Photo-Induced细胞损伤分析单和Multifocus连贯Anti-Stokes喇曼散射显微镜

文摘

在这项研究中,我们调查了photo-induced损坏活细胞单-和相干anti-Stokes multifocus激拉曼散射(汽车)成像。一个近红外脉冲激光(709海里)被用来诱导细胞损伤。我们比较了photo-induced单一细胞损伤,multifocus励磁方案的条件下获得同样的车信号在相同的帧速率。细胞生存能力评估,我们雇佣了4 ,6-diamidino-2-phenylindole DAPI荧光团,以彩色为主受损的细胞。双光子荧光- DAPI荧光团,分别兴奋的紫外光源和相同的近红外光源和监控评估在近红外脉冲激光辐照细胞生存能力。我们发现低吸收的DAPI荧光团到海拉细胞在multifocus激发较单一的集中激励计划——和双光子荧光检查。这表明减少photo-induced multifocus激发细胞损伤。我们的研究结果表明,multifocus励磁方案预计将适合汽车显微镜的侵袭性最小。

1。介绍

相干anti-Stokes喇曼散射(汽车)显微镜和其他相干喇曼散射显微镜现在有前途的技术,三维可视化分子物种和生物样品结构没有染色(1- - - - - -7]。汽车显微镜一般采用两个高度同步微微秒锁模激光诱导相干分子振动通过调整这些激发激光的频率不同(ω₁和ω₂)分子振动(Ω=ω₁−ω₂)。汽车信号anti-Stokes频率区域(ω_作为= 2ω₁−ω₂)通过生成一个连贯的交互的一个激发光(ω₁)和连贯的分子振动。自从汽车过程给出了一个强烈的信号与自发拉曼散射过程相比,汽车实时成像显微镜已经申请在体外和在薇芙o (8- - - - - -10]。

汽车显微镜的成像速度的进一步提高,激发激光功率的最大化是一个关键问题。然而,photo-induced损伤限制了应用激光功率为无创实时成像显微镜的汽车。在汽车显微镜采用近红外脉冲激光,photo-induced损害是由于多光子诱导居多的现象,如多光子吸收、氧化压力,和自由基生成(11- - - - - -14]。多光子的概率事件增加非线性激发脉冲激光器的峰值强度成正比。峰值强度的调节是必不可少的非侵入式汽车显微镜。

为了避免photo-induced损害,我们最近开发出一种multifocus激发汽车显微镜(9,15,16]。multifocus励磁方法上形成多个焦斑样本通过微透镜阵列,和汽车信号生成的焦斑同时观察二维图像传感器。汽车的总强度信号(我_汽车)multifocus励磁方案表示如下: 在哪里χ⁽³⁾,我₁,我₂,τ,N三阶非线性磁化率,强度激发激光光学频率的操作吗ω₁和ω₂住时间和焦斑点的数量,分别。根据(1),预计multifocus激励方法有很大的优势,延长图像曝光时间比例成像焦斑点并实现高速汽车数量的增加激发每个焦斑的激光功率。增加的焦斑的功效,和多光子显微镜已经被几位研究人员讨论9,17- - - - - -23];然而,photo-induced细胞损伤的汽车显微镜multifocus激励计划,雇佣了近红外脉冲激光没有任何染料,尚未证明除了我们的前期工作24]。

在目前的研究中,我们试图探讨photo-induced损害在活细胞单和汽车multifocus励磁的成像。评估在激光辐照photo-induced损失,我们利用4 ,6-diamidino-2-phenylindole DAPI荧光团。细胞内的积累DAPI荧光团取决于监管国家跨细胞膜的分子运输;即荧光团几乎穿透细胞膜的重要细胞,虽然很容易穿透死亡和/或受损的细胞。自从DAPI荧光团具体绑定到adenine-thymine地区细胞核的DNA链,导致荧光强度的增加,DAPI荧光可以作为一个有效的指标测定细胞的可行性。根据这样的优势DAPI荧光团,我们观察到荧光DAPI-stained细胞检查photo-induced损伤的发展,可能是由于近红外激光的照射汽车显微镜。

2。材料和方法

2.1。Photo-Induced细胞损伤分析

通过使用4 Photo-induced损伤细胞的估计 ,6-diamidino-2-phenylindole DAPI荧光团。的DAPI荧光团显示微弱信号在水溶液中表现出强烈的荧光在绑定到双链DNA在细胞的细胞核。以来的分子运输DAPI荧光团在至关重要的细胞,细胞膜被吸收的抑制和排泄是增强的,至关重要的细胞困难沾DAPI荧光团。因此,至关重要的细胞的细胞吸收的监管有利于减少dye-dependent的起始细胞损伤甚至当细胞都沉浸在染料溶液。当photo-induced细胞损伤发生时,分子运输DAPI荧光团增强是由于膜的减少(图功能1)。因此,通过观察的DAPI荧光团的荧光强度,我们可以评估细胞的可行性。

2.2。光学设置

光学设置photo-induced评估细胞损伤图所示2。一微微秒锁模钛蓝宝石激光器(中心波长709 nm, 5 ps的脉冲持续时间,和80 MHz的重复率;海啸,Spectra-Physics)被用作激光源细胞损伤诱导。单一的集中的激发,我们使用nonresonant / galvano共振说镜子对扫描仪(128行,125帧/ s)扫描焦斑。multifocus激励,我们使用微透镜阵列扫描(128行,1000 fps)。激光光束的光程单和multifocus荷载导致光学显微镜(Ti-U,尼康)和被照射到样本通过一个物镜(0.85 x40, NA,萤石,尼康)。单一的激光——或者multifocus激发导致样本转换通过改变光学显微镜镜取向。

根据(1条件),获得同样的车信号单一,multifocus励磁的表达如下: 在哪里我_年代,我_米,N是单一的激励激光功率和multifocus励磁和multifocus激发震源点的数量,分别。的数量后缀我_年代和我_米表明这两个激光显微镜来源通常用于汽车。在这项研究中,我们假设这两个激光源是相同的激光源的强度我_前女友。

的DAPI荧光团的荧光波长460 nm 50 nm带宽观察EM-CCD相机(Luca和或)。的一个光子荧光信号的检测通常是分析了传统荧光测定术,Hg的365纳米线灯是另外准备作为激发光源。避免双光子荧光贡献兴奋的细胞损伤诱导激光源,我们按顺序执行的辐照细胞损伤诱导激光和荧光观察。双光子荧光检测,双光子荧光观察和损伤诱导细胞上同时执行使用相同的激光源。

澄清的环境效应细胞损伤的激光照射,我们也观察到的单光子和双光子荧光DAPI荧光团在海拉细胞控制条件。在评价一个光子荧光,我们没有感应激光照射细胞损害。在双光子荧光的评价,我们采用单一的集中激励计划激励激光功率较低的3.7兆瓦。样品阶段的温度保持在37°C提供可靠的试验。

2.3。样品制备

海拉细胞被用于photo-induced损伤评估。细胞培养在杜尔贝科修改鹰的介质为10% (v / v)胎牛血清和1% (v / v)抗生素/抗真菌的解决方案。photo-induced损伤评估,海拉细胞被孵化玻璃底菜在37°C公司5%₂24 h,然后代替培养基pH-indicator-less修改Tyrde的解决方案(1毫米葡萄糖,氯化钠145毫米,1毫米MgCl₂h·6₂啊,4毫米氯化钾,CaCl 10毫米玫瑰,1毫米₂,pH值7.4)维持在37°C用橡胶加热避免光吸收和不利的自体荧光酸碱指示剂。固定的海拉细胞的观察,我们用4%多聚甲醛固定在蒸馏水稀释的海拉细胞。

DAPI荧光团(Sigma-Aldrich激发max。:358海里,发射马克斯。:12.3毫米461海里)准备染料溶液作为一个股票。染料溶液是掉进Tyrode的解决方案所需的浓度测量之前。染料的最终浓度为71.5μm Tyrode的解决方案。

3所示。结果

首先,我们评估了photo-induced细胞损伤与双光子荧光方案。评估photo-induced DAPI荧光的细胞损伤,我们定义了一个规范化的双光子荧光值年代_{伤害,锥度英尺}如下: 在哪里我_锥度英尺,N,我_前女友是双光子荧光信号观察图像传感器,焦斑点的数量和激发激光功率,分别。图3显示年代_{伤害,锥度英尺}的荧光珠计算值(3)。每个点的激发激光功率为27.8兆瓦,单一的集中,激发和14.5 mW 7焦斑点multifocus激发获得同样的车信号中描述的材料和方法。我们获得了等效年代_{伤害,锥度英尺}值无显著差异,而在单和multifocus励磁方案,指示年代_{伤害,锥度英尺}评估值是可用photo-induced细胞损伤。

时间的行为规范化的双光子荧光值年代_{伤害,锥度英尺}在激光照射到个人海拉细胞被显示在图4。激光辐照的混合DAPI荧光团的培养基进行0分钟。双光子荧光图像观察到持续的平均时间32女士/框架。的时间行为的扩散DAPI荧光团与一个固定的海拉细胞细胞核测量如图4(a), DAPI荧光团也分散在几分钟内展示的DAPI荧光在固定的海拉细胞的细胞核。

早期的激光辐照在几分钟内,颞行为规范化的双光子荧光值年代_{伤害,锥度英尺}相似的单,由于监管multifocus激发态DAPI分子的膜运输的海拉细胞(图4(a))。在单一的集中,激发,几乎一半的归一化双光子荧光值的海拉细胞显著增加5到10分钟后的激光辐照的价格相比multifocus激发。这可能暗示的膜功能的分子运输监管海拉细胞被抑制由于强烈的激光辐照。相比之下,multifocus励磁,大部分的海拉细胞表现出较低的归一化双光子荧光值,是类似于控制条件的行为,表明膜功能的分子运输监管海拉细胞即使激光照射工作。这些行为的归一化双光子荧光值的单一——显然multifocus激发态可视化photo-induced细胞损伤发展的差异,而没有明显的白光(数据传输图像4(b)和4(c))。这些结果表明,单一的集中,激发引起更大的破坏与multifocus激励相比,和损失可能促进DAPI分子进入细胞的吸收和/或抑制的排泄DAPI分子没有任何形态的变化。

我们也进行统计评价的时间进程photo-induced细胞损伤,如图5。我们检查的时间行为规范化的双光子荧光值年代_{伤害,锥度英尺}12为单一的集中,激发细胞,8细胞multifocus励磁和4细胞的控制条件。平均归一化双光子荧光值年代_{伤害,锥度英尺}单一——multifocus励磁和控制条件如图5(一个)。的平均归一化双光子荧光值单一的集中在20分钟达到激发multifocus励磁的3.0倍。这种差异可能表示不同程度的photo-induced细胞损伤之间的单一——multifocus励磁。标准差的单一的集中激励也取决于激光辐照时间增加,表明photo-induced细胞损伤的程度相对不同的细胞中。

使用学生的统计分析t以及也执行。比较单一的集中,激发和控制条件(图5 (b)),学生的的价值t以及开始下降约8分钟后开始的激光辐照。最终,我们获得了显著差异( )在16.4分钟后开始的激光辐照。相比之下,比较multifocus激发和控制条件(图5 (c)),显著差异并不是获得激光辐照后20分钟内开始。之间的比较单一,multifocus励磁(图5 (d)),学生的的价值t以及开始下降在5分钟左右,和显著差异( )是获得17.2分钟启动激光辐照后,这是几乎相同的结果之间的比较单一的集中,激发和控制条件。这些结果表明,multifocus激发明显减少photo-induced细胞损伤较单一的集中,激发条件下获得同样的车信号。

我们也确认的时间行为photo-induced细胞损伤与一个光子荧光方案。一个光子荧光方案采用的紫外光源的观察一个光子的DAPI荧光团的荧光,而皮秒脉冲激光与单或multifocus激励计划用作激光源细胞损伤诱导。高信噪比的观察DAPI荧光团预计将在一个光子荧光计划通过一个光子由于励磁效率高的过程。一个光子DAPI荧光观察和近红外光照射单或multifocus励磁方案按顺序进行。一个光子荧光观察每2分钟的曝光时间1 s,而单一的近红外光照射——或multifocus激励方案执行。我们标准化的一个光子荧光强度DAPI如下: 在哪里年代_{伤害,消息},我_消息,我_前女友是归一化一个光子荧光信号photo-induced细胞损伤分析,观察到的一个光子荧光信号与图像传感器和激发激光功率,分别。自光设置一个光子荧光obseritations和控制条件,一个光子荧光观察的效果的评价photo-induced细胞损伤在这些条件相同。

规范化一个光子荧光值年代_{伤害,消息}单一,multifocus作用,以及控制条件如图6。像类似于双光子荧光的结果评估photo-induced细胞损伤,归一化一个光子荧光值年代_{伤害,消息}的单一的集中激励显著增加而不是multifocus励磁(数字6(一)和6 (b))。然而,在辐照激光功率的条件27.8 mW的单一的集中,激发和14.5 mW 7 multifocus激发震源点,相同条件的数据4和5,归一化一个光子荧光值增加的相对速度比那些评估双光子荧光计划(图6 (c))。这可能是由于额外的紫外线照射的影响,这是执行一个光子荧光的激发DAPI荧光团。这种影响显然是控制条件(图中观察到6 (c)),近红外照射不执行。此外,大约在25分钟后启动近红外激光照射,规范化的一个光子荧光值单一的集中激励开始下降。这可能是因为光漂白的DAPI荧光团在海拉细胞的细胞核。虽然这些不利的影响由于紫外线照射,降低photo-induced细胞损伤在multifocus激发比在单一的集中与一个光子荧光激发也证明了方案的观察时间行为规范化的一个光子荧光值。

我们也比较低,高的激光功率辐照条件单一,multifocus激发。高的激光功率条件下,每个点的辐照激光功率我_前女友)被设定为27.8 mW和单一——14.5 mW multifocus焦斑点(7)作用,分别。相比之下,每个点的辐照激光功率我_前女友),分别设置为13.3兆瓦,7.0兆瓦单和multifocus(7焦斑点)励磁的激光功率较低的情况。高的激光功率辐照条件下,我们获得了显著差异( )在2.0分钟,9.6分钟,5.9分钟后开始激光辐照的比较单一的集中,激发和控制条件,multifocus激发和控制条件,和单一——multifocus作用,分别。同时,显著差异并没有获得较低的激光功率辐照条件后40分钟内开始激光辐照即使相同的总能量的激光辐照高激光功率辐照条件达成了有两次曝光时间的较低的激光功率辐照条件。这个结果表明multifocus激励方案是更有效的减少photo-induced损伤随着激光辐照功率变得更高。

4所示。讨论

我们最近的研究提出了高速汽车multifocus激励方案显微镜分子成像(9]。这里,我们证实的疗效multifocus激发汽车显微镜的细胞生存能力利用DAPI荧光团。我们发现一个较低的吸收DAPI荧光团到海拉细胞在multifocus激发与单一的集中激励方案相比,表明减少photo-induced multifocus激发细胞损伤。我们的研究结果表明,multifocus励磁方案预计将适合高速汽车显微镜的侵袭性最小。

multifocus激励方案已经应用于一个——和多光子显微镜(9,17- - - - - -23]。特别是在荧光显微镜,photo-induced损害已经研究的很透彻了。荧光显微镜,photo-induced通过荧光染料引起的细胞损伤主要是由于热应力,氧化压力、自由基生成,等等。相比之下,由于近红外微微秒脉冲激光器工作,不需要染色,显微镜photo-induced细胞损伤的汽车通过光吸收主要是由于细胞本身。因此,multifocus汽车显微镜photo-induced损伤的机制可能不同于multifocus荧光显微镜。

photo-induced损坏的汽车通过多光子显微镜可能造成过程而不是通过一个光子过程,因为低吸收一个光子在近红外区域的细胞。多光子过程可能诱发热应力、氧化压力、自由基生成,等等。例如,DNA的photo-induced作品如嘧啶二聚体和嘧啶pyrimidone photoproducts可以通过紫外线的吸收了在DNA C = C双键对应的three-photon吸收近红外光(25- - - - - -28]。活性氧如单线态氧(¹O₂)可以产生的能量传递兴奋生色团的细胞,如黄素和卟啉,通过两个或three-photon近红外光的吸收氧气分子附近的生色团(29日- - - - - -31日]。活性氧容易与周围分子反应,导致蛋白质的氧化损伤,dna和脂质。多光子的概率事件增加非线性激发激光的峰值功率成正比,表明激发激光的峰值功率据说photo-induced细胞损伤中起着重要的作用在汽车显微镜而不是激发激光的平均功率。我们的结果显示,multifocus励磁方案显著降低photo-induced损害由于焦斑的平行排列,而不是焦激光功率的增加获得足够的车辆信号。

5。结论

在目前的研究中,我们调查了photo-induced损害在活细胞单——汽车multifocus励磁的显微镜。利用DAPI荧光团,我们揭示了利用multifocus励磁方案的细胞生存能力。虽然依赖等进一步的研究样本的物种,脉冲持续时间,和焦斑点的数量需要大量样本的详细描述photo-induced损伤multifocus励磁方案,我们的研究结果表明,汽车显微镜与multifocus激励计划将成为一个重要的解决方案高速分子成像,同时尽量减少photo-induced损害。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢n . Takeichi女士和女士刘易斯,德岛大学英语校对的手稿。这项工作是支持的部分从教育部科学研究补助金,文化,体育,科学和技术(下边了)和系统的发展和技术先进的测量和分析(SENTAN)计划从日本科学技术振兴机构(JST)。报告的作者之一(Takeo Minamikawa)承认支持jsp补助金的家伙从日本促进社会科学(jsp)。

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