采用拉曼光谱化学分析生物膜,浮游生物膜细胞的分化,歧视不同物种的生物膜中的细菌,和监控代谢特征在不同生理状态(16- - - - - -19]。

在牙髓学领域,一项研究使用拉曼光谱分析的化学成分粪大肠生物膜在不同生理状态矩阵组件根据不同生长阶段(20.]。这项研究提供了重要的信息monospecies生物膜组成;然而,根管感染显然是由monospecies姊妹种或multispecies生物膜(8,12,21),因此有必要研究monospecies和双重物种不同的根管细菌有关,特别是参与持续性根尖周的病态。数据造成这样的研究可能是一个有价值的贡献,建立一个新的理解和决心的策略来预防和消除生物膜根管系统。在这种背景下,本研究旨在结合拉曼光谱和共焦激光扫描显微技术获得生化成分从monospecies和姊妹种牙髓学的生物膜。

2。材料和方法

2.1。菌株和媒体

粪大肠和答:naeslundii菌株,从持续性感染的牙髓学的。样本在厌氧孵化室(85% N₂,10% H₂,5%的公司₂;腼腆的实验室产品,青草湖,美国MI)。识别使用特定琼脂媒体和API进行生化试验。确认执行身份和抗生素耐药性的VITEK - 2自动化系统(BioMerieux®,剑桥,妈,美国)。

2.2。生物膜化验

生物膜进行了化验基于先前报道的方法(22]。确认后应变纯度通过革兰氏染色法和菌落形态,一群每个菌株接种在10毫升的脑心浸液(BHI)和培养在一夜之间在37°C。monospecies悬浮的细胞密度是10⁹细胞/毫升(OD = 1,使用一个衡量法玛西亚LKB Ultrospec三世分光光度计)。混合微生物悬浮液制备无菌猎鹰管从平等的粪大肠和答:naeslundii悬浮液(OD = 1)的姊妹种生物膜生长。生物膜的形成,0.2毫升剂被转移到一家24-well聚苯乙烯细胞培养板(Sarstedt Inc .)、牛顿、数控、美国)含1.8毫升的嗨,和生物膜被种植在静态和厌氧条件下(85% N₂,10% H₂,5%的公司₂;腼腆的实验室产品公司,青草湖,美国MI)为14天。增长媒体取代了每隔一天去除死细胞,并提供营养。

通过CSLM每个样本的生物膜EPS可视化,玻璃盖玻片(美国马热费希尔科学、沃尔瑟姆)被置于24-well培养板和生长在一式三份。

2.3。生物膜的量化分析

monospecies和姊妹种生物膜的形成是量化使用结晶紫(CV)方法(23用细微的修改。粪大肠,答:naeslundii被种植在一夜之间被稀释1:100年BHI介质,对于每个细胞悬液,200µ我被转移到无菌平底的96孔聚苯乙烯板。姊妹种的生物膜,100年µL每个细胞悬液的添加/。固定厌氧孵化后37°C 14天,肉汤小心地吸气,然后与200年井清洗三次µL PBS和风干在室温下30分钟。与200年生物膜被染色µL 1%结晶紫,在室温下不断搅拌15分钟,再洗与PBS(三次),和结晶紫随着200年µL 95%的乙醇为10分钟。此后,光学密度(OD)以570海里(OD_570年使用微量滴定板)读者(Bio-Tek协同HT)。生物膜的质量表示为OD值570海里。实验重复三次。

2.4。EPS识别通过样品形貌

样品形貌是用于识别生物膜内的系统矩阵。孵化后14天,玻璃盖玻片和磷酸盐(PBS)洗两次。接下来,生物膜在染色孵化混合15分钟在黑暗。Calcofluor和propidium碘(Sigma-Aldrich有限公司圣路易斯,密苏里州,美国)是用作多糖荧光染色和埃德娜,分别。这后,生物膜在PBS清洗以去除多余的污渍。在生物膜完全干燥之前,安装中应用。共焦分析使用一个奥林巴斯U-TB190(100×)在油浸显微镜物镜。共焦图像的1024×1024像素是FV10-AV 03.01版本软件(奥林巴斯、日本)和组装使用Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems)。

2.5。生物膜EPS提取

生物膜系统提取如前所述[24用细微的修改。生物膜被刮从组织烧瓶中恢复过来(猎鹰细胞刮刀,康宁科学墨西哥、雷诺萨市的夯实。、墨西哥),悬浮在PBS(10毫升),转移到聚丙烯锥形管(BD)和涡1分钟。接下来,生物膜样品用在超声波浴(爱默生布兰森5800年,圣路易斯,密苏里州,美国)45分钟,其次是涡流2分钟,然后离心机(3500转;15分钟)(Sorvall传说X1R,热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。浮在表面的分数是0.2恢复和过滤µm Acrodisc®注射器过滤器,苏泊尔®膜(美国佛罗里达州笼罩在生命科学、迪兰)。

生物膜样品被转移到石英幻灯片10µL接种环。二氧化硅的抹干了20分钟。

2.6。光谱仪器和测量

拉曼光谱都是记录使用拉曼显微分光计(ProRaman-L Enwave达光电有限公司,欧文,CA,美国)。50×显微镜物镜(徕卡微系统公司,布法罗格罗夫,,美国),并使用45 - 50 mW样本兴奋的785纳米二极管激光器。收集到的拉曼信号的光谱区间600 - 1800厘米⁻¹;积分时间是40年代,光谱分辨率大约是2厘米⁻¹。记录生物膜的拉曼光谱,在每个涂片石英的幻灯片,焦点被选中,并围绕这个中心,为每个样本光谱收集在10分。

2.7。光谱预处理和分析

通过定制的拉曼光谱处理处理软件(25起源)和8.0 (OriginLab Corp .)、北安普敦,妈,美国)。每个第一次处理拉曼光谱使用中值滤波消除宇宙射线和噪音。光谱强度归一化到0 - 1任意单位的范围,和一个自动化的多项式基线校正方法应用。拉曼光谱是然后通过多变量分析技术,即主成分分析(PCA)和判别函数分析(DFA)。

3所示。结果与讨论

生物膜量化分析单一生物膜与姊妹种的生物膜。两个物种粪大肠和答:naeslundii有能力在实验条件下形成生物膜。用于分类的标准生物膜的形成能力的方法是基于以前的研究人员(26,27]。根据他们的说法,这两个物种可以归类为“生物膜成型机。“平均OD值570海里monospecies生物膜高于姊妹种生物膜(图的值1)。据报道,细菌生长同样monospecies模型中,轻微的降低可以预期这两个组件在姊妹种生物膜(28]。然而,最近的一项研究报告说,当革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌cocultured,姊妹种生物膜显示更高的价值比monospecies革兰氏阴性细菌的生物膜(29日]。基于这一事实可以解释不同的细菌可能存在信息相关性cocultured生物膜增长时,包括竞争、合作和营养可用性(28,30.]。

我们的研究结果表明主要的生物分子的存在,以前称为组件的EPS生物膜矩阵(11]。此外,基于拉曼强度的乐队,我们能够描述EPS作为主要由蛋白质组成的一部分,与饱和脂肪酸和多糖发生在一个相对较小的比例,和一个小核酸组件。这种成分反映了成熟的生物膜的特征如前所报道其他作者(20.,31日,32]。在另一个拉曼光谱研究中,黄等人发现我地区的酰胺是更强烈的固定相的对数期(33]。刘等人报道,核酸和蛋白质的变化反映的生理状态粪大肠生物膜(20.]。

在过去,多糖被认为是几乎唯一的细胞外基质的结构组件,直到进一步的研究阐明的另一个重要结构的生物分子,埃德娜(33]。因此,在目前的研究中,这两个组件都通过样品形貌特征。Calcofluor是用于执行多糖染色,propidium碘对埃德娜染色。样品形貌图像显示多糖团的存在和埃德娜纤维生物膜组件的矩阵。蘑菇形的结构和水通道,成熟的生物膜的特性,也确定了34]。有人提出,埃德娜可以扮演不同的角色:首先,作为一个adhesin在生物膜形成的早期阶段,其次,作为一个成熟的生物膜的结构组件(35- - - - - -37]。图2显示CSLM开发生物膜的图像在一个成熟的阶段,多糖的存在和埃德娜作为EPS矩阵组件被观察到。

尽管相似光谱的不同的生物膜,这一事实都是革兰氏阳性细菌,PCA-DFA正则图的三个生物膜的拉曼光谱剖面数据表明粪大肠,答:naeslundii,姊妹种生物膜与不同的生化成分;细胞外基质交叉验证的值是95.1%。光谱波段的光谱差异主要有注意到约1270 - 1335厘米⁻¹和1000 - 1125厘米⁻¹/ 800 - 980厘米⁻¹被分配到蛋白质和多糖生物分子,分别为(数字3(一个)和3 (b))。

在先前的研究中,我们发现,生化组成生物膜在这些物种变化很大monospecies双重物种(38]。多糖的主要部分,蛋白质和脂肪酸被确认在monospecies生物膜相比姊妹种生物膜(38]。这些结果表明,这两个物种在生化水平相互影响,并进一步数据支持这两个牙髓学的病原体之间的协同作用[39]。

图3 (b)显示了系统的拉曼光谱中提取的三个样品。拉曼乐队被分配根据以往的研究和解释(15,17,40,41]。主要的生物分子的官能团鉴定(图4)。乐队在该地区的790 - 950厘米⁻¹可以归因于侧基变形(CCH寇,OCH) biofilm-specific多糖(15]。拉曼光谱的EPS分数三个生物膜样品显示这个地区的变化;的粪大肠光谱尤为不同。生物膜多糖成分可以有很大区别,这主要是由基因档案和环境等因素的经济增长状况。在革兰氏阳性细胞的存在和化学结构许多rhamnose-containing细胞壁多糖(RhaCWP)已经知道了几十年。观察到的乐队在880 - 980,1055,1075厘米⁻¹可以初步分配到振动模式的鼠李糖、半乳糖和葡萄糖(40]。先前的研究已经报道这些糖类的存在的一部分粪大肠以及放线菌spp。42- - - - - -44]。

乐队在1075 - 1125厘米⁻¹可以分配给地区碳碳和氮伸缩振动的贡献15,18,19]。酰胺(1640 - 1680厘米⁻¹伸缩振动的C = O)和酰胺三世(1250厘米⁻¹,与氮拉伸和弯曲- h)乐队中发现三个生物膜的光谱;然而,乐队的强度之间存在着显著的差异。的答:naeslundii光谱显示出强烈的乐队1300厘米左右⁻¹(酰胺III),但这也被分配到色氨酸的氨基酸侧链模式。它已经表明,蛋白质导致生物膜的初始粘附和稳定矩阵(44]。因此,有可能乐队相关的蛋白质可以代表凝集素和amyloid-like蛋白质,一群蛋白质已确定在许多物种与生物膜的形成44- - - - - -46]。这些分子可以识别碳水化合物在生物膜矩阵,促进细胞间的沟通。拉曼光谱的冻干凝集素表现出一些乐队在不同的位置,例如,周围的1667厘米⁻¹和1236厘米⁻¹,分别在酰胺我和酰胺三世乐队(47]。淀粉体参与生物膜矩阵的构建和稳定。“淀粉”一词描述β-sheet-rich蛋白质总量,主要表现出拉曼乐队在酰胺我(1665 - 1680厘米⁻¹)和酰胺三世(1246 - 1270厘米⁻¹)地区47,48]。所有这些乐队在EPS样本观察分析了在目前的研究中。

自2002年以来,埃德娜的功能作用建立了生物膜的形成和结构完整性(36],乐队由DNA链的存在已经在先前的研究报道在生物膜20.]。我们的研究结果揭示了存在的小乐队大约在728年,780年,785厘米⁻¹分配到腺嘌呤,胞嘧啶,和尿嘧啶(15]。此外,一个乐队在1575厘米⁻¹鸟嘌呤和腺嘌呤环拉伸的特点(17]在我们所有的EPS样品确认。

最独特的脂质膜的拉曼光谱特性有关的烃链,和脂质,可以观察到在以下区域:1500 - 1400,1300 - 1250,和1200 - 1050厘米⁻¹,这是在指纹区(49]。在目前的研究中,乐队大约1445和1500厘米⁻¹分配给剪切振动的CH₂组确认。此外,拉曼乐队在1300厘米⁻¹,归因于CH的扭转振动₃集团特别强烈的光谱棕榈酸(49]。脂肪酸的存在已经被报道在细菌生物膜,尤其是饱和脂肪酸(15,18,26]。此外,在脂肪酸的初始口腔生物膜、软脂酸(16:0),硬脂(18:0),十八烯(18:1 n9c), erucic (22: 1 n9c)酸被发现50]。这些脂肪酸有强烈的乐队在1400 - 1500厘米⁻¹地区由于CH₂/ CH₃变形模式,类似于乐队中发现我们的研究(15,51]。

4所示。结论

作为一个初步研究,我们的研究结果显示,波形变化证实分析生物膜的化学成分的差异,尽管更多的数据显然是生长在生物膜分子组成上所需生物表面包括牙质或羟磷灰石。这是检查的代谢活动感兴趣的细菌生物膜的成熟过程中,尤其是在混合种群种间相互作用表现出不同的化学行为(29日,38]。

拉曼光谱和CSLM技术允许monospecies的生化和结构表征和姊妹种生物膜矩阵。我们的研究结果提供有价值的信息对每股收益矩阵组件相关biofilm-forming牙髓学的细菌,阐明在微生物群落的多样性和复杂性。这些数据代表了第一种方法,还需要进一步的研究来证实和清楚地识别EPS组件在这项研究中,我们初步确认。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

研究机构的伦理委员会批准的圣路易斯波多西大学牙科学院墨西哥圣路易斯波多西(批准代码cei - fe - 011 - 014)。

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