四个荷花代表品种莲心中黄酮类化合物的定量分析与比较

抽象的

从四个代表性莲品种在莲幼芽中的类黄酮已使用加上紫外线检测器和电喷雾电离三重四极杆质谱高效液相色谱法进行分析。通过这种方式，十六黄酮类化合物成功地测量和四个品种间比较。虽然从这些4个品种中检测到类似的类黄酮的组合物，它们的类黄酮含量显著不同。简历。Bailian from Guangchang was detected to have the most total flavonoid content, that is, 1595.86 mg/100 g, followed by cv. Xuanlian from Wuyi (1553.49 mg/100 g), cv. Xianglian from Xiangtan (1173.07 mg/100 g), and cv. Jianlian from Jianning (930.08 mg/100 g). However, similar percentages of flavonoidC在总类黄酮-glycosides被发现的4个品种，这是80.83％为CV。白莲，为CV 80.91％。香莲，为CV 79.25％。易建联和CV 78.53％。Xuanlian。这项工作将是质量保证和控制，以从不同的起源约黄酮定性和定量信息方面的莲花胚芽是非常有用的。这也将是莲花胚芽高黄酮含量，这是最好的筛选特别关注的是由于食品和制药行业的广泛的潜在应用。

1.介绍

Nenumbo莲是一种宝贵的水生经济植物，广泛分布于中国[1]. 它有600多个品种[2]分布在湖南的四个代表性品种（cv。江西湘莲（cv。浙江白莲（cv。宣连）和福建（cv。建联是中国历史上最著名的四个栽培品种。所有组织Nenumbo莲可作为普通食品或传统药物使用;因此，它被称为“宝库”[3.那4.］．莲花羽毛，也称为连氮，是莲子的绿色种子胚。成熟莲心有苦味，被《中国药典》（2010年版）记载为中药。莲花胚芽也被中国卫生部批准作为药用和食用植物用于双重用途[5.］．具有重要的药用价值，可用于治疗心热、高血压、高热[6.］．它也可以用来作为保健食品。在中国南方，莲花胚芽已经喝得烂醉如泥，用沸水冲泡茶叶。肖[7.]开发出一种由莲花纲板组成的健康饮料菊花近年来。荷花胚芽与绿茶等物质一起发展成为茶饮料。随着越来越多的莲子衍生产品进入市场，对莲子原料的需求也越来越大。因此，对莲子的原料和衍生产品的质量保证和控制是非常必要的，特别是莲子的天然植物化学成分和生物活性成分，不同地区的莲子品种可能存在差异。众所周知，植物的化学成分和生物活性与遗传品系和环境因子(如日晒、温度、降水等)密切相关[8.那9.］．例如，黄酮醇的生物合成是由日光曝晒的刺激，和黄酮醇的手段高抗氧化效能，从而更加生物活性[含量增加10那11］．

据报道，荷花胚芽中的生物碱和黄酮类化合物与多糖一起是荷花胚芽中两种主要的生物活性物质。莲心中的生物碱主要有莲心碱、莲心碱和异莲心碱[12]. 早期研究表明，这些生物碱的生物活性包括抗高血压、降血糖和抗人类免疫缺陷等作用[13那14]. 与生物碱相比，关于荷花胚芽中黄酮类化合物的成分和药理特性的研究非常有限。近年来，Li等人[15]确定了八个类黄酮C- 糖苷和一种黄酮类化合物O.在糖苷莲心首次。与生物碱相比，陈等人。[16]和Li等。[15]发现莲子芽中总黄酮的含量要高得多。近年来，Zhu等人[17.]和Feng等。[14[据报道，莲花羽毛中的黄酮表现出抗氧化活性的良好潜力。因此，在莲花羽毛中选择黄酮类化合物作为质量保证和控制目的的主要植物化学组件，因此更有利和实用。据我们所知，尚未评估从不同品种和不同地区获得的莲花绒毛的黄酮类化合物的总含量和单个含量。在这项研究中，我们评估了四种代表品种的莲花纲，来自四个不同的地区收集的莲花，宣莲，宣莲，湘莲，湘轴。通过将大孔树脂色谱法与高性能液相色谱（MPRC-HPLC）方法相结合来确定它们的总和各种含量，该方法是为同时富集和分析来自莲花叶的黄酮类化合物，最近[18.］．由于以下原因，这将是关键重要性。一方面，对于质量保证和来自不同起源的莲花纲的控制目的可能非常有用。另一方面，它还可以用于筛选具有高黄酮含量的最佳品种，用于更好，更广泛的培养和应用。

2。材料和方法

2．1.材料，化学品和试剂

江西，湖南，福建和浙江是生产莲花纲的四个代表地。江西省广州（GC，116°35'e，26°84'n）的莲花纲，称为简历。巴利安，购自商业来源。另外三个样本，称为CV。香莲，简介。建莲和简历。宣莲是在湖南省湘潭（XT，112°93'e，27°90'n），福建省建宁（JN，116°84'e，26°83'o）和武义（WY，119°81'e，28°90'n）分别在浙江省。这些样品被从他们的本地地区收集，并由分类师授权广湾胡锦涛教授从植物种质增强和中国科学院专业农业的重点实验室。将原料粉碎并在干燥，暗和闭合状态下储存直至使用。 Standards of apigenin-6-C-glucosyl-8 -C-Alabinoside（Schaftoside），Apigenin-6-C-arabinosyl-8 -C葡糖苷（异夏佛塔），槲皮素-3-O.- 葡糖苷（罗布麻）从通天河同田生物技术有限公司（上海，中国）获得。芦丁是从J＆K科学有限公司（北京，中国）。上述四个标准均为95％的纯度。他们在4℃下储存在冰箱中。乙腈HPLC和MS是的LC级和从Fisher（匹兹堡，PA，USA）;甲酸（99％）是含有LC-级和从ROE（ROE科学，美国）;和去离子水使用EPED水净化系统（中国南京）制备。

2.2。仪器及色谱条件

用HPLC-UV的方法在热处理1250 HPLC系统（Thermo Fisher Scientific，CA，USA）上进行了类黄酮的方法，包括自动进样器，1250泵，真空脱气剂和UV / VI探测器。等分试样10 μ.L被注射到HPLC系统并分析。在韦尔奇终极XB-C18柱上进行色谱分离（150mm×2.1mm，5 μ.m）。流动相系统由含有0.5％甲酸（A）和乙腈的水由0.1％甲酸（B）组成。流速以0.3ml / min的流速梯度洗脱如下：0-10分钟，12％b;10-42分钟，从12％到20％b;42-52分钟，从20％到30％b;和52.1-55分钟为12％B.选择350nm的波长，并在优化后在30℃下设定柱温。在从UV获得的峰面积上计算类黄酮含量并通过标准校准。

对于黄酮类化合物的鉴定，采用thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA的thermo Fisher Scientific的thermo 600高效液相色谱系统(thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)进行HPLC-MS/MS分析，该系统包括一个自动采样器，一个600泵，一个UV/Vis检测器与一个电喷雾电离三重四极杆质谱分析仪(thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, CA, USA)。在负离子(NI)模式下传导。信用证条件与上述相同。其他主要参数如下:喷淋电压3000 V;蒸发器温度、300°C;鞘气体(N₂)压力，40个任意单位；辅助气体压力，10个任意单位；毛细管温度，350℃；碰撞能量，15 v和扫描范围，m/Z.150-1000。

2.3。标准解决方案的制备

将四种标准品分别准确称量并溶于甲醇中，使其浓度分别达到1 mg/mL。将四种原液混合，用甲醇/水(50:50，V. : V.）到七种不同的浓度。在HPLC分析之前，将每个工作溶液以8000rpm离心5分钟，用离心机5180r（Eppendorf，德国）。

2.4. 样品溶液的制备

称作Zhu等人。[18.]with some minor modifications, 20 g of dried powders of lotus plumule was ultrasonically extracted with 200 mL of 70% ethanol for 40 min and then the extracts were filtered with filter paper. The residues were re-extracted twice and filtered. The combined solution was evaporated to dryness under reduced pressure at 50°C using a rotary evaporator RE-52AA (Shanghai, China). Then, part of the resultant residues were loaded to a macroporous resin column with adsorption resin D101 (Nan Kai University, Tianjin) to further enrich and purify the flavonoids of interest. The loaded column was eluted successively with 1000 mL of water and 30%, 50%, 70%, and 90% ethanol. Each fraction was evaporated to almost dryness except for the water part. All parts were dissolved with 50 mL of methanol and then centrifuged at 8000 rpm for 8 min. The supernatants were transferred to a 50 mL volumetric flask and diluted with methanol/water (50 : 50,V. : V.）HPLC分析前用合适的浓度。

3.结果与讨论

3．1.LC条件的优化

色谱分离条件被称为zhu等。[18.]和陈等人。[16提出了一些修改以实现更快，更好的分离。来自XT（湖南湘潭）的莲花纲，用于优化色谱条件。发现甲酸作为添加剂的浓度对类黄酮的分离具有重要影响，并且根据Chen等人的优化条件选择相同的甲酸。[16］．Subsequently, the flow rate (0.2 mL/min, 0.3 mL/min) and column temperature (25°C, 30°C, and 35°C) were investigated. In case of the effects of flow rate, there were no differences on the separation of flavonoids, but the required analysis time was around five minutes shorter at the flow rate of 0.3 mL/min than of 0.2 mL/min as shown in Figure1（a和b）。就柱温而言，通过将不同温度的LC色谱图进行比较0.3ml / min的流速，发现30℃以实现更好的分辨率和峰形，而不是图中所示的其他两个条件1（c到e）。结果，在以下研究中使用含有0.5％甲酸，含有0.1％甲酸的乙腈，含有0.1％的甲酸，流速，以及温度为30℃。

3.2。方法验证

在浓度梯度下三份测试工作溶液。四个标准的校准曲线都显示在浓度范围内的良好线性度（ ). 检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别根据信噪比3和10计算[19.那20.］．表中显示了四种标准的回归方程，LOD和LOQ（即，isoschaftoside，脱脂剂，芦丁和异喹硫序）1。

为了确定该方法的精密度，对三种独立的样品溶液(来自XT的样品)进行了分析。13个峰的峰面积相对标准偏差(RSD)为0.58% ~ 4.1%，表明该方法具有较高的精密度。样品溶液的稳定性通过分析相同的样品溶液(来自XT的样品)在0、4、8、12和24 h。峰面积的RSD值在0.42% ~ 6.6%之间，表明该样品溶液稳定。采用回收率试验评价定量的准确性，即在试验样品中添加芦丁浓度为80%、100%和120%的三种不同浓度的芦丁，以比较试验样品中芦丁的原始浓度。上述方法提取并纯化了三种黄酮类化合物含量已知的荷花胚芽样品。每种浓度进行三次重复试验。低浓度、中浓度和高浓度的回收率平均值分别为82.11%、83.91%和83.05%，均可接受。

３．３．莲子芽中黄酮类化合物的鉴定

黄酮类动物O.-glycosides和C-glycosides可以通过LC-MS / MS的方式加以区分。类黄酮O.- 半血糖的糖苷，异解裂解O.-C化学键的形成往往伴随着糖基的丧失。为类黄酮C- 糖苷，糖部分的横圆切割是常见的特征离子[M-H-150]⁻（^{0 1}X），[M-H-120]⁻（^0，2X),(90−−H)⁻（^{0, 3}X）为己糖替代[21.]. 本研究通过比较保留时间和MS/MS数据与相应标准品或报告参考文献中的数据来鉴定黄酮类化合物。表中列出了NI模式下的MS/MS数据2。

3.3.1。识别类黄酮O.配糖体

黄酮类化合物的鉴定O.-糖苷的质谱/质谱是容易的，因为糖苷元的糖基在光谱中直接丢失。这样，七类黄酮就出来了O.-glycosides检测，并在此研究中确定。全分离是困难的，因为一些类黄酮化合物的相似的极性来实现。李等人。[15]used a mobile phase system of water containing 10% formic acid and formic acid-acetonitrile-water (10 : 40 : 50,V. : V. : V.)分离黄酮类化合物，但不能同时分离两个峰。与之前的研究相似，本研究的第3峰和第7峰经LC-MS/MS鉴定，分别含有2个和3个化合物。峰7显示两个[M−H]⁻离子at.m/Z.609和m/Z.463在NI模式下。前者产生的片段离子在m/Z.300 [Y._0.-1]⁻和m/Z.301 [Y._0.]⁻推测可能是槲皮素的衍生物，初步鉴定为槲皮素-3-O.-芦丁苷(芦丁)在以前的文章中报道[22.]. 同样地，[M−H]⁻离子at.m/Z.463根也产生碎片离子在m/Z.300 [Y._0.-1]⁻和m/Z.301 [Y._0.]⁻表明槲皮素已被己糖取代，鉴定为槲皮素-3-O.半乳糖苷（金丝桃）。峰8表现出相同的[M-H]⁻离子at.m/Z.463和碎片离子m/Z.300 [Y._0.-1]⁻和m/Z.301 [Y._0.]⁻与金丝桃苷相结合，可鉴定为槲皮素-3-O.根据它们的保留时间葡萄糖苷（异槲皮苷）。金丝桃和异槲皮苷的上述鉴定也可以通过LC-MS谱与可信标准比较证实（图2C）。

峰值10和11表现出相同的[M-H]⁻离子at.m/Z.593和碎片离子在m/Z.285 (Y_0.]⁻，表明它们是同分异构体。离子atm/Z.285 (Y_0.]⁻，由于中性损失308 Da从[M - H]⁻离子，表示，它们可能是木犀草素或山奈酚与二糖取代的衍生物。片段离子在m/Z.447在第10峰(8%)比第11峰(8%)更明显，说明在第10峰推断为新桔糖，在第11峰推断为芸香糖。第10峰为木犀草素-7-O.通过用从莲胚芽中分离的纯化合物比较其LC-MS -neohesperidoside（图2b），虽然峰值11暂时被识别为叶黄素-7-O.-rutinoside根据先前的报道[15］．峰12显示[M−H]⁻在离子m/Z.623时产生离子m/Z.315 [Y_0.]⁻和m/Z.314 [Y_0.-1]⁻，结果是损失了308da，这表明它可能是O.- Isorhamnetin的尼替糖苷。峰12也进一步鉴定为Isorhamnetin-3-O.-通过将其LC-MS与从荷花胚芽中分离的纯化合物进行比较，得到芸香苷（图2a). 13峰显示[M−H]⁻离子at.m/Z.607，与峰12的裂解途径相同，导致产物离子在m/Z.299 [Y_0.]⁻。因此被鉴定为diosmetin-7-O.-rutinoside(地奥司明)。

3.3.2. 黄酮类化合物的鉴定C配糖体

黄酮类化合物的鉴定C-苷类化合物比黄酮类化合物复杂O.-由于不同的质谱裂解途径而产生的糖苷类。在此，9-黄酮类化合物C-糖苷的检测和鉴定。3种化合物的裂解途径与类黄酮相似C-苷，它们可能是类黄酮C-荷花胚芽中从未发现的糖苷类化合物。峰值1显示为[M−H]⁻在离子m/Z.593年[M−H]⁻和三个片段离子在m/Z.473 [M-H-120]⁻那m/Z.383 [A + 113]⁻那m/Z.353 [A + 83]⁻. 这些片段离子表明苷元是由两个己糖（162）取代的芹菜素（270） + 162). 因此，鉴定为芹菜素6,8-di-C- 葡萄糖苷（ViCenin-2）。峰值2显示了[M-H]⁻在离子m/Z.563和四个碎片离子在m/Z.473[M−H−90]⁻那m/Z.443(120−−H)⁻那m/Z.383 [A + 113]⁻，及m/Z.353 [A + 83]⁻这意味着苷元是芹菜素（270）被己糖（162）和戊糖（132）取代。[M]的相对丰度−H−120]⁻，是高5％比的[M-H-90]⁻。峰2被认定为芹菜素-6-C-glucosyl-8 -C木糖甙(9.那18.]. 如上所述，峰3也给出了两个[M−H]⁻离子at.m/Z.563和m/Z.447.有趣的是，峰值4和峰值5显示[M-H]⁻在离子m/Z.447和m/Z.分别为563。因此，在这三个峰值中存在两对异构体。[m-h]⁻在离子m/Z.563在m/Z.473[M−H−90]⁻那m/Z.443(120−−H)⁻那m/Z.383 [A + 113]⁻，及m/Z.353 [A + 83]⁻，与峰2相同，可鉴定为芹菜素6-C-glucosyl-8 -C- 峰值3和Apigenin-6-中的嗜碱性（Schaftoside）C-arabinosyl-8 -C- 葡萄糖（Isoschaftoside）在峰5中，并通过将其LC-MS与真实标准的LC-MS进行比较（图2d） 。脱质子分子离子m/Z.447产生三个碎片离子在m/Z.357 [M-H-90]⁻那m/Z.327(120−−H)⁻，及m/Z.297 [M-H-150]⁻并且可以试探性地推导出木犀草素或山柰酚的己糖替换。此外，离子的相对强度在m/Z.357 [M-H-90]⁻在峰3是在峰4 [高于22.］．[m-h]⁻在离子m/Z.第3峰和第4峰的447为木犀草素-6-C-葡萄糖苷(异荭草苷)和木犀草素-8C-葡萄糖苷（orientin），分别。第6峰显示[M−H]⁻在离子m/Z.431和这个去质子化分子离子中也出现了峰7.它们的碎片离子在m/Z.341(90−−H)⁻和m/Z.311 [M-H-120]⁻were 16 Da less than those of [M−H]⁻在离子m/Z.447，这表明糖苷配基可以是与芹菜素糖苷的取代。因此，他们可以认定为芹菜素-8-C-葡萄糖苷（牡荆素）或芹菜素-6-C葡糖苷（异牡荆苷）。考虑到离子的相对强度m/Z.341(90−−H)⁻异牡荆素含量较高[22.那23.]、[M−H]⁻在离子m/Z.峰6和峰7中的431个分别被鉴定为牡荆蛋白和异牡荆蛋白。峰值9给出了一个[M−H]⁻在离子m/Z.产生碎片离子在m/Z.487 [M-H-90]⁻那m/Z.457 [M-H-120]⁻那m/Z.383 [A + 113]⁻104或90 [M H−−−)⁻，及m/Z.353 [A + 83]⁻或[M-H-90-134]⁻。片段离子在m/Z.457 [M-H-120]⁻有丰富比碎片离子在更高487 [M-H-90]⁻。山顶9可认定为芹菜素-6-C-glucosyl-8 -C-rhamnoside [9.那22.］．

峰值14-16，用反质子分子离子m/Z.727年,m/Z.727年,m/Z.711，分别，尚未在莲花以往任何的研究发现，它们的碎片离子是如此复杂，他们很难通过现在进行标识。然而，它们的特征碎片离子在[M-H-90]⁻和[M−H−120]⁻在桌子上2建议他们可能是类黄酮C苷。

3.4。总黄酮含量（TFC）和个人黄酮含量

几乎所有的类黄酮的在30％和50％的洗脱份得到富集，并且使用两个30％和50％的乙醇洗脱，以洗涤大孔树脂柱，以实现在HPLC一个更好的分离，从而更好的分析的黄酮类化合物在莲心。莲胚芽的从四个不同的区的色谱示于图3.和4.。The content of flavonoid was expressed as mg/100 g dry weight. Compounds 3, 5, 7, and 8 were quantified by using their corresponding standards, and the contents of the remaining compounds were determined using rutin as an external standard. The structure of peaks 14–16 was unknown for the time being, so the total flavonoid content just included the flavonoids of peaks 1–13. The results showed that lotus plumule from GC had the highest content of total flavonoid with 1595.86 mg/100 g, and the TFCs of the other three were 1553.49 mg/100 g (WY), 1173.07 mg/100 g (XT), and 930.08 mg/100 g (JN). The TFCs of lotus plumule from different districts had obvious differences. Especially, the TFC of lotus plumule from GC was almost double that of lotus plumule from JN. In the previous study, Feng et al. [14] 38个莲花品种的莲花羽毛中的类黄酮类化合物。检测到的所有黄酮类化合物的总和范围为730mg / 100g至1793mg / 100g干重。我们研究中TFC的结果与Feng等人的研究一致。[14］．李等人。[15]九个组织中量化的黄酮类化合物Nelumbo Nucifera盖尔顿。包括莲心。研究中使用的材料是新鲜的，因此不适合与我们的研究结果进行比较。

整体色谱图（数字3.和4.）从四个不同的区莲胚芽的表明，4个品种中检测到莲胚芽的类似组合物。正如在莲幼芽黄酮识别部分所讨论，进行检测，并成功地识别16种黄酮类化合物。16种化合物可以分为5组，即，芹菜素，木犀草素，槲皮素，山奈酚，香叶木素和衍生物。芹菜素衍生物往往是类黄酮C-糖苷类化合物和木犀草素衍生物均可形成黄酮类化合物C糖苷和黄酮类化合物O.- 甘油酯，而另外三组往往是黄酮类化合物O.苷。在图S中的13点的峰的内容物显示在线提供https://doi.org/10.1155/2017/7124354。如可以看出，峰1，2，3，4，5，6，和图9，这是所有的类黄酮C- 甘油酯，占TFC的大量比例。发现黄酮类化合物的含量C-四个不同产地莲心的总黄酮含量相近，GC为80.83%，XT为80.91%，JN为79.25%，WY为78.53%。总的来说，黄酮类化合物的比例C-glycosides黄酮类化合物O.-糖苷在这四个地区保持不变。但4个区域间的tcs和总黄酮含量变化较大。例如，可以从表中看到1和图 那从峰1到峰13，气相色谱中莲心中的单个黄酮类化合物含量高于其他三个区，可用于鉴别其他三个区的莲心。此外，它还可用于筛选未来栽培和应用的最佳品种。

四个代表莲花品种分别来自四个不同的地方收集。这两种不同的环境和品种将导致黄酮含量的变化。一些报告记录了环境因素对黄酮含量的影响。梁等人。[8.[中国五个地区，研究了来自四个葡萄品种的黄酮化合物。结果表明，相对黄酮量可能取决于品种特征，但对它们生长的环境因素的影响更大。Daniels等人。[11的研究结果表明，黄酮类化合物在各部位的含量gethylllis multifolia当该植物进行光应激处理时减少，而当受干旱胁迫时，多酚和黄酮的含量增加，抗氧化活性也显着升高。赵等人。[24.]报道了NaCl胁迫下红花叶片总黄酮含量较对照组增加。Wang等[25.]研究了银杏叶总黄酮的生物合成温度和土壤湿度的影响。据报道，类黄酮合成在较低的温度和较低的土壤墒情有利。在丰等人的研究。[14]，38个荷花品种有来自同一个地方，结果显示的黄酮含量很大的差别。事实上，在自然环境中生长的植物是由许多综合因素的影响，这可能被用来从四个区莲花解释幼芽之间的黄酮含量差异的影响。在此，我们得出结论，GC是在综合环境要素方面的高黄酮含量莲心最好的地方。而类黄酮的比例相似C-glycosides黄酮类化合物O.从所有四个地区的样本中-glycosides可能是由于他们的共通的背景。无论如何，这项研究揭示了首次从不同品种或正在调查不同地区莲花胚芽只在个别黄酮的含量不同，而不是在个别种类黄酮。

4。结论

采用大孔吸附树脂色谱- LC-UV/LC-MS相结合的方法，测定并比较了来自4个不同地区的4个具有代表性的莲子胚芽中16种黄酮类化合物的含量。我们的结果表明，研究的莲子胚芽具有相似的黄酮类化合物分布和相似的黄酮类化合物百分比C苷。但由于环境因素的影响，各组分黄酮类化合物的含量差异较大，其中气相色谱莲花胚芽中黄酮类化合物含量最高。在一定程度上，可以推断气相色谱环境在莲花胚芽中类黄酮的合成和积累方面比其他三个区域有优势。该方法可为莲子片的质量控制和黄酮类化合物含量的筛选提供科学依据。由于天然的黄酮类化合物被认为对人体健康有益，这些莲子在食品和制药行业具有很高的潜力。

披露

该资助者在研究设计，数据收集和分析，并决定出版手稿中扮演任何角色。

利益冲突

作者宣称，有兴趣对此文件发表任何冲突。

致谢

这项工作是由中国的自然科学基金项目（批准号51428303），“一个百人计划”从中国院士（批准号。29Y429291a0129），以及中非联合研究项目（批准号支持。SAJC20160233）。

补充材料

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