文摘
先进的荧光分析在广泛的激发波长从230年到510海里伴随着色谱法是用于研究自然发色团的溶解有机物(CDOM)从三个淡水卡累利阿湖泊。激发波长的影响(λ前女友)荧光量子产率和发射最大的位置确定。CDOM荧光量子产率达到最小λ前女友∼270 - 280 nm和最大值λ前女友∼340 - 360 nm。这是单调递减后370海里向长波长激发。分析反相高效液相色谱法与多波长荧光检测器的分布特征荧光团之间的亲水/疏水性CDOM的部分。这项技术显示“隐藏”蛋白质像荧光团CDOM分数,尽管缺乏蛋白质像荧光在最初CDOM样本。humic-like荧光有亲水和疏水CDOM色谱峰,和它的强度是随着山峰的疏水性降低。相反,蛋白质像荧光被发现只有在疏水性山峰,山峰及其强度在不断增加的疏水性。这项工作提供了新的数据CDOM光学特性一致的形成超分子组装由协会低分了大小的组件。此外,这些数据是很有用的对于理解CDOM功能环境。
1。介绍
载色体的溶解有机物(CDOM)天然彩色,并包含所有水生环境中不同分子大小的材料(MSs)。这些化学复杂化合物的不规则结构施加理化性质的水,影响吸附能力,和控制交通污染物在不同环境中。CDOM吸收光的紫外线和短波可见光范围,从而控制淡水和海洋水生生态系统的光学特性的光谱质量直接影响水下光场。因为它的紫外吸光度,它可以保护水生生物受到紫外线辐射(1]。
在紫外光照射下荧光的发射率的一个主要水生CDOM的属性,让其快速和高度敏感的分析(2- - - - - -8]。荧光测量提供基本信息水生CDOM的化学结构,需要小样本数量。它也可以应用在遥感利用激光雷达系统对CDOM荧光检测从船上或飞机。目前正在接受,水生CDOM的荧光主要由两个乐队,所谓的蛋白质像和humic-like荧光主要来自两组荧光团(2,3]。蛋白质像荧光体通常有一个激发和发射极大值低于305和380海里,分别。另一组对应于humic-like荧光团和显示发射波长范围380 - 600 nm在激发波长范围内230 - 550 nm。以及改变激发波长(λ前女友)从270年到310海里,humic-like排放最大转向更短的波长。这种转变的最大排放随着激发波长被命名为“蓝移”4]。这一现象被描述为各种类型的自然水域(5- - - - - -8转换期间]和腐殖质物质引起的微观真菌(9]。
СDOM一直是一个对象的荧光量子产率的一些研究发现它可能随激发波长(7,10,11]。其价值观在离散波长激发下270年,310年和355年纳米测量的分数不同的海量存储系统(MSs)中获得的过滤纳米孔径膜在河边的CDOM[5日5,6)和各种淡水和海洋样品(7]。Low-MS分数(< 5 nm)展示了高荧光量子产率相比,high-MS分数(> 5海里)。荧光量子产率被发现本质上依赖与增加其价值随着激发波长激发波长从270上升到355海里。水生CDOM对比,陆地胡敏酸和工业腐殖质准备显示荧光量子产率低,价值实际上并不取决于激发波长范围内的改变270 - 355 nm (7,12]。然而,直到现在,水生CDOM的荧光团的化学结构仍然不清楚。然而,清除荧光物种不同结构的化合物之间的定位应该是非常有用的理解СDOM荧光的起源及其在水生环境中运作。
目前的工作是针对荧光测量中广泛的激发波长从230年到510年纳米荧光量子产率的估计。我们使用了反相高效液相色谱法(rp)在线多波长吸光度和荧光检测分析蛋白质像humic-like荧光团CDOM的几个俄罗斯北部的湖泊,目的是推广荧光分布之间的亲水/疏水部分CDOM的淡水湖泊。
2。材料和方法
2.1。CDOM样品制备
地表水的样本被探险期间(2013年8月)在一些淡水湖位于卡累利阿共和国,北部的俄罗斯的欧洲部分。Onego湖是欧洲第二大淡水的身体。近年来,人类对生态系统的影响Onego湖增加了,特别是在中国西北地区,几个工业区。的两个小ultrafresh湖泊沼泽起源、Verhnee Vodoprovodnoe,远离工业设施和可以作为CDOM的来源没有人为的负载。水样本储存在密封的塑料瓶在黑暗中+ 4°C。100毫升的原始淡水样本过滤使用纤维素过滤器(微孔)的孔隙大小为0.45μm。50毫升每个过滤的自然水样本冷冻乾和溶解在1.5 - 3毫升10毫米磷酸盐缓冲剂(pH值6.5)由混合三卷10毫米Na2HPO4解决方案(pH值9.8)和10毫米不七卷2阿宝4解决方案(pH值4.5)。cdom的集中库存解决方案是存储在黑暗的玻璃小瓶+ 4°C前进一步的光谱和色谱分析。
2.2。紫外吸收和荧光发射光谱
吸收光谱原始湖的水,过滤样品和CDOM溶解在磷酸缓冲测量与光学路径1厘米或石英试管3厘米使用紫外可见分光光度计波长范围内太阳能pb - 2201(白俄罗斯)200 - 900 nm。3 cm-cell是用来测量吸光度光谱中的可见光范围的更准确。为进一步应用,吸光度都是1厘米。
CDOM的荧光发射光谱样本记录在1厘米标准石英试管使用卡里Eclipse荧光分光光度计(美国瓦里安)在不同激发波长从230年到510年的间隔10 nm的发射范围内200 - 700 nm。为了最小化inner-filter效果,所有样本稀释0.1毫米磷酸盐缓冲剂(pH值6.5)达到0.05 270海里的吸光度。
2.3。荧光量子产率测量
荧光量子产率测量的方法参考化合物早些时候申请CDOM的自然水的样本和商业腐殖质的准备工作(6,7,12]。作为标准参考化合物在水0.05Н硫酸奎宁2所以4解决方案是使用,因为它类似于水生腐殖质物质发射光谱的形状与排放最大值450海里。硫酸奎宁的荧光量子产率是众所周知的和等于0.546或54.6%在350海里(激发下13]。获得一个校准曲线,硫酸奎宁的荧光光谱测定λ前女友3·10 = 350 nm和浓度−75·10−7和7·10−7M。
2.4。分析反相高效液相色谱法(rp)
CDOM样品溶解在10毫米磷酸缓冲分析使用一个ACQUITY™超高效液相色谱系统(水Corp .,米尔福德,妈,美国)分析反相C18柱(UPLC©本·C18, 2.1×100毫米,粒径1.7µ米,水域Corp .)、美国)作为固定相。色谱过程的细节描述的是(14,15]。产物的荧光色谱监控使用Acquity荧光检测器(FLR)λ前女友= 270 nm和发射波长范围300 - 600 nm。的色谱在线分析了发射检测在330和450海里检测蛋白质像和humic-like荧光在同一色谱运行。洗脱率为0.3毫升/分钟。甲醇和10毫米磷酸盐缓冲剂(pH值6.5)被用来形成一个逐步梯度。每个产物的荧光光谱色谱峰的顶端从数据中提取的FLR探测器。
3所示。结果与讨论
3.1。紫外可见吸收光谱
每个原始的光谱吸收和过滤淡水样品相似,表明低水平的有机物质悬浮形式呈现在原始自然水(图1)。所有原始水和过滤吸收光谱样本无特色的单调下降与波长从200增加到与肩长波长位于约260 - 290 nm。CDOM的内容在湖里Vodoprovodnoe两倍高于另外两个湖泊。不同的吸收光谱曲线的斜率。吸光度比例在230和350海里(A230 / A350)是作为一个定量斜率测量。这个比例是用于演示的内容本质区别脂肪族债券С-СС-Н,С-ОCDOM的湖泊调查。A230 / A350比率的最高价值是注意到的CDOM Onego湖(6.70),并大大减少(4.77和5.44)湖泊Vodoprovodnoe Verhnee,分别。这意味着Onego CDOM的湖是富含脂肪族化合物比其他两个湖泊。
3.2。荧光光谱和Humic-Like荧光发射最大激发波长的函数
CDOM的发射光谱从三个卡累利阿湖泊兴奋在波长从230年到510海里呈现在图2减法后的空白在每个激发波长发射。我们观察到humic-like荧光在所有CDOM的样本。230 - 280 nm,激发地区CDOM表现出广泛humic-like乐队从425年到450海里排放最大值和蛋白质像荧光作为肩膀周围330海里。蛋白质像发射的强度较高,感到兴奋λ前女友230、270和280海里。蛋白质像之间的比例和humic-like排放强度是最高的Onego CDOM湖和更少的另外两个样品。
(一)
(b)
(c)
样品的荧光光谱研究了CDOM humic-like湖泊体现一个连续的红移的排放和增加最大λ前女友从310年到510纳米(图3CDOM的),这是一种常见的特征从河流和沿海利润率接收地面输入(16,17]。此外,所有研究CDOM样本显示,红移humic-like发射最大的增加λ前女友从230年到270 - 280纳米,在激励范围内没有之前的其他研究人员分析。所谓的“蓝移”被观察到的改变λ前女友从270年到310海里,这是典型的对自然水(5- - - - - -7]。我们没有找到任何信息发表在科学文献关于激发发射波长的依赖CDOM的淡水湖激发范围230 - 510纳米,所以我们相信我们的结果是第一个报告。
3.3。荧光量子产率作为激发波长的函数
CDOM的荧光量子产率值三个淡水湖显示nonmonotonous依赖的变化λ前女友从230年到510纳米(图4)。所有的样品荧光量子产量最高(2.3 -3.4%)获得λ前女友340 - 360 nm左右。后增加λ前女友从370年到510海里,量子产率值单调下降,表明肩膀在380 - 410和420 - 470海里。从λ前女友230 - 270 - 280 nm,量子产率值下降到1.2 - -1.7%,增加到最大在340 - 360海里。应该注意到局部最小值中检测出类似的激发波长范围(270 - 290海里),在最重要的“蓝移”被发现。这种依赖与我们之前协议的测量量子产率值沿海表层海水的喀拉海激发区域250 - 550 nm (8]。
荧光量子产率测量有时被用来描述水生CDOM的海洋,河流,或者沿海起源。依赖关系的整体形状的荧光量子产率在不同激发波长被发现类似CDOM样本:最大激发波长的荧光效率得到在340到380纳米之间。在[17),荧光量子产率在激发波长的依赖是用作证据的存在地面材料在自然水域跨赤道大西洋。荧光量子产率从280 nm增加到最大值在370 - 380纳米范围从1.8到2.5%,减少单调。CDOM的荧光量子产率从南佛罗里达海域,亚马逊,Tamiami河流和富啡酸隔绝萨旺尼河河是由绿色和测量Blough [18]。在调查进行水样从赤道大西洋19),成立激发波长375纳米以上,减少的荧光量子产率降低λ前女友和排放最大不断转移到红色。此外,最大值∼340海里观察CDOM的网站受到刚果河羽流的影响。荧光量子产率的类似行为CDOM的深度和地表水的挪威海最大值340至380海里被温斯迟等报道。20.]。全部,我们的数据与其他研究证实。然而,我们的研究结果提出了激发依赖CDOM荧光量子产率的波长范围280纳米以下首次CDOM淡水湖泊。这是很重要的,因为周围的荧光量子产率最小励磁280海里被发现。此外,它是有价值的进一步的解释CDOM荧光的起源,因为它是相同的激发光谱范围的蓝移CDOM荧光发射通常观察到。
3.4。反相高效液相色谱法(rp)与在线吸光度和荧光检测
逐步形成梯度的rp使用甲醇和水磷酸盐缓冲剂给地图CDOM的可能性分布的亲水/疏水生色团。在线色谱与吸光度检测解决六峰具有不同疏水性质。疏水性的山峰从第一个到最后一个筛选了峰值增加由于甲醇浓度的增加逐步分离过程。在我们之前的研究21),我们发现,最高的亲水部分内容从Onego CDOM的湖。在这个研究中,我们已经证实这一发现对所有研究湖泊的注册在线荧光(图5)。的荧光检测λ前女友= 270海里表明CDOM在所有三个湖泊包含humic-like荧光团,发射的最大值取决于亲水/疏水性质。最密集的humic-like荧光发射最大值420海里第一亲水峰被发现在所有三个样品。随着增加色谱分数的疏水性,humic-like在30 nm向长波长荧光最大转移。所以rp -揭示的存在至少两个humic-like荧光团与不同发射最大值(420或450海里)取决于其疏水性。荧光测量了不仅humic-like荧光蛋白质像荧光。荧光团发射最大值在345纳米左右被发现在大多数疏水性CDOM的分数。最高的振幅CDOM蛋白质像荧光检测的色谱峰# Onego湖(图4 - 65 (b)和5 (d)CDOM的),而其他两个湖泊沼泽原产地的蛋白质像荧光团中发现了微量的山峰# 5 - 6只比humic-like荧光团(数字5(一个)和5 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。“隐藏”的观察荧光体发光蛋白质像荧光
产物的应用显示“隐藏”蛋白质像荧光团在疏水性CDOM峰值。荧光量子产率的局部最小值依赖激发波长为淡水CDOM被发现λ前女友∼270 - 280 nm, CDOM荧光发射的“蓝移”也通常观察到(5- - - - - -7]。相反,rp与在线荧光检测显示,密集humic-like荧光被发现在所有的亲水和疏水色谱峰(图5)。应该强调,蛋白质像荧光强度与峰值的增加增加疏水性,而humic-like荧光下降。这种效应更加明显在Onego CDOM湖(数字5 (b)和5 (d))。高疏水的“隐藏”蛋白质像荧光团(即。,fluorophores clearly detected by RP-HPLC but not so obviously visible in the original CDOM fluorescence spectra before fractionation) is one of the reasons of humic-like fluorescence quenching. We believe that the minimal CDOM fluorescence quantum yield observed atλ前女友∼270 - 280 nm可能造成部分光吸收发色团的组织类似于芳香族氨基酸,短肽或蛋白质,从而导致减少humic-like荧光兴奋在这个波长范围。
4所示。结论
荧光性质的自然CDOM从三个卡累利阿淡水湖激发波长范围内进行230 - 510 nm,的影响λ前女友荧光量子产率和发射波长最大的决心。对所有研究CDOM样本,观察humic-like荧光的“蓝移”λ前女友从270年到310海里。相反,一个连续的“红移”排放最大随着激发波长被观察到λ前女友从230年到270年,≥310 nm。CDOM荧光量子产率的下降从激发在230 nm,显示最低在270 - 280海里,然后达到一个最大值340 - 360海里,向长波长激发进一步降低。这些结果,首次证明了荧光量子产率的激发波长依赖性激发光谱范围的280纳米以下淡水CDOM。产物分析与多波长荧光和吸光度探测器是用来描述CDOM分布在淡水湖泊和确定荧光团之间的亲水/疏水性CDOM的部分。发现密集humic-like荧光亲水和疏水色谱峰,而只在最疏水蛋白质像荧光检测峰值;蛋白质像荧光强度增加而增加的山峰的疏水性,而humic-like荧光下降。这些结果都符合CDOM分子形成超分子组装,可能由协会低分了大小的组件。humic-like的分布以及蛋白质像荧光团CDOM内提供详细的信息,可以帮助更好地跟踪CDOM的起源及其生物地球化学环境中转换。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者表达他们的感谢Elena Krasnova博士,他在博士Voronov, Igor Glushko教授的热情帮助水取样和卓有成效的讨论。作者感谢员工和管理n a Pertzov白海生物站的罗蒙诺索夫莫斯科国立大学为他们的支持在这个领域的工作。这项工作是财务支持的俄罗斯基础研究基金会(RFBR)(批准号18-016-00078)。